Name: Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: למדו להעריך שמירת סידן מיטוכונדריאלי ונפיחות מיטוכונדריאלית בתאי SH-SY5Y באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו חושפת מנגנוני תפקוד מיטוכונדריאלי ומטבוליזם אנרגטי תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מענק של מדען מצטיין של שאנדונג (JQ201421), מענק NSFC (81371226).

1. בידוד של המיטוכונדריה
הערה: כל פתרונות וציוד צריך להיות precooled 0 - 4 מעלות צלזיוס, נשמרים על קרח.
<ol><li>זרעי בערך 3 x 106 SH-SY5Y תאים לכל מאכל תרבות תא 10 ס מ. התרבות התאים Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר בינוני עם סרום שור עוברית 10%, פניצילין (100 U/mL)-סטרפטומיצין (100 µg/mL). לשמור על 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור המכילה 5% CO2 בן לילה. הערה: לפחות 1-2 x 10 תאים7 SH-SY5Y יש צורך בכל assay בידוד.</li>
	<li>להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר קרח בצלחת תרבות תא 10 ס מ 3 פעמים.</li>
	<li>הוסף חדש 1 מ"ל של PBS קר קרח לתוך צלחת תרבות תא 10 ס מ, לגרד את תאים חסיד לתוך צינור 1.5 mL החדש. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 10-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>במהלך צנטריפוגה, להכין מאגר בידוד מיטוכונדריאלי 5 מ"ל (250 מ מ סוכרוז, 10 מ מ HEPES (חומצה ethanesulfonic-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine 4), 10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl2, 1 מ מ EDTA) בתוספת μL 50 מניות מעכבי פרוטאז פתרון (100 x ריכוז; 1 טבליה נטולת EDTA מומס µL 500 של ddH2O).</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר. דגירה הצינור 1.5 mL על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>Lyse התאים מושעה עם מהמגן זכוכית (15-25 משיכות) למעלה ולמטה באופן ידני על קרח. הערה: ודא כי קיימים אין בועות כאשר התאים הם הומוגני. לספור את התאים שלם ואת הגרעינים חשופות על ידי מיקרוסקופ מבחינה ויזואלית, לאשר את זה > 90% תא שבירה אירעה.</li>
	<li>להעביר את homogenate לתוך צינור 1.5 mL צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C לפנות את הפסולת (גרעינים, התאים שנותרו ללא פגע).</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות 4 ° C.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש ו צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 15 דקות 4 ° C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב g 14,000 x 4 ° C, כדי לזרז את המיטוכונדריה.</li>
	<li>בגדר המיטוכונדריה וכתוצאה מכך חייב להיות כל הזמן על קרח, resuspended בתקשורת 50-100 μL אשלגן כלורי (125 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ K2HPO4, 1 מ MgCl2, 20 מ מ. HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, ו- 2 μM rotenone, pH 7.4) על פי האחסון גלולה לפני כל התחת אחד בשני.</li>
	<li>השתמש μL 5 של פתרון מיטוכונדריאלי כדי למדוד את ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי על ידי תקן assay BCA, מדידה OD562 באמצעות קורא13לצלחת.</li>
</ol>2. קביעת מיטוכונדריאלי Ca2 + השמירה קיבולת
<ol><li>להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי ולהוסיף Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוק ריכוז סופי של 0.5 μM לפני הניסוי.</li>
	<li>העברת 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) באשלגן כלורי המדיה המכילה 0.5 μM Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט לתוך כל צלחת 6-ובכן, ובכן.</li>
	<li>דגירה המיטוכונדריה ו- Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוקים בצלחת 6-ובכן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור מקיף עבור aliquots μL להוסיף 4 1 מינימלית של 20 מ מ פתרון2 CaCl (20 מ מ CaCl2, 127 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2 20 מ מ HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, pH 7.4) כל צלחת 6-ובכן ובכן באמצעות האוטומטי לוותר על הגדרת להציג 200 nmol Ca מיטוכונדריאלי2 +/mg/חלבון.</li>
	<li>להשתמש ספקטרומטר פלורסצנטיות לעקוב אחר שינויים פלורסצנטיות כל 3 s למשך 2 דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר, אורך גל של פליטה של 531 ננומטר. הצלחת מצויד רועד ב 600 סל ד 3 s בין קריאות נשלט על ידי תוכנה (איור 1).</li>
	<li>להוסיף על aliquot 4 μL נוספים של 20 מ מ CaCl2 פתרון טוב לכל ולעקוב אחר השינויים פלורסצנטיות כל 3 s עבור 2 דק. חזור על שלב זה עד זריחה עולה עם הזמן. הערה: המיטוכונדריה מאותגרים עם מוסף Ca2 + שצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ההקלטה מוגברת. עם פתיחת mPTP, זריחה עולה עם הזמן.</li>
	<li>לפרש את הסכום הכולל של Ca2 + להוסיף עד mPTP פותח לקיבולת Ca2 + השמירה.</li>
</ol>3. קביעה של Ca 2 +-induced נפיחות מיטוכונדריאלי
<ol><li>להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי לפני הניסוי.<ol>
<li>להעביר 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) בתקשורת אשלגן כלורי לתוך כל צלחת 6-טוב טוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 10 μL של 20 מ מ CaCl2 תמיסה מימית (500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון) לתוך חלבון מיטוכונדריאלי לעורר מיטוכונדריאלי נפיחות.</li>
	<li>שיא הירידה ספיגת-540 nm כל 3 s על קורא microplate נשלט על ידי תוכנה עבור 10 דקות (איור 2). השינויים פלורסצנטיות נגרמות על ידי זרם של מומסים בגבול על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי. הערה: ספיגת ירד ב- 540 nm מקביל המיטוכונדריה נפוחות. אם הקורא לא לצפות לירידה ספיגת, יותר זמן קריאה מרווח או זמן קריאה יכול להיות מאומץ.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

אקס השמש פיקח הניסויים. ויי לי לבצע את הניסויים. חן ג'אנג, אקס שמש כתבה בעיתון.

כאן, אנו המתואר פרוטוקול פשוטה ויעילה מיטוכונדריאלי Ca2 + שמירה קיבולת assay, Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות.
הבידוד מיטוכונדריאלי, ודא כי כל חומרי, צינורות הם על קרח, במיוחד כאשר homogenizing את התאים. 0.25% טריפסין-EDTA יכול לשמש גם כדי לנתק תאים מן המנה למשך 5 דקות ב 37 º C. לאחר 15-25 משיכות, יש צורך לבחון את קרום התא שלם תחת המיקרוסקופ ולהימנע הנזק של קרום המיטוכונדריה. עם זאת, המיטוכונדריה מבודד כי השגנו הם המיטוכונדריה גולמי, המיטוכונדריה מטוהרים ניתן לקבל ...

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca2 + על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP1. כאשר הריכוז של Ca cytosolic2 + עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca2 + במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca2 +. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca2 + גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה2. זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים2 + יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP3. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו Ca2 +-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.
Ca2 + שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי2 + שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,4,של מחלות ניווניות אפילו5. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca2 + השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca2 + על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל6. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca2 +-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב7. Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca2 + ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations8. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca2 + מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca2 + תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca2 + נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca2 + 9. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.
לאחר צבירת2 + Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca2 + לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות10,11. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור12, איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.
כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>קו תאים SH-SY5Y</td><td>ATCC (מרכז המשאבים הביולוגיים העולמי)</td> <td>מספר ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>סידן ירוק-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-צבע פלואורסצנטי ירוק מחייב</td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז מלא</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר זכוכית</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>מלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי פלאש Varioskan Thermo</td><td>Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco עם גלוקוז גבוה s שונה Eagle בינוני</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין, ללא נתרן פירובט</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקה</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 10 ס"מ</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת assay ו- ca2 +-עוררה assay נפיחות מיטוכונדריאלי

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

הפקת ATP על ידי זרחון חמצוני הוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. במיטוכונדריה פרוקריוטים גבוה יותר גם להשתתף cytosolic Ca2 + אגירה, ייצור ATP ב מיטוכונדריאלי יכול להיות מתווכת על-ידי intramitochondrial חינם Ca2 + ריכוז. Ca2 + שמירה קיבולת יכול היה להיחשב ליכולת של המיטוכונדריה לשמור על הסידן המטריצה מיטוכונדריאלי. שהצטברו תאיים Ca2 + מוביל החדירות של קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, כינה את הפתיחה של חדירות מיטוכונדריאלי המעבר נקבובית (mPTP), כשבסופו לדליפת של מולקולות עם מולקולרית משקל kDa פחות מ- 1.5. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. כאן, אנו מתארים שני מבחני לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד. לאחר כמויות מסוימות של Ca2 + מתווספים, כל השלבים ניתן יהיה להשלים ביום אחד, שהוקלט על ידי קורא microplate. לפיכך, מבחני שני אלה פשוט ויעיל ניתן לאמץ להעריך Ca2 +-הקשורים פונקציות מיטוכונדריאלי.

תוצאות נציג של Ca2 + שמירה קיבולת: התוצאות היו הביע כערכים זריחה. עם פולסים נוספת של Ca2 + (200 nmols/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת על ידי כפול מעל הבסיס עם פתיחת mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), מעכב של Ca2 +-induced mPTP הפתיחה, או atractyloside μM 1 (ATR), activator Ca2 +-induced mPTP הפתיחה, נוספו המיטוכונדריה מבודד. כמות סה כ הוסיף Ca2 + עד mPTP הפתיחה שמסומן על ידי עלייה כפול מעל ידי קרינה פלואו...

