Name: הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: חקור נדידת תאים בזמן אמת בתאי אפיתל השד MCF10A לאחר דלדול TIP60 באמצעות הדמיה חיה. שיטה זו מאפשרת ניטור דינמי של תנועת תאים בודדים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני מתastasis בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים חברי המעבדה Jha דיון מועיל וההערות שלהם. סניף נתמך על ידי מענקים קרן מחקר נבחרת סינגפור, סינגפור משרד החינוך תחת שלו מרכזי מחקר ביוזמת מצוינות סרטן המדע מכון של סינגפור (R-713-006-014-271), נבחרת רפואי מועצת המחקר (CBRG-כוש; BNIG11nov001 ו CS-IRG; R-713-000-162-511), קרן מחקר אקדמי משרד החינוך (T1 AcRF Tier 1 מו-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. ו- C.Y.T. נתמכו על ידי מלגת תואר שני הוענק על ידי סרטן המדע מכון של סינגפור, באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.

1. הכנה
<ol><li>להכין MCF10A תרבות בינוני: של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) / F12 (1:1) עם 5% סוסים סרום 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן, אינסולין µg 10/mL.</li>
	<li>להכין ללא סרום בינוני: DMEM/F12 (1:1) עם 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן אינסולין µg 10/mL.</li>
	<li>להשתמש ברצף siRNA הבא: siControl: קדימה: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' הפוך: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: קדימה: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' הפוך: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>להשתמש בתרבות תא ס מ-10 מנות וצלחות 24-. טוב.</li>
</ol>2. ארעי דלדול של TIP60 באמצעות siRNA
<ol><li>יום 1, aliquot 15 µL של תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine RNAiMAX) ו- 2 מיליליטר מופחת סרום בינונית (למשל, Opti-מ) ומערבבים אותם עם 10 µL של כל siRNA (10 מיקרומטר מלאי), בהתