Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת Assay ו- Ca^{2 +}-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את יכולת שימור הסידן המיטוכונדריאלי בנפיחות מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי סידן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כגון חילוף חומרים לא תקין של אנרגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאוד פשוטה ויעילה.

כדי להתחיל, זרע כשלושה מיליון תאי SH-SY5Y לכל צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטר. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם כמיליליטר PBS קר כקרח בצלחת תרבית תאים של 10 סנטימטר שלוש פעמים. הוסף מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לתוך צלחת תרבית התאים בגודל 10 סנטימטר וגרד את התאים הדבקים לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. במהלך הצנטריפוגה, הכינו חמישה מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי, בתוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מעכבי פרוטאז. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה עם מיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי.

דגרו את צינור ה-1.5 מיליליטר על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, לייז את התאים התלויים עם הומוגנייזר זכוכית, למעלה ולמטה באופן ידני על קרח. העבירו את ההומוגנאט לצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב-1,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפסולת. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר לפני הצנטריפוגה שוב כמו קודם. לאחר העברת הסופרנטנט לצינור חדש, צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה המכילה מיטוכונדריה עם מיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי. לאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 14, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי לזרז את המיטוכונדריה. יש לשמור את כדור המיטוכונדריה המתקבל על קרח ולתלות אותו מחדש ב-50 עד 100 מיקרוליטר של אשלגן כלורי, בהתאם לנפח הגלולה לפני כל בדיקה.

לבסוף, השתמש בחמישה מיקרוליטרים של תמיסה מיטוכונדריאלית כדי למדוד את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי על ידי בדיקת BCA סטנדרטית, מדידת OD562 באמצעות קורא צלחות. הכן את אמצעי האשלגן הכלורי והוסף את הצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר סידן לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולר לפני הניסוי. כדי לקבוע את יכולת שימור הסידן המיטוכונדריאלי, העבירו תחילה מיליליטר אחד של מיטוכונדריה מבודדת במצע אשלגן כלורי המכיל 0.5 צבע פלואורסצנטי ירוק קושר סידן מיקרו-מולרי לכל באר של צלחת שש בארות.

דגרו את המיטוכונדריה ואת הצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר סידן בצלחת שש הבארות בטמפרטורת החדר, מוגנת מאור הסביבה למשך דקה אחת. לאחר הדגירה, הוסף ארבעה מיקרוליטר בתמיסת סידן כלוריד של 20 מילי-מולרית לכל באר של שש הבארות באמצעות הגדרת החלוקה האוטומטית כדי להכניס 200 ננומול של סידן למיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי. השתמש בספקטרומטר הפלואורסצנטי כדי לנטר את שינויי הקרינה כל שלוש שניות למשך שתי דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר ואורך גל פליטה של 531 ננומטר.

הצלחת מצוידת בטלטול ב-600 סל"ד למשך שלוש שניות בין קריאות, הנשלטת על ידי תוכנה. הוסף עוד ארבעה מיקרוליטר של תמיסת סידן כלוריד של 20 מילי-מולרי לכל באר, ולאחר מכן עקוב אחר שינויי הקרינה כל שלוש שניות למשך שתי דקות. כדי לקבוע נפיחות מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי סידן, העבירו מיליליטר אחד של מיטוכונדריה מבודדת במדיה של אשלגן כלורי לכל באר של צלחת שש בארות.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסה מימית של סידן כלורי 20 מילי-מולרית לחלבון המיטוכונדריאלי כדי לעורר נפיחות מיטוכונדריאלית. באמצעות קורא מיקרו-פלטות הנשלט על ידי תוכנה, רשום את הירידה בספיגה כל שלוש שניות למשך 10 דקות ב-540 ננומטר. תוצאות מייצגות של יכולת שימור סידן מיטוכונדריאלית של בונגקרקי, מעכב של נקבוביות מעבר חדירות מיטוכונדריאלית המושרה על ידי סידן, או MPTP, פתיחת אטרקטילוזיד, מפעיל של פתח MPTP המושרה על ידי סידן ובקרה ריקה, מוצגות כאן.

הקיבולת בטיפול בבונגקרקי גבוהה בהרבה מקבוצת האטרקטילוזיד, כצפוי. תוצאות מייצגות של נפיחות מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי סידן של בונגקרקי, אטרקטילוזיד ובקרת היעדר טיפול מוצגות כאן. הירידה בספיגה המנוטרת ב-540 ננומטר מצביעה על נפיחות במיטוכונדריה.

התוצאות מצביעות על כך ש-BKA יכול לעכב את פתיחת ה-MPTP, בעוד ש-ATR יכול להקל על פתיחת ה-MPTP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הפתרונות על הקרח.