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקבוע את קיבולת השמירת על סידן של המיטוכונדריה בנפיחות מיטוכונדריאלית מושרית סידן. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בחקר של תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי, כגון חילוף חומרים אנרגטי לא תקין. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה ויעילה מאוד.בתחילה, זרעו כ-שלושה מיליון תאי SH-SY5Y לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 10 סנטימטרים. הסירו את המצע ושטפו את התאים כשישה מיליליטרים של PBS קר בקרח בתוך צלחת התרבית בקוטר 10 סנטימטרים, שלוש פעמים. הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר בקרח לצלחת התרבית בקוטר 10 סנטימטרים וגרדו את התאים הדבקים לתוך מבחנה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר.סובב במ centri-fuge ב-800 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. במהלך הסבוב, הכן חמישה מיליליטר של mitochondrial isolation buffer, בתוספת 50 µL של תמיסת סטוק של protease inhibitor. הסר את העלייה (supernatant) ותלה את המשקע (pellet) במיליליטר אחד של mitochondrial isolation buffer.הדגרירו את המבחנה בנפח 1.5 מיליליטר על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, פצלו את התאים התלוים באמצעות הומוגניзатор זכוכית, בתנועות מעלה ומטה באופן ידני על קרח. העבירו את ההומוגנאט למבחנה בנפח 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, סובב במ centri-fuge ב-1,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את השאריות. לאחר הסבב, העבר את תסמיך העילוי למבנה 1.5 מיליליטר חדש לפני ביצוע סבב נוסף כפי שנעשה קודם לכן. לאחר העברת תסמיך העילוי למבנה חדש, סובב במ centri-fuge ב-14,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסיר את הנוזל העליון ותלה את המשקע המכיל את המיטוכונדריה במיליליטר אחד של Mitochondrial isolation buffer. לאחר מכן, סנטריפוג את התמיסה למשך 15 דקות ב-14,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C כדי לשקיע את המיטוכונדריה. יש לשמור את משקע המיטוכונדריה שהתקבל על קרח, ולתלות אותו שוב ב-50 עד 100 µL של potassium chloride media, בהתאם לנפח המשקע לפני ביצוע כל בדיקה.לבסוף, השתמשו בחמישה µL של תמיסת מיטוכונדריה כדי למדוד את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות BCA assay סטנדרטי, תוך מדידת OD562 באמצעות קורא לוחות. הכינו את מצע פוטסיום כלוריד והוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי הירוק לקשירה של סידן עד לריכוז סופי של 0.5 µM לפני הניסוי. כדי לקבוע את קיבולת השמירה על סידן במיטוכונדריה, העבירו תחילה מיליליטר אחד של מיטוכונדריה מבודדת במצע פוטסיום כלוריד המכיל 0.5 µM של צבע פלואורסצנטי ירוק לקשירה של סידן לכל באר של לוח בעל שש בארות.דגרו את המיטוכונדריה ואת הצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר סידן בפלטה בעלת שישה בארות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור סביבתי, למשך דקה אחת. לאחר הדגירה, הוסיפו לכל בארה בפלטה בעלת שש הבארות מנות של 4 µL מתמיסת calcium chloride בריכוז 20 mM, תוך שימוש בהגדרת חלוקה אוטומטית כדי להחדיר 200 nmol של סידן לכל mg של חלבון מיטוכונדריאלי. השתמשו בספקטרומטר פלואורסצנטי כדי לנטר את שינויי הפלואורסצנציה מדי שלושה שניות למשך שתי דקות, עם אורך גל עירור של 506 nm ואורך גל פליטה של 531 nm.הפלטה מצוידת במנגנון ניעור במהירות של 600 rpm למשך שלוש שניות בין קריאה לקריאה, בבקרה של תוכנה. הוסף מנה נוספת של 4 µL מתמיסת calcium chloride בריכוז 20 mM לכל באר, ולאחר מכן עקב אחר שינויי הפלואורסצנציה בכל שלוש שניות למשך שתי דקות. כדי לקבוע נפיחות מיטוכונדריאלית מושרית בסידן, העבר 1 mL של מיטוכונדריה מבודדת במצע potassium chloride לכל באר של פלטה בעלת שש בארות.לאחר מכן, הוסף 10 µL של תמיסה מימית של calcium chloride בריכוז 20 mM לחלבון המיטוכונדרי כדי לעורר נפיחות מיטוכונדרית. באמצעות קורא מיקרו-פלייטים המופעל על ידי תוכנה, רשום את הירידה בבליעה בכל שלוש שניות למשך 10 דקות באורך גל של 540 nm. מוצגים כאן תוצאות מייצגות של קיבולת שימור סידן מיטוכונדרית עבור bongkrekic, מעכב של פתיחת נקב המעבר בחדירות המיטוכונדרית המושרה על ידי סידן (MPTP), atractyloside, מפעיל של פתיחת MPTP המושרה על ידי סידן, ובקרת בנק (blank).הקיבולת בטיפול ב-bongkrekic גבוהה בהרבה מזו של קבוצת ה-atractyloside, כפי שצפוי. תוצאות מייצגות של נפיחות מיטוכונדריאלית המושרית על ידי סידן ב-bongkrekic, atractyloside ובביקורת ללא טיפול מוצגות כאן. הירידה בבליעה שנמדדה באורכי גל של 540 nanometers מעידה על נפיחות המיטוכונדריה.התוצאות מרמזות כי BKA יכול לעכב את פתיחת ה-MPTP, בעוד ש-ATR יכול להקל על פתיחת ה-MPTP. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה בחמישה שעות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את כל התמיסות על קרח.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה מבודדת. הבדיקה מנתחת את האות הפלואורסצנטי של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן כדי לחקור את הקינטיקה של ספיגת סידן במיטוכונדריה ועומס יתר של סידן.

בדיקת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי: שיטה מבוססת קורא צלחות למדידת ספיגת סידן במיטוכונדריה מבודדים

סרטון זה מתאר בדיקה מבוססת הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית. הבדיקה משתמשת בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Rhod-2/AM כדי למדוד את הסידן המיטוכונדריאלי בתאים בתרבית חדירה.

בדיקת זרימת סידן למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית

סרטון זה מדגים את ההליך להערכת יכולת שימור הסידן במיטוכונדריה על ידי ניטור שינויים בזמן אמת בקרינה כאשר המיטוכונדריה סופגת סידן. בדיקה זו שימושית לחקר תפקוד המיטוכונדריה ותהליכים הקשורים לסידן, כולל אפופטוזיס ומחלות ניווניות.

קביעת יכולת אגירת הסידן של מיטוכונדריה מבודדת

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.

מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

למדו להעריך שמירת סידן מיטוכונדריאלי ונפיחות מיטוכונדריאלית בתאי SH-SY5Y באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו חושפת מנגנוני תפקוד מיטוכונדריאלי ומטבוליזם אנרגטי תאי.

Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת Assay ו- Ca^{2 +}-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

גלה סרטונים נוספים