ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית
23 באוקטובר 2017
Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.
המטרה הכללית של התעתוק הוויראלי וההקלטה במקצרי זמן (time-lapse) היא להמחיש ויזואלית את תנועת המיטוכונדריה של אוליגודנדרוციטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האוליגודנדרוציטים, כגון האופן שבו האוליגודנדרוציטים ואברוניהם מגיבים לשינויים בסביבה המקומית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מפורט על מבנה האוליגודנדרוציטים ודינמיקת האברונים בבקיעה שבה כל תאי המוח השונים נוכחים והאוליגודנדרוציטים מייצרים מיאלין דחוס. בצעו התעתוק של האוליגודנדרוציטים בתרביות פרוסות ביום השביעי במעבדה (in vitro). ראשית, שאבו 1.3 µL של AAV מדולל לכל פרוסה. ודאו שהחלק החיצוני של קצה הפ pipette יבש, החזיקו את הפ pipette מעל הקורטקס קרוב ככל האפשר מבלי לגעת בפרוסה עם קצה הפ pipette, ודחפו באיטיות את התמיסה החוצה מהפ pipette. כאשר התמיסה נוגעת בפרוסה, העבירו את קצה הפ pipette על פני הקורטקס כדי לפרוס את התמיסה על כל שטח הקורטקס. לאחר שכל הפרוסות בצלחת אחת עברו התעתוק, החזירו את הצלחת לאינקובטור וחזרו על התהליך בצלחות האחרות. בחנו את הפרוסות לאיתור ביטוי של סמנים פלורסצנטיים וצלמו את הפרוסות כאשר רמות הביטוי של הסמנים הפלורסצנטיים מספיקות והפרוסות נראות בריאות. התחילו בהכנת אמבט הדמיה באמצעות חימר פיסולי להצמדת מחטי מזרק המכופפות בזווית של 45
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בדינמיקה של אוליגודנדרוציטים באמצעות פרוטוקול לביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לאוליגודנדרוציטים בתוך פרוסות מוח אורגנוטיפיות. באמצעות דימוי Time-lapse, חוקרים שואפים להמחיש את תנועת המיטוכונדריה של האוליגודנדרוציטים ולהבין את תגובתן לשינויים סביבתיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימוי
רקע
- אוליגודנדרוציטים מייליניזציה הם חיוניים עבור סיגנל עצבי יעיל.
- הם משפרים את התפשטות פוטנציאל הפעולה ותומכים בהישרדות נוירונלית.
- הבנת התנהגות האוליגודנדרוציטים יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד המוח ופתולוגיה.
מטרת המחקר
- להדמיית תנועת מיטוכונדריה של אוליגודנדרוציטים במודל של פרוסה מוחית אורגנוטיפית.
- לבחינת האופן שבו אוליגודנדרוציטים מגיבים לשינויים סביבתיים מקומיים.
- לספק שיטה המסייעת בהערכת המבנה והדינמיקה של אוליגודנדרוציטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הניסוי משתמש בחתכים מוחיים אורגנוטיפיים לצורך תצפית על התנהגות של אוליגודנדרוציטים.
- אוליגודנדרוציטים עוברים טרנסדוקציה ביום השביעי במבחנה (in vitro) באמצעות וקטור ויראלי.
- שיטת דימיון time-lapse לוכדת שינויים דינמיים של אוליגודנדרוציטים.
- טכניקות פיפטינג קפדניות מיושמות כדי להבטיח טרנסדוקציה אחידה לאורך החתכים.
תוצאות עיקריות
- גישה זו מאפשרת תצפית מפורטת על תנועת אוליגודנדרוציטים ועל דינמיקה מיטוכונדריאלית.
- ממנתוני ההדמיה צפויות לעלות תובנות לגבי התגובות המבניות של אוליגודנדרוציטים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של דינמיקת אוליגודנדרוציטים במודל רלוונטי.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של תפקודי האוליגודנדרוציטים והשלכותיהם על בריאות הנוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של דינמיקת האברונים באוליגודנדרוציטים במודל של פרוסה של מוח הרלוונטי פיזיולוגית, ובכך תומך בתיקוף של מטרות במחלות דמיאלינציה. על ידי קישור התנהגות המיטוכונדריה לתגובות סביבתיות, הוא מספק הפחתת סיכונים מכנית עבור מועמדים לטיפולים נוירולוגיים המשפיעים על תפקוד הגליה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת תצפית ישירה על בריאות האוליגודנדרוציטים ועל האינטראקציות עם מעטפת המיאלין.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות ספציפיות לאוליגודנדרוציטים בנוגע לתגובות של אברונים לשינויים בסביבה המיקרוסקופית.
- ערך תפעולי: משתמש בטרנסדוקציה מתווכת AAV תחת פרומטור של myelin basic protein לצורך סימון ספציפי לסוג התא, ובכך מפחית השפעות לא רצויות (off-target).
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי קורלציה בין דינמיקה מיטוכונדריאלית לבריאות אוליגודנדרוציטים ברקמה שלמה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתונים כמותיים של צילום רצף (time-lapse) על תנועת מיטוכונדריות, מה שמאפשר קריאות סטנדרטיות לסריקת תרכובות.
- שחזוריות: פרוסות אורגנוטיפיות שומרות על אינטראקציות טבעיות בין תאים, ובכך משפרות את העקביות בין ניסויים.
- יכולת הרחבה: תואם לפלטפורמות של מיקרוסקופיה קונפוקלית הנמצאות בשימוש נרחב במעבדות מחקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ניתן ליישום ישיר במודלים של דמיאלינציה שבהם מעורב סטרס של אברוני אוליגודנדרוציטים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים in vitro לבין פתופיזיולוגיה ברמת הרקמה באמצעות דימוי חי של תהליכים הקשורים למיאלין.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר להעריך האם תרכובות בדיקה מחלצות או מחמירות את התפקוד הלקוי של האברונים באוליגודנדרוציטים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור תוכניות מחקר למחלות ניווניות של מערכת העצבים ומחלות דמילינציה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תגובות של אברונים באוליגודנדרוציטים להפרעות פרמקולוגיות או גנטיות.
- סריקה: מאפשר פיתוח של בדיקות למיתוכונדריות, הן מבחינת ניידות והן מבחינת מורפולוגיה, כמדדים פנוטיפיים.
- אנליטיקה: מספק פלטי דימות כמותיים (למשל, מהירות, צפיפות, משך תנועת המיטוכונדריות) לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דינמיקה תאית לבין שלמות המיאלין באמצעות מיקרוסקופיית Confocal Reflectance משלימה לוויזואליזציה של מיאלין ללא סימון.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאים את הפרוטוקול לאברונים אחרים (למשל, ליזוזומים, ER) תוך שימוש באותו שלד AAV, ובכך להגביר את יעילות הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתגליות תרופות המכוונות לאוליגודנדרוציטים באמצעות ויזואליזציה של התנהגות אברונים בזמן אמת.
- ערך תפעולי: זרימת עבודה סטנדרטית של טרנסדוקציה ודימות משפרת את השחזוריות בין אתרים וצוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפה מוקדמת של השפעות off-target על בריאות הגליות במהלך שלב התגליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות המותאם לסיכון, בהתבסס על השפעותיהן על הפיזיולוגיה של האוליגודנדרוציטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציה ויראלית, תרביות של פרוסות איברים (organotypic slice culture) ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בזמינות של AAV, אופטימיזציה של הטיטר וספציפיות של הפרומוטור עבור פגיעה באוליגודנדרוციטים.
- מחייב בקרה סביבתית (CO2, טמפרטורה) לשמירה על בריאות הפרוסות במהלך דימוי בשיטת time-lapse.
- התאמה לאברונים אחרים מחייבת תיקוף של אותי מיקוד מיטוכונדריאליים לעומת רצפי לוקליזציה חלופיים.
- מוגבל על ידי חיוניות הפרוסות לאורך זמן ושונות פוטנציאלית ביעילות הטרנסדוקציה בין דגימות שונות.
