הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעות של דלדול גנים ספציפיים מעניינים על נדידת התאים. שיטה זו יכולה לסייע לנו לענות על שאלות מפתח בגרורות סרטניות, כגון נדידת תאים סרטניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לעקוב אחר נדידת התאים הדינמית בזמן אמת.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה, כאשר צפינו בשינויים במורפולוגיה של התא בחולה של TIP60, מדכא גידול. התחל בזריעת מיליון תאי אפיתל שד בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית לכל צלחת של 10 סנטימטר. הוסף 20 דקות תערובת SRINA מודגרת בטמפרטורת החדר טיפה אחר טיפה לתרבית התאים הניסיונית.

נער ידנית את שתי המנות כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה לפני הכנסתם לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שש שעות, החליפו את הסופרנטנטים בשמונה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל מנה והחזירו את התרבויות לחממה. למחרת בבוקר, החליפו את הסופרנטנטים בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל מנה והוסיפו טלאי שני של תערובת SIRNA לתרבית התאים הניסיונית, כפי שהודגם זה עתה, נערו את הצלחת כדי להבטיח שהריאגנטים מעורבבים במלואם לפני החזרת התאים לאינקובטור.

לאחר מכן החליפו את הסופרנטנטים בשמונה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לאחר שש שעות ודגרו על התרבויות במהלך הלילה. ביום השלישי, שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של BPS לצלחת ונתקו את התאים בשתי הצלחות עם מיליליטר אחד של טריפסון EDTA למנה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, עצרו את התגובה עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית שלם לצלחת.

השעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג והעבירו את תרחיפי התאים לצינורות בודדים של 15 מיליליטר. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בחמישה מיליליטר של מדיום נטול סרום לכל צינור. לאחר הספירה, יש לדלל את שתי תרביות התאים לריכוז של 600,000 תאים למיליליטר ולהוסיף 500 מיקרוליטר תאים מכל תרבית לבאר אחת של צלחת של 24 בארות כדי להבטיח מפגש של 100%.

לאחר שכל התאים נזרעו, נערו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 24 שעות. כדי לבדוק את יעילות ההפלה של הגן המבוקש, אסוף את התאים הנותרים בצינורות האיסוף עם צנטריפוגה נוספת ובודד את ה-RNA מהכדורים, באמצעות מגיב מסחרי על פי הוראות היצרן להערכת PCR כמותית בזמן אמת. למחרת בבוקר, לפחות שעה לפני תחילת הדמיית התא החי, הפעילו את המיקרוסקופ ואת בקרת הטמפרטורה.

הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת אספקת גז הפחמן הדו-חמצני ל-5%כאשר החדר הגיע ל-37 מעלות צלזיוס, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לאשר שהתאים מתכנסים ומחוברים במלואם לתחתית הבארות. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לגרד בעדינות קו ישר לכל אורך מרכז כל באר ולשטוף בעדינות את כל הבארות חמש פעמים במדיום נטול סרום כדי להסיר את התאים המנותקים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום לכל באר.

הנח את הצלחת על המיקרוסקופtagה מתחת לאובייקט 10 הספק וכוון את האור הנפלט לחלקי העיניים במקום למצלמה. כוונן ידנית את המיקוד כדי לאתר כל פצע והתאים סביבו. לאחר מכן החזירו את האור הנפלט בחזרה למצלמה והשתמשו במערכת תצפית על תאים חיים כדי לסמן את מיקום הפצעים ולקבוע את תנאי הזמן.

דמיין את התאים לתקופת הניסוי המתאימה, ולאחר מכן פתח את סרטון ה-avi הראשון בתוכנת ההדמיה המתאימה ופתח את התוסף m track j. לחץ על לשונית ההוספה כדי להוסיף מסלול לתאים הבודדים ובחר תא אחד בקצה החזית הפולשנית ותא אחד שיכול לנדוד בכוחות עצמו. עקוב אחר תנועת התאים שנבחרו בסרטון באמצעות mtrackJ כדי לעקוב אחר הסחר בהם.

לאחר מכן לחץ על לשונית המדידה כדי למדוד את מרחק תנועת התא ולשמור את הסרטונים עם הרצועות בפורמט avi. לאחר דלדול TIP60, תאי אפיתל השד הם מזנכימליים יותר בהשוואה לתאי ביקורת מתורבתים. ואכן, ביטוי TIP60, כמו גם ביטוי מולקולות הידבקות תאי אפיתל, פוחת משמעותית לאחר טיפול ב-siTIP60.

מצד שני, הביטוי של גנים ספציפיים של מניעי מעבר אפיתל למזנכימלי מוגבר עם דלדול TIP60. הדמיה חיה של תרביות התאים לאחר מתן פצע מדגימה נדידת תאים מהירה יותר של תאים שטופלו ב-siTIP60, בהשוואה לתרביות siControl, עם עלייה משמעותית באחוז התאים הנודדים שנצפתה בתגובה לדלדול TIP60. יתר על כן, תאי siControl נעים כיריעה, בעוד שתנועה רבה יותר של תא בודד נצפית בתוך תרביות siTIP60.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקת דימות של תאים חיים כדי לנטר שינויים דינמיים בנדידת תאים.