Name: שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: למדו שיטה יעילה ליצירת טורי חתכים אולטרה-דקים של מיקרואורגניזמים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ללא ציוד יקר. טכניקה זו מספקת מידע תלת-ממדי מפורט על מבנה התא השלם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים שיגאו קיטה עבור הצעות ערך ודיון שלו. אנו מודים גם Sumire אקשטיין וג'ון שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הערה: דגימות השתמשו במחקר זה היו מיקרואורגניזמים, במהירות קפוא עם גז חנקן נוזלי, להקפיא שהוחלפו ב אצטון המכיל 2% אוסמיום ארבע-חמצני, ומוטבעים אפוקסי שרף1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. הכנת הסרט תמיכה (איור 1-3)
הערה: Formvar בצבע כסף תמיכה הסרט מוכן באמצעות שיטת יצוקה על-זכוכית19.
<ol><li>להוסיף 100 מ של 1.5% Formvar של-אתילן dichloride אל מנגנון יצירת Formvar (איור 1). טובלים חצי אחד של שקופית מזכוכית (76 מ מ x 26 מ"מ x 1.3 מ"מ) בתמיסה Formvar בעמודה העליון של המנגנון על ידי לחיצה על הפתרון עם האוויר דרך 'a' באמצעות כדור גומי19.<ol>
<li>סוחטים את הפתרון מן העמודה על-ידי פתיחה של צימוד-כיוונית של שחרור האוויר דרך 'b' כדי להפחית את הלחץ. להוציא את השקופית זכוכית מן המנגנון ויבש באוויר כדי ליצור סרט על פני השטח של השקופית זכוכית. השתמש מנורת להט להאיץ הייבוש של הסרט Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מגרדים ארבעת הקצוות של הסרט בשקופית זכוכית עם סכין גילוח (איור 2 א), ונשימה אותן לשקופית כדי להקל על ההפרדה של הסרט שקופית20, ימחאו הסרט על המים במועט השקופית זכוכית לתוך מים לאט בזווית אופקית נמוכה (בערך 10°, איור 2b).</li>
	<li>תגרדו את הסרט Formvar מן המים באמצעות ארון תקשורת של אלומיניום (30 מ מ x 25 מ"מ x 3 מ"מ) עם חורים (4 מ מ קוטר) (איור 3 א). שמור על האצטבה עם הסרט Formvar desiccator עד לשימוש (איור 3b).</li>
</ol>2. קיצוץ הרחוב דגימה של להב חיתוך אולטראסוניות, גילוח 21 תחת stereomicroscope (איור 4)
<ol><li>ודא כי ישנם תאים על פני השטח של גוש על ידי התבוננות קצה הרחוב עם מיקרוסקופ אור (איור 4a).</li>
	<li>הר הרחוב דגימה ב הצ'אק (בלוק מחזיק), והר הצ'אק על הבמה זמירה21 (איור 4b). בשלב זה זמירה יש מנגנון תאורה מהחלק האחורי של הדגימה.</li>
	<li>חתוך שאבן בגודל של 0.7 מ"מ x 1.0 מ"מ (איורים 4 c, 5d). מאז שרף אפוקסי הוא מאוד קשה, לקצץ את אבני הראשון באמצעות להב חיתוך אולטרה סאונד. להב חיתוך אולטראסוניות מכונה הציג לאחרונה, הבלוקים, נסגרים בקלות. אז לקצץ את גוש נוסף עם סכין גילוח. חותכים כתף אחת כדי לסמן את הכיוון של חיתוך (ראה איור 5 d, איור 8).</li>
</ol>3. זמירה את הרחוב דגימה בסכין יהלום באמצעות את האזמל הקטן (איור 5)
<ol><li>להגדיר הרחוב דגימה צ'אק הדגימה האוחז ultramicrotome. מקם את הדגימה ב- 90° נגד כיוון השעון בניגוד לעמדת בפועל בעת חלוקתה זגוגית טורי שבוצעה (ראה איור 5 d).</li>
	<li>חותכים את השטח של גוש עם סכין חיתוך יהלום (ראה איור 5-d). להגדיר את קצה סכין יהלום מקביל פני בלוק הדגימה, לחתוך את הכמות המינימלית של משטח הדגימה כדי לא לאבד את כל הדגימה (איור 5 d). הערה: שלב זה נעשית להחליק פני השטח הדגימה. חלק משטח הדגימה של החלק הדק הוא נותר ללא פגע (לכן החלק הזה לא זורחת כמו מראה, איור 5 d), כדי לא לאבד חלק כלשהו של הדגימה על חלוקתה טורי. הסיבה לכך היא הדגימה נחשף על פני הרחוב.</li>
	<li>להציב מראה (Mesa קאט, ז) על הבמה את הסכין כדי לנטר את חיתוך הרחוב דגימה (איור 5 c).</li>
	<li>חותכים את הקצה השמאלי (זה הופך סייד, איור 5 d, המדגם ב טורי חלוקתה) של גוש באמצעות סכין חיתוך על ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות שמאלה (איור 5a).</li>
	<li>חתכו את הפנים בלוק-כ-100 מיקרומטר מהקצה השמאלי של הדגימה (זה הופך בצד התחתון של הדגימה ב טורי חלוקתה, איור 5 d) על-ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות ימינה (איור 5b). הערה: הסעיפים טורי יהיה לחתוך חלק רזה של הדגימה כ- 90 ננומטר x בערך בגודל 1 מ מ בלבד. החלק הגדול ישמש כדי להתאים את השטח הדגימה ואת קצה הסכין כך הם מקבילים. לאחר התאמת השטח הדגימה כדי להיות מקביל עד קצה הסכין, החלק גדול יוסרו עם סכין גילוח. על ידי גזירה את הצדדים העליון והתחתון של הדגימה באמצעות את האזמל הקטן, בשני הצדדים של הדגימה הופך בדיוק מקבילים זה לזה (איור 5 d), וחלקה אשר הכרחי לקבל את הכלים ישר ואינו רצופה מקטעים.</li>
</ol>4. התאמת לקצה משטח והסכין הדגימה כך שהם פונים במקביל אחד לשני 21
<ol><li>להסיר את הסכין זמירה, וסובב את הרחוב דגימה 90° בכיוון השעון.</li>
	<li>הגדר את הסכין אופטים זגוגית של השלב הסכין.</li>
	<li>התאם משטח הדגימה לבין קצה הסכין כך שהם פונים במקביל זו לזו באמצעות חלק גדול משטח הדגימה. הערה: חלק גדול הדגימה משמש עבור התאמה כי הפנים חיתוך של טורי חלוקתה כל כך קטנה, ומקשה על התאם משטח הדגימה קצה הסכין באמצעות החלק הזה בלבד, בעיקר בכיוון אנכי. לכן, באמצעות החלק הגדול של הדגימה הופך התאמה קלה.</li>
</ol>5. מריחה אטומה פתרון על הרחוב דגימה (איור 6)
<ol><li>כדי למקם את צ'אק הדגימה-בדיוק באותה העמדה המיקום המקורי, להחיל את הקלטת של הצ'אק, צ'אק האוחז האזמל הקטן ושרטתי הגבול (איור 6a).</li>
	<li>סעו הדגימה צ'אק האזמל הקטן, מניחים אותה מתחת stereomicroscope (איור 6b). לחתוך את החלק הגדול של הדגימה עם סכין גילוח, עוזב את החלק הדק, שממנו ניתן להשיג חלקים טורי.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של פסטר, ירידה בערך µL 0.5% אטומה פתרון (איור 6b) על גבי הדגימה שישמש עבור חלוקתה טורי, לעשות הדבק הצדדים בסעיף. מכסים את הדגימה כל פתרון אטומה. לספוג עודפי אטומה פתרון מיד עם חתיכת נייר סינון ממוקם בסמוך הדגימה. מקבל סרט סעיפים חיוני עבור צילום תמונות סעיפים תא טורי, אטומה דבק הוא מאוד שימושי עבור מנתחות את הסעיפים.</li>
	<li>להכין 3 םיקדסה רשתות (בגדלים של חריצים: באמצע, 0.4 מ מ x 2.2 מ מ, שני הצדדים 0.2 מ"מ x 2.2 מ"מ) (איור 6 c) עבור אוסף קטעים סדרתי על ידי כיפוף בידית של הרשתות עד 60 ° צלזיוס, בטיפול הרשתות עם 0.5% אטומה פתרון, ולהפוך את הרשתות הידרופילית על ידי זוהר פריקה22.</li>
</ol>6. ביצוע סעיפים טורי (איור 7-9)
<ol><li>המקום הרחוב דגימה צ'אק פנימה את האזמל הקטן במיקום זהה כמו 5.1 (איור 6a) על ידי יישור החלקים מוקלט. פעולה זו שומרת את פני בלוק לבין קצה הסכין מקבילים זה לזה באופן מושלם. ואז להביא את הסכין קרוב הדגימה.</li>
	<li>למלא את הסירה את הסכין במים.</li>
	<li>מכסים את האזמל הקטן עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר (איור 7). הערה: זרימת אוויר במהלך חלוקתה ודק במיוחד, שליפת מקטעים לעיתים קרובות לגרום לבעיות. מכסה פלסטיק יש שלושה חורים: חור אחד הוא עבור עדשות המשקפת, שני החורים אחרים נועדו הזרועות לאפשר פעולה בעוד השער נמצא על. משענת עץ משמשת להנחה הידיים בזמן ביצוע עבודה עדינה, כגון אחזור מקטעים טורית בעזרת רשתות. משענת עץ מושם על שולחנות שונים מן השולחן מיקרוטום (איור 7, חצים), כדי לא לשדר את הרטט של הידיים של המפעיל האזמל הקטן.</li>
	<li>לחתוך את הדגימה-עובי סעיף 200 ננומטר (איור 8). הגדרה-200 ננומטר בעובי יחסוך זמן להביא את הסכין אל פני השטח של הדגימה.</li>
	<li>לאחר החלק הראשון הוא נחתך, להגדיר את עובי סעיף ל-70 ננומטר (איור 8).</li>
	<li>כאשר מספר קטעים סדרתי מגיע ל- 20 (בדיוק מדברים, לאחר מגיע סרט כ 1.8 מ"מ; מספר קטעים משתנה בהתאם לרוחב של סעיפים), להגדיר את עובי סעיף 10 ננומטר (איור 8) תוך לחתוך. הערה: מאז האזמל הקטן לא יכול לחתוך קטעים ננומטר בעובי 10, אין סעיף חדש שמופיע ולאחר הסעיפים בעבר לחתוך המופרדות קצה הסכין. חשוב לקבל קבוצות מקטעים נפרדים (איור 9) עבור אוסף טורי מקטעים למנוע קושי הפרדת המקטעים באופן ידני באמצעות זוג קווצות שיער. כיוון התצוגה של השדה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא 2.0 מ מ, החתכים צריכים להיות באורך 1.8 מ מ לכל היותר.</li>
	<li>להגדיר את עובי סעיף 60 ננומטר (איור 8). זה יהיה לייצר nm 70 חלקים (איור 8) כי המכונה יוסיף את עובי nm 10 הקודם.</li>
	<li>להגדיר את עובי סעיף חזרה ל-70 ננומטר (איור 8) ולהמשיך חיתוך עד 1.8-מ מארוך מקטעים מתקבלים.</li>
	<li>חזור על 6.6-6.8 עד לחמישה מדורים ארוך מ מ 1.8 מתקבלים (איור 9). אנו מבצעים בדרך כלל חמש קבוצות מקטעים מאז יש חמש מחזיקי הדגימה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים זמינים במעבדה שלנו, אבל חמש דקות הם לא הגבול.</li>
</ol>7. אוסף טורי מקטעים (איור 10-12)
<ol><li>במקום 'סעיף החזקת loop'23 (בקוטר הפנימי של הלולאה: 5.0 מ"מ) (איור 10a) על קבוצת המקטע השלישי (איור 10 ב'). הערה: זה הכרחי לאחזר את הסעיפים לפי סדר שלהם חלוקתה כדי לצלם תמונות בסדר הנכון. עם זאת, מאז יש חמש קבוצות מקטעים על הסירה את הסכין, זה לעתים קרובות מקבל מבלבל אילו קבוצות הם אשר. על ידי הנחת את הלולאה על הקבוצה השלישית, מתברר כי שתי הקבוצות ליד המפעיל הן הראשון, השני, ושני מרוחק מהמרכזן הן הקבוצות הרביעית והחמישית (איור 10 ב'). פעולה זו תמנע ערבוב את ההזמנה.</li>
	<li>במקום 'הרמת-מים-פני לולאה'23 (WSRL, הקוטר הפנימי של הלולאה: 4.0 מ"מ) (איור 11 א) על הבמה הסכין (איור 11b). WSRL לעמוד ביציבות על הבמה סכין כי הוא מצויד מגנט בתחתית.<ol>
<li>במקום הלולאה של WSRL ממש מעל הסעיפים טורי על-ידי הזזת מוט וידית שלה. להוריד את הלולאה של WSRL על גבי משטח מים כך הלולאה מקיף הסעיפים.</li>
		<li>לדחוף את הלולאה למטה על-ידי סיבוב הבורג כלפי מטה כך פני המים יעלה על ידי מתח (דמויות 11c-d). להעביר את המקטע למרכז הלולאה, למקם אותו על השיא של המים, ולהתאים את הכיוון של המקטע באמצעות קווצת שיער21.</li>
		<li>לאסוף קבוצות מקטעים על ידי נגיעה בו עם חשוף חריץ-רשת, אשר מוחזק על ידי פינצטה, המשיך מקביל פני המים (איור 11 d). חשוב עבור מקטעים הרשת נוגעת, לא המים, למקם קטעים בדיוק מרכז הרשת (איור 11 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את הרשתות עם מקטעים יחד עם טיפה קטנה של מים על ה Formvar תמיכה הסרט16 (איור 12), ולהסיר עודפי מים באמצעות נייר סינון. הערה: התקמטות של הסרט התמיכה הוא לעיתים קרובות בעיה כאשר מקטעים לאסוף באמצעות רשת תמיכה הסרט כי הממברנה (סעיפים) נוגע ישירות ממברנה (סרט, תמיכה). הבעיה של מקבל קמטים על הסרט תמיכה פוחת באופן משמעותי על-ידי הצבת רשת סעיף מניבי יחד עם טיפת מים זעירים הסרט תמיכה Formvar16.</li>
</ol>8. צביעת סעיפים16,24 (איור 13)
<ol><li>לאחר הסעיפים הם יבשים לחלוטין, לקרוע את הסרט Formvar מ סביב הרשתות, ולהסיר את רשתות הנושאת את המקטעים.</li>
	<li>להגדיר את הרשתות לקצב של ה צינור מכתימים16 בסדר הנכון (איור 13), כתם מקטעים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט24. הערה: יש חריץ עמוק 0.6 מ"מ לאורך הציר הארוך של הצינור לחתוך עם סכין גילוח. הצינור שימושית למניעת שבירה מקרית של סרטים תמיכה כאשר באמצעות פינצטה, שכן טיפול ישיר של רשתות אין צורך במהלך ה מכתימים והניקיונות תהליך16.</li>
</ol>9. תצפית סעיפים טורי (איור 14)
<ol><li>הגדר את רשתות 5 ב בעל הדגימה מרובות בסדר הנכון (איור 14 א'), המכוונת לציר הארוך של הסדק רשת בניצב לציר מחזיק הדגימה. הידיות (חץ) הרשתות לא צריך לחתוך, כי "הרשת-מקובל" לא תיגע האחיזה.</li>
	<li>לתקן את הרשתות עם 'רשת-מקובל' (איור 14 ב) והכנס את מחזיק הדגימה לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני שידור. הערה: לעתים קרובות שימושי לקחת תמונות הגדלה נמוכה של תא כל המקטעים (איור 15) למצוא מעניין מיקרואורגניזמים או תאים במצב טוב ללא זיהום, עם קיבוע טוב, לפני לקיחת תמונות של תא היעד.</li>
	<li>לצלם תמונות של תאי היעד בכל המדורים תא בהגדלה.</li>
</ol>

<ol><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis%3A+an+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis%3A+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17883841">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li>
<li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans%3A+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li>
<li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li>
<li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4309607/">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109(2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryote+or+eukaryote%3F+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cytologia/78/4/78_333/_article">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://protistology.jp/journal/jjp47/JJP47YAMAGUCHI.pdf">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/myco/65/2/65_81/_article/-char/ja/">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li>
<li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast%2C+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. <a target="_blank" href="http://microscopy.or.jp/english/">Guide Book for Electron Microscopy</a>. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).</li>
<li>Hayat, M. A. Support films. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19822298860">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application</a>. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216(2000).</li>
<li>Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. <a target="_blank" href="http://microscopy.or.jp/english/">Guide Book for Electron Microscopy</a>. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+hydrophilicity%2Fhydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+%28Super+support+film%29+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li>
<li>Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/plmorphol1989/17/1/17_1_57/_article/-char/ja/">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li>
<li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://homes.mpimf-heidelberg.mpg.de/~mhelmsta/pdf/2006%20Hayworth%20Kasthuri%20Schalek%20Lichtman%20MicroscMicroanal.pdf">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).</li>
<li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת כאן דורש אין ציוד יקר. זה דורש רק על מתלה אלומיניום (איור 3), םיקדסה שלוש רשתות (איור 6 ג), סעיף החזקת לולאות (איור 10a), לולאה הרמת-מים-פני השטח (איור 11 א) וצינור מכתימים (איור 13). ישנן תכונות רבות של השיטה הנוכחית. החלק הגדול של הדגימה משמש להתאמת לקצה משטח והסכין הדגימה, כך שהם פונים במקביל זו לזו. טורי קטעים נחתכים בקבוצות כדי להימנע קושי הפרדת המקטעים בא...

טורי זגוגית אופטים הטכניקה הנכונה הוא חיוני ללמוד תאים ומרכיבים תא three-dimensionally ברמה המיקרוסקופית אלקטרון. יש ללמוד את הדינמיקה של גוף קוטב פלך במחזור התא של תאי שמרים, ואנו חשף שינויים מורפולוגיים של ultrastructure שלהם במהלך מחזור התא ואת הזמן של שכפול1,2,3, 4,5. בשנת 2006, אנחנו נטבע מילה חדשה 'structome' על-ידי שילוב 'מבנה', '-הביתה ', והוא הגדיר זאת כ 6,'כמותית ותלת ממדית מבניים מידע של כל תא ברמה המיקרוסקופית אלקטרון'7.
על ידי ניתוח structome, אשר דורשת טכניקה אופטים זגוגית טורי, התברר שיש תא שמרים של האפייה , Exophiala dermatitidis 7,כ-200,000 הריבוזומים8, Escherichia coli תא היה הריבוזומים 26,0009, תא שחפת Mycobacterium הריבוזומים 1,70010 והיה מיוג'ין ספירלה חיידקים הריבוזומים רק 30011. מידע זה שימושי באומדן לא רק את שיעור הצמיחה כל אורגניזם, אלא גם בזיהוי מינים9.
ניתוח structome נוסף, הובילו לגילוי של אורגניזם חדש; Parakaryon myojinensis נמצאה במעמקי הים החוף של יפן, מבנה תאים אשר היו ביניים בין אלה של אאוקריוטים פרוקריוטים ו-12,13,14,15. בזמן הנוכחי, טורי טכניקה אופטים זגוגית נחשב להיות כל כך קשה. שזה ייקח זמן רב להתמחות. במחקר זה, פיתחנו שיטה אמינה שבו כל אחד יכול לבצע חלוקתה זגוגית טורי ללא קושי.

