שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור חלקים אולטרה-דקים סדרתיים בבטחה ובקלות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, ולספק מידע כמותי ותלת מימדי מבני של תא שלם ברמה המיקרוסקופית של האלקטרונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע חתך אולטרה-דק סדרתי ללא מכונה יקרה, וניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה בשיטה זו.

כדי להתחיל בהליך זה, נקה את פני השטח של מגלשת זכוכית. לאחר מכן טבלו מחצית ממגלשת הזכוכית בתמיסת 1.5% Formvar בעמודה העליונה של מנגנון ייצור סרטי התמיכה של Formvar על ידי לחיצה על התמיסה באוויר דרך תא העצירה התלת-כיווני באמצעות כדור גומי. מסננים את התמיסה מהעמוד על ידי פתיחת תא העצירה התלת-כיווני ושחרור אוויר כדי להפחית את הלחץ.

לאחר מכן הוציאו את מגלשת הזכוכית מהמכשיר, וייבשו באוויר ליצירת סרט על פני מגלשת הזכוכית. מגרדים את ארבעת קצוות הסרט על מגלשת הזכוכית בעזרת סכין גילוח. לאחר נשימה על המגלשה כדי להקל על הפרדת הסרט מהמגלשה, צף מהסרט על ידי טבילת מגלשת הזכוכית במים לאט בזווית אופקית נמוכה.

לאחר מכן גרפו את סרט הפורמבר מהמים באמצעות מתלה אלומיניום עם חורים. כדי לקצץ את גוש הדגימה עם להב חיתוך קולי וסכין גילוח מתחת למיקרוסקופ סטריאו, ודא תחילה שיש תאים על פני הבלוק על ידי התבוננות בקצה הבלוק במיקרוסקופ אור. לאחר מכן הרכיבו את בלוק הדגימה בצ'אק, והרכיבו את הצ'אק על שלב חיתוך.

חתוך את הבלוקים לגודל של 0.7 על 1.0 מילימטרים. אם שרף האפוקסי קשה מאוד, חתוך תחילה את הקופסה באמצעות להב חיתוך קולי, ולאחר מכן חתוך את הבלוק עוד יותר בעזרת סכין גילוח. חותכים כתף אחת כדי לסמן את כיוון החיתוך.

כדי לקצץ את בלוק הדגימה בעזרת סכין יהלום באמצעות המיקרוטום, הגדר את צ'אק בלוק הדגימה במחזיק הדגימה של המיקרוטום האולטרה. חותכים את פני הבלוק בעזרת סכין חיתוך יהלומים. הגדר את קצה סכין היהלום במקביל לפנים בלוק הדגימה, וחתוך את הכמות המינימלית של משטח הדגימה כדי לא לאבד שום דגימה.

חותכים את הקצה השמאלי של הבלוק בעזרת סכין החיתוך על ידי סיבוב שלב הסכין 30 מעלות שמאלה. קצה זה הופך לצד העליון של המדגם בחתך סדרתי. לאחר מכן חותכים את פני הבלוק בכ-100 מיקרון מהקצה השמאלי של הדגימה על ידי סיבוב שלב הסכין 30 מעלות ימינה.

קצה זה הופך לצד התחתון של הדגימה בחתך סדרתי. הסר את סכין החיתוך וסובב את גוש הדגימה 90 מעלות בכיוון השעון. הגדר סכין חתך דקה במיוחד לשלב הסכין.

התאם את משטח הדגימה ואת קצה הסכין כך שהם יפנו במקביל זה לזה באמצעות החלק הגדול של משטח הדגימה. לאחר מכן, מרחו סרט על הצ'אק ועל מחזיק הצ'אק של המיקרוטום, וחתכו את הסרט בגבול. הוציאו את צ'אק הדגימה מהמיקרוטום והניחו אותו מתחת למיקרוסקופ הסטריאו.

חותכים את החלק הגדול של הדגימה בעזרת סכין גילוח ומשאירים את החלק הדק שממנו יתקבלו חלקים סדרתיים הפוך את דפנות החלק לדביק באמצעות פיפטה פסטר כדי להפיל כמיקרוליטר אחד של 0.5% מתמיסת ניאופרן על הדגימה שתשמש לחיתוך סדרתי. לאחר מכן מכסים את כל הדגימה בתמיסת ניאופרן. ספוג מיד תמיסת ניאופרן עודפת עם פיסת נייר סינון המונחת ליד הדגימה.

לאחר מכן, הכן שלוש רשתות חריצים לאיסוף חלקים סדרתיים. לשם כך, כופפו את ידית הרשתות ל-60 מעלות, וטפלו ברשתות בתמיסת ניאופרן של 0.5%. לאחר מכן הפוך את הרשתות להידרופיליות על ידי פריקת זוהר.

הנח את צ'אק בלוק הדגימה בחזרה במיקרוטום באותו מיקום על ידי יישור החלקים המודבקים. זה שומר על פני הבלוק וקצה הסכין מקבילים לחלוטין זה לזה. לאחר מכן קירבו את הסכין לדגימה.

לאחר מילוי סירת הסכינים במים, מכסים את המיקרוטום בכיסוי פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר. התחל לחתוך את הדגימה בעובי חתך של 200 ננומטר. לאחר חיתוך החלק הראשון, הגדר את עובי הקטע ל 70 ננומטר.

כאשר מספר החלקים הסדרתיים מגיע ל -20, הגדר את עובי הקטע ל -10 ננומטר. מכיוון שהמיקרוטום אינו יכול לחתוך חלקים בעובי 10 ננומטר, לא מופיע קטע חדש, והחלקים שנחתכו בעבר מופרדים מקצה הסכין. לאחר מכן, הגדר את עובי הקטע ל-60 ננומטר.

זה יפיק חתכים של 70 ננומטר מכיוון שהמכונה תוסיף את עובי ה-10 ננומטר הקודם. לבסוף, הגדר את עובי הקטע בחזרה ל-70 ננומטר, והמשך לחתוך עד לקבלת קטעים באורך 1.8 מילימטר. כדי לאסוף את החלקים הסדרתיים, הנח תחילה את לולאת החזקת הקטע בקבוצת החלקים השלישית.

לאחר מכן הניחו לולאת הרמת משטח מים על שלב הסכין. הנח את הלולאה של ה-WSRL ממש מעל החלקים הטוריים על ידי הזזת הפיר והידית שלו. הורד את הלולאה של ה- WSRL על פני המים כך שהלולאה תקיף את החלקים.

דחוף את הלולאה כלפי מטה על ידי סיבוב הבורג כלפי מטה כך שפני המים יעלו על ידי מתח פנים. הזז את המקטע למרכז הלולאה. מקם אותו על קודקוד המים והתאם את כיוון הקטע באמצעות קווצת שיער.

הרם קבוצות קטעים על ידי נגיעה בה עם רשת חריצים חשופה, הנעזרת בפינצטה ונשמרת במקביל לפני המים. הנח את הרשתות עם החלקים יחד עם טיפת מים זעירה על סרט התמיכה של Formvar. הסר עודפי מים באמצעות נייר פילטר.

לאחר ייבוש מלא של החלקים, קרעו את סרט הפורמוואר סביב הרשתות; והסר את הרשתות הנושאות את החלקים. הצב את הרשתות בחריץ של צינור הצביעה בסדר הנכון, והכתים חלקים עם אורניל אצטט וציטראט עופרת. הגדר את חמש הרשתות במחזיק הרב-דגימה בסדר המתאים, כיוון את הציר הארוך של חריץ הרשת בניצב לציר מחזיק הדגימה.

תקן את הרשת עם מקבעי רשת, והכנס את מחזיק הדגימה למיקרוסקופ אלקטרוני השידור. המשך לצלם תמונות של תאי המטרה וכל חלקי התא בהגדלה גבוהה. מוצגת כאן תצוגה בהגדלה נמוכה של חמש רשתות הנושאות מקטעים טוריים.

18-25 חלקים הותקנו על רשת אחת. שימו לב שהחלקים מחוברים זה לזה ובעלי עובי זהה. קטעים סדרתיים של מיוגנזה פריקריונית מוצגים כאן.

התרשים מציג 12 מתוך 67 קטעים שלמים. נמצא כי לתא זה יש נוקלואיד גדול המורכב מסיבי DNA עירומים עם קרום נוקלואיד יחיד ואנדוסימביונטים הדומים לחיידקים אך ללא מיטוכונדריה. לפיכך, אורגניזם זה נראה כצורת חיים ביניים המתפתחת מפרוקריוט לאאוקריוט.

מוצגים כאן קטעים סדרתיים של Escherichia coli. האיור מציג 12 קטעים שלמים. מעניין לציין כי תא זה נמצא מכיל 21,700 ריבוזומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קטעים אולטרה-דקים סדרתיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.