שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכין חתכים דקים מאוד (ultrathin sections) באופן סדרתי, בבטחה ובקלות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, על ידי אספקת מידע מבני כמותי ותלת-ממדי של תא שלם ברמה של מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע חיתוך סדרתי דק מאוד ללא מכשיר יקר, וניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות שיטה זו.

כדי להתחיל בהליך זה, נקה את פניו של נסלית זכוכית. לאחר מכן, טבול מחצית אחת של נסלית הזכוכית בתמיסת Formvar בריכוז 1.5% בעמודה העליונה של מכשיר ייצור קשטי התמיכה מ-Formvar, תוך דחיפת התמיסה באמצעות אוויר דרך ברז תלת-כיווני בעזרת פומפית גומי. רוקן את התמיסה מהעמודה על ידי פתיחת הברז התלת-כיווני ושחרור אוויר להפחתת הלחץ.

לאחר מכן, הוציאו את למסליית הזכוכית מהמכשיר והניחו לה להתייבש באוויר כדי ליצור שכבה (film) על פני השטח של הלמסלית. גרדו את ארבעת קצוות השכבה שעל הלמסלית באמצעות להב תער. לאחר נשיפה של אוויר חם על הלמסלית כדי להקל על הפרדת השכבה ממנה, השטיחו את השכבה למים על ידי טבילה איטית של הלמסלית במים בזווית אופקית נמוכה.

לאחר מכן, דלפו את שכבת ה-Formvar מהמים באמצעות רשת אלומיניום עם חורים. כדי לקצץ את בלוק הדגימה באמצעות להב קיצוץ אולטרסוני ולהב תער תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, ודאו תחילה כי ישנם תאים על פני השטח של הבלוק על ידי בחינת קצה הבלוק באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, רכבו את בלוק הדגימה במצמד (chuck), ורכבו את המצמד עלבמת קיצוץ.

גזרו את הבלוקים לגודל של 0.7 על 1.0 מילימטרים. אם שרף האפוקסי קשה מאוד, גזרו תחילה את המארז באמצעות להב חיתוך אולטרסוני, ולאחר מכן גזרו את הבלוק עוד יותר באמצעות להב תער. חתכו כתף אחת כדי לסמן את כיוון החיתוך.

כדי לקצץ את בלוק הדגימה באמצעות סכין יהלום בעזרת המיקרוטום, מקמו את תפסן בלוק הדגימה במחזיק הדגימות של האולטרה-מיקרוטום. קצצו את פני השטח של הבלוק עם סכין קיצוף יהלום. מקמו את קצה סכין היהלום במקביל לפניו של בלוק הדגימה, וקצצו את מינימום שטח הפנים של הדגימה כדי למנוע איבוד של חומר מהדגימה.

חתכו את הקצה השמאלי של הבלוק באמצעות סכין הקיצוף על ידי סיבוב של במה הסכין 30 מעלות שמאלה. קצה זה יהווה את הצד העליון של הדגימה בחיתוך סדרתי. לאחר מכן, חתכו את פני הבלוק במרחק של כ-100 microns מהקצה השמאלי של הדגימה על ידי סיבוב של במה הסכין 30 מעלות ימינה.

קצה זה יהווה את הצד התחתון של הדגימה בחיתוך סדרתי. הסירו את סכין הקיצוץ, וסובבו את בלוק הדגימה 90 מעלות עם כיוון השעון. התקינו סכין לחיתוך דקיק (ultrathin) על במה הסכין.

כווננו את פני הדגימה ואת חוד הסכין כך שיהיו מקבילים זה לזה באמצעות החלק הגדול של פני הדגימה. לאחר מכן, הדביקו סרט דביק על התפסן (chuck) ועל מחזיק התפסן של המיקרוטום, וגזרו את הסרט בגבול. הוציאו את תפסן הדגימה מהמיקרוטום והניחו אותו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.

חתכו את החלק הגדול של הדגימה באמצעות להב תער, והשאירו את החלק הדק ממנו יופקו חתכים סדרתיים. הפכו את דפנות החתך לדביקות באמצעות פיפט פסטור על ידי טפטוף של כ-1 µL של תמיסת Neoprene בריכוז 0.5% על הדגימה שתוכסן לחתכים סדרתיים. לאחר מכן, כסו את כל הדגימה בתמיסת Neoprene. ספגו מיד את עודפי תמיסת ה-Neoprene באמצעות פיסת נייר סינון המוצמדת לדגימה.