<table><tbody><tr><td>Formvar making device</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 מ"מ</td></tr><tr><td>מגלשת זכוכית</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka-76</td><td></td> <td>x 26 x 1.3 מ"מ</td></tr><tr><td>מתלה אלומיניום עם חורים 4 מ"מ</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 מ"מ, עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., </td><td></td><td>Tokyo-SMZ 645</td></tr><tr><td>תאורת LED לסטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td><td></td> <td>טוקיו-מנגנון הטיה מצויד, עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>תאורת LED לקיצוץ שלב</td><td>Sunmag Co.Ltd., טוקיו-עיין</td><td></td> <td>במאמר זה</td></tr><tr><td>להב זמירה אולטראסוני</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., טוקיו</td><td>5240</td><td>EM-240, עיין בסכין יהלום נייר זה</td></tr><tr><td>לקיצוץ</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Switzerland-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>סכין יהלום לחתך אולטרה-דק</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>שוויץ-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Ultracut</td> <td>S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Mirror</td><td></td></tr> <tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-חריצים רשת ניקל</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>רשת נחושת מיוחדת בעלת 3 חריצים</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., טוקיו</td><td>2459</td><td>עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>לולאת החזקת מקטע</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>לולאת העלאת פני מים</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>צינור צביעה</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>עיין במאמר זה</td></tr><tr><td>מחזיק רב דגימות</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td> <td>Tokyo-EM-11170</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td><td></td> <td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td> טוקיו</tr></tbody></table>

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

התבוננות תאים ומרכיבים תא בשלושה ממדים בהגדלה גדולה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מחייב הכנת טורי זגוגית מקטעים של הדגימה. למרות הכנת מקטעים זגוגית טורי נחשב להיות קשה מאוד, זה די קל אם שימוש בשיטה הנכונה. בנייר זה, אנו מראים תהליך צעד אחר צעד בבטחה קבלת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים. נקודות המפתח של שיטה זו הם: 1) כדי להשתמש בחלק גדול הדגימה ולהתאים לקצה משטח והסכין הדגימה כך הם מקבילים זה לזה; 2) כדי לחתוך קטעים טוריים בקבוצות ולהימנע קושי להבחין. בין האיזורים השונים בחשבון בעזרת זוג קווצות שיער בעת אחזור קבוצה של מקטעים טורית על גבי הרשתות שסע; 3) כדי להשתמש לולאה סעיף החזקת ולמנוע ערבוב את הסדר של קבוצות סעיף; 4) כדי להשתמש 'הרמת-מים-פני לולאה' וודא כי הסעיפים ממוקמות על השיא של המים, הם נוגעים הרשת קודם, על מנת למקם אותם במיקום הרצוי על הרשתות; 5) כדי להשתמש הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום וכדי שיהיה קל יותר להתאושש הסעיפים על הרשתות וכדי למנוע קמטים של הסרט תמיכה; ו- 6) כדי להשתמש שפופרת מכתימים ולהימנע לשבור את הסרטים תמיכה עם פינצטה. שיטה חדשה זו מאפשרת קבלת מקטעים זגוגית טורי ללא קושי. השיטה מאפשרת לנתח את מבנה התא של מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה ב- 3D, אשר אינה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטת ultramicrotome איסוף קלטות אוטומטיים, פרצוף-בלוק טורי או יון ממוקדת קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים.

ב פרוטוקול זה, שימשו םיקדסה שלוש רשתות אוסף קטעים טורי. הרשתות עשויות ניקל או נחושת. הסעיפים טורי ממוקמות על הסדק האמצעי. החריצים משני הצדדים יש צורך להציג את המקטעים בעת לאסוף אותם עם הרשת. כדי להשאיר את הרשתות במקביל הסעיפים טורי בעת לאסוף אותם עם פינצטה (איור 11 d), מכופף את הידית (איור 6 ג, נכון). ידית קטנה יש יתרון כדי למנוע כיפוף של החלק העיקרי של הרשת, אשר גורמת לבעיות חמורות ב לאסוף במקטעים, וכדי למנוע נשירה הסעיפים במהלך...

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכין חתכים דקים מאוד (ultrathin sections) באופן סדרתי, בבטחה ובקלות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, על ידי אספקת מידע מבני כמותי ותלת-ממדי של תא שלם ברמה של מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע חיתוך סדרתי דק מאוד ללא מכשיר יקר, וניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות שיטה זו.כדי להתחיל בהליך זה, נקה את פניו של נסלית זכוכית. לאחר מכן, טבול מחצית אחת של נסלית הזכוכית בתמיסת Formvar בריכוז 1.5% בעמודה העליונה של מכשיר ייצור קשטי התמיכה מ-Formvar, תוך דחיפת התמיסה באמצעות אוויר דרך ברז תלת-כיווני בעזרת פומפית גומי. רוקן את התמיסה מהעמודה על ידי פתיחת הברז התלת-כיווני ושחרור אוויר להפחתת הלחץ.לאחר מכן, הוציאו את למסליית הזכוכית מהמכשיר והניחו לה להתייבש באוויר כדי ליצור שכבה (film) על פני השטח של הלמסלית. גרדו את ארבעת קצוות השכבה שעל הלמסלית באמצעות להב תער. לאחר נשיפה של אוויר חם על הלמסלית כדי להקל על הפרדת השכבה ממנה, השטיחו את השכבה למים על ידי טבילה איטית של הלמסלית במים בזווית אופקית נמוכה.לאחר מכן, דלפו את שכבת ה-Formvar מהמים באמצעות רשת אלומיניום עם חורים. כדי לקצץ את בלוק הדגימה באמצעות להב קיצוץ אולטרסוני ולהב תער תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, ודאו תחילה כי ישנם תאים על פני השטח של

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

מקור: Lutz, D., et.al.  הערכת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לאחר התמרה ברחם של מוח העכבר וחוט השדרה המתפתחים. J. Vis. Exp. (2019). סרטון זה מדגים את ניתוח ההכנה וההעברה של מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של קטע מוח מגור עכבר. הפרוטוקול מתחיל ברקמה קבועה של אוסמיום טטרוקסיד המוטמעת בשרף, ואחריה זמירה מדויקת לבידוד אזור העניין ואולטרה-מיקרוטומיה לייצור קטעים דקים למחצה ואולטרה-דקים, המוצגים באמצעות מיקרוסקופ אור ו-TEM, בהתאמה.

ניתוח אולטרה-מבני של קטע מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת דגימות עם מספרי תאים נמוכים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

דוח זה מתאר פרוטוקול הכנת דגימה ותנאי הדמיה ספציפיים לביצוע טומוגרפיה אלקטרונית של שידור סריקה של דגימות ביולוגיות עבות.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

למדו שיטה יעילה ליצירת טורי חתכים אולטרה-דקים של מיקרואורגניזמים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ללא ציוד יקר. טכניקה זו מספקת מידע תלת-ממדי מפורט על מבנה התא השלם.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

גלה סרטונים נוספים