הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי
4 בדצמבר 2017
שיטה לניתוח spectrometric המוני של פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF) מוצג. על ידי העסקת משקל מולקולרי ניתוק סינון, fractionation קדם כרומטוגרפי, המוני spectrometric ניתוח ושילוב עוקבות של פפטיד זיהוי אסטרטגיות, ניתן היה להרחיב את peptidome CSF ידוע כמעט כוחנו לעומת על מחקרים קודמים.
מטרת פרוטוקול זה היא להכין ולנתח דגימות נוזל מוחי אנושי לניתוח LC-MS של פפטידים אנדוגניים. שלב טרום פיצול פפטיד לפני LC-MS מגדיל את מספר הפפטידים המזוהים ומאפשר זיהוי של פפטידי CSF בשפע נמוך יחסית. פפטידים אנדוגניים ב-CSF הם מולקולות סידן שלא נחקרו בהרחבה ועשויות לכלול סמנים ביולוגיים חדשים חשובים של הפרעות ניווניות. שיטה זו מאפשרת אפיון נרחב של פפטידום CSF על ידי ספקטרומטריית מסה. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שהיא מאפשרת הזרקה של פפטידי CSF בשפע נמוך ותואמת לטכניקות תיוג איזובריות מרובות, מה שהופך אותה לישימה למחקרים קליניים. עד כה יישמנו שיטה זו בעיקר לניתוח נוזל השדרה. אך יש לנו נתונים ראשוניים המצביעים על כך שעם שינויים קלים, ניתן להשתמש בו גם לניתוח דגימות פלזמה ורקמות. התחל בהפשרת 1.5 מיליליטר של CSF בטמפרטורת החדר על מערבל רולר. לאחר ההפשרה, העבירו את התכולה לצינורות פוליפרופילן של 10 מיליליטר. והוסף 80 מיקרוליטר של TAB טוחנת אחת כחומר חציצה. לאחר מכן הוסיפו 0.65 מיליליטר של גואנידיניום הידרוכלוריד בעל שמונה טוחנות כדי להמיס אגרגטים של חלבון ומערבולת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, ב-60 מיקרוליטר של TCEP מימי של 200 מילי-מולרי, ודגירה ב-55
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניתוח ספקטרומטרי של מסות של פפטידים אנדוגניים בנוזל חבירה מוחי (CSF) אנושי. באמצעות שימוש בסינון עם סף חיתוך של משקל מולקולרי, פרקציונציה כרומטוגרפית מקדימה וניתוח ספקטרומטרי של מסות, המחקר מרחיב משמעותית את הפפטידום המוכר של ה-CSF, ובכך משפר את הזיהוי של פפטידים בריכוז נמוך שעשויים לשמש כסמנים ביולוגיים להפרעות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ספקטרומטריית מסות
- גילוי סמנים ביולוגיים
רקע
- פפטידים אנדוגניים בנוזל הרירי של המוח (CSF) עשויים להיות בעלי משמעות בזיהוי של הפרעות נוירודגנרטיביות.
- פפטידים בריכוז נמוך ב-CSF לא נחקרו באופן נרחב.
- שיטות קיימות סיפקו נתונים מוגבלים על הפפטידום של ה-CSF.
מטרת המחקר
- לשיפור הזיהוי והאפיון של פפטידים אנדוגניים בנוזל חוט השדרה (CSF) אנושי.
- לספק מבט מקיף יותר על הפפטידום של נוזל חוט השדרה.
- לבחון את הפוטנציאל לסמנים ביולוגיים חדשים במצבים ניו roda-גנרטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ספקטרומטריית מסות עם פרקציונציה מקדימה של דגימות נוזל חוט השדרה (CSF).
- כולל הפשרה ועיבוד של אליקוטים של 1.5 milliliter של CSF עם ריאגנטים ספציפיים.
- תואם לטכניקות של סימון איזובארי מולטיפלקסי.
- ניתן להתאמה לניתוח דגימות פלזמה ורקמה באמצעות שינויים קלים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת זיהוי של מספר גדול משמעותית של פפטידים בהשוואה למחקרים קודמים.
- ממצאים מרכזיים מצביעים על נוכחותם של פפטידים בריכוז נמוך שלא נחקרו בעבר.
- מספקת תובנות שעשויות להוביל לגילוי של סמנים ביולוגיים (biomarkers) חדשים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה יעילה לאפיון הפפטידום של ה-CSF.
- ורסטיליות השיטה פותחת אפשרויות למחקרי קליניקה על הפרעות נוירודגנרטיביות.
- השלכות פוטנציאליות להבנת מנגנונים נוירונליים ולזיהוי סממנים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו משפרת את הגילוי של פפטידים אנדוגניים בריכוז נמוך בנוזל השדרה של בני אדם, נוזל ביולוגי מרכזי לגילוי סמנים ביולוגיים למחלות נוירודגנרטיביות. באמצעות הפחתת מורכבות החלבונים באמצעות פרקציונציה לפי MWCO ושיפור כיסוי הפפטידים באמצעות פרקציונציה מוקדמת ב-RP-HPLC ב-pH גבוה, השיטה מגבירה את הרגישות האנליטית למאמצי תיקוף של מטרות. הגישה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי מתן אפשרות לאפיון מעמיק יותר של הפפטידום, דבר שיכול להגביר את הביטחון במטרה בשלבים מוקדמים ולסייע בבחירת סמנים ביולוגיים ניבויים בתוכניות לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אוכלוסיות פפטידים אנדוגניות המשקפות תהליכים פתופיזיולוגיים במערכת העצבים המרכזית (CNS), ובכך תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מפחית הפרעות של טווח דינמי הנובעות מחלבוני CSF בשכיחות גבוהה, ובכך משפר את הגילוי של פפטידי איתות ברמה נמוכה הרלוונטיים לוויסות מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר דפוסי הפרדה של פפטידים הניתנים לשחזור, המאפשרים קריאות LC-MS/MS עקביות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תואם לסימון איזובארי מרובה (multiplex isobaric labeling), המאפשר ניתוח השוואתי של הפפטידום בין קבוצות מחלה לקבוצות ביקורת בתהליכי סריקת סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע בגילוי סמנים ביולוגיים על ידי זיהוי פפטידים המופקים מנוזל CSF שעשויים להיות קשורים למנגנונים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה לדגימות פלזמה ורקמה באמצעות שינויים מינוריים, ובכך תומך בתיקוף בין דגימות שונות במסלולי עבודה תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בחקירת פפטידום המונחית-השערה לפני שלבי זיהוי המולקולה המובילה והתיקוף הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך באפיון לא מוטה של פפטידים אנדוגניים להבהרת מסלולים הקשורים למחלות ולהפחתת סיכונים בבחירת מטרה.
- סריקה: מאפשר זיהוי פפטידים ברמת ביטחון גבוהה באמצעות הפחתת מורכבות הדגימה ושיפור ההפרדה הכרומטוגרפית.
- אנליטיקה: מייצר נתוני פפטידים כמותיים, מורחבים לפי פראקציות, התואמים לריבוי דגימות מבוסס סימון (label-based multiplexing) עבור מחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מספק תשתית להלימה של סממנים ביולוגיים על ידי קישור שינויים בפפטידום של CSF לתהליכים ניורודגנרטיביים.
- שימוש חוזר ארגוני: את זרימת העבודה המרכזית — סינון MWCO, פראקציונציה ב-pH גבוה ו-LC-MS — ניתן להפוך לסטנדרט במעבדות שונות לצורך ניתוח פפטידום הדיר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגדיל את תפוקת זיהוי הפפטידים ומאפשר זיהוי של מינים בריכוז נמוך שעשויים לשמש כאינדיקטורים למצב מחלתי או למנגנונים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרקציונציה מקדימה סטנדרטית ומפחית שונות טכנית בניתוח של נוזלים ביולוגיים מורכבים.
- ערך אסטרטגי: מגביר את הביטחון בקבלת החלטות לגבי תיקוף מטרות (target validation) על ידי הרחבת המרחב הביולוגי הניתן לתצפית ב-CSF.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף ביומרקרים מותאם סיכון באמצעות כיסוי רחב יותר של הפפטידום ושיפור בזיהוי האות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב-CSF, עיכוב פרוטאז ופפטידומיה מבוססת ספקטרומטריית מסות.
- הציוד חייב לכלול מערכות LC-MS/MS המסוגלות לתאימות עם פרקציונציה ב-pH גבוה וגילוי רגיש של פפטידים.
- סטנדרטיזציה בין אתרים דורשת בחירה עקבית של מסנני MWCO, שרשור פרקציונציות ופרמטרי זיהוי מבוססי תוכנה.
- התאמה לפלזמה או לרקמה דורשת אופטימיזציה של תנאי ליזיס, דיפלציה ופרקציונציה כדי להתחשב במורכבות השונה של המטריקה.
- מגבלות מעשיות כוללות אובדן פפטידים פוטנציאלי במהלך הסינון ואת הצורך בבקרה קפדנית על זיהומים בשל ניתוח של יעדים בריכוז נמוך.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