בשלב הבא, הכינו שלוש רשתות חריצים (slit grids) לאיסוף נתחים סדרתיים. לשם כך, כופפו את ידית הרשתות לזווית של 60 מעלות, וטפלו ברשתות בתמיסת Neoprene בריכוז 0.5%. לאחר מכן, הפכו את הרשתות להידרופיליות באמצעות פריקת זוהר (glow discharge).

החזירו את תפס בלוק הדגימה למיקרוטום לאותה עמדה על ידי יישור החלקים המסומנים בסרט דביק. פעולה זו שומרת על מקביליות מושלמת בין פני השטח של הבלוק לבין להב הסכין. לאחר מכן, קרבו את הסכין אל הדגימה.

לאחר מילוי תעלת הסכין במים, כסו את המיקרוטום במכסה פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר. התחילו בחיתוך הדגימה בעובי חיתוך של 200 nanometers. לאחר חיתוך הפרוסה הראשונה, הגדירו את עובי החיתוך ל-70 nanometers.

כאשר מספר החתכים הסדריים מגיע ל-20, הגדירו את עובי החתך ל-10 nanometers. מכיוון שהמיקרוטום אינו יכול לחתוך חתכים בעובי 10 nanometer, לא יופיע חתך חדש, והחתכים שנותחו קודם לכן יתרחקו מקצה הסכין. לאחר מכן, הגדירו את עובי החתך ל-60 nanometers.

פעולה זו תפיק חתכים בעובי 70 ננומטר מכיוון שהמכונה תוסיף את עובי 10 הננומטר הקודם. לבסוף, הגדירו מחדש את עובי החתך ל-70 ננומטר, והמשיכו בחיתוך עד לקבלת חתכים באורך 1.8 מילימטר. כדי לאסוף את החתכים הסדרתיים, מקמו תחילה את לולאת החזקת החתכים על קבוצת החתכים השלישית.

לאחר מכן, הניחו את לולאת העלאת פני השטח של המים על במה הסכין. מקמו את הלולאה של ה-WSRL בדיוק מעל לחתכים הסדרתיים על ידי הזזת הציר והידית. הורידו את הלולאה של ה-WSRL אל פני המים כך שהלולאה תקיף את החתכים.

דחף את הלולאה כלפי מטה על ידי סיבוב הבורג למטה, כך שפני השטח של המים יעלו עקב מתח פנים. העבר את החתך למרכז הלולאה. מקם אותו על שיא גובה המים וכוון את כיוון החתך באמצעות שערה.

הרימו קבוצות של חתכים על ידי נגיעה בהם עם רשת חריצים (slit grid) נקייה, בעזרת פינצטה, תוך שמירה על רשת מקבילה לפני השטח של המים. הניחו את הרשתות עם החתכים, יחד עם טיפה קטנה של מים, על סרט תמיכה מסוג Formvar. הסירו עודפי מים באמצעות נייר סינון.

לאחר שהחתכים יבשו לחלוטין, קרעו את שכבת ה-Formvar מסביב לרשתות; והוציאו את הרשתות הנושאות את החתכים. הניחו את הרשתות בחריץ של מבחנת הצביעה בסדר הנכון, וצבעו את החתכים באמצעות uranyl acetate ו-lead citrate. הניחו את חמש הרשתות במחזיק הרב-דגימה בסדר הנכון, כאשר הציר הארוך של חריץ הרשת ממוקם בניצב לציר מחזיק הדגימה.

קבעו את הרשת באמצעות מקבעי רשת (grid fixers), והכניסו את מחזיק הדגימה לתוך מיקרוסקופ האלקטרונים החודר (transmission electron microscope). המשיכו לצלם את תאי המטרה ואת כל חיתוכי התאים בהגדלה גבוהה. מוצגת כאן תצפית בהגדלה נמוכה של חמש רשתות הנושאות חיתוכים סדרתיים.

18-25 חתכים הונחו על רשת אחת. שימו לב כי החתכים מחוברים זה לזה ובעלי עובי זהה. מוצגים כאן חתכים סדרתיים של myogenesis של ה-pericarion.

האיור מציג 12 מתוך 67 חתכים מלאים. נמצא כי תא זה מכיל נוקלאואיד גדול המורכב מסיבי DNA עירומים עם ממברנת נוקלאואיד אחת ואנדוסימביונטים הדומים לבקטריות, אך ללא מיטוכונדריה. לפיכך, נראה כי אורגניזם זה הוא צורת חיים ביניים המתפתחת מפרוקריוט לאוקריוט.

מוצגים כאן חתכים סדרתיים של Escherichia coli. האיור מראה 12 חתכים מלאים. מעניין לציין כי נמצא כי תא זה מכיל 21,700 ריבוזומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין חתכים דקים מאוד (ultrathin sections) באופן סדרתי. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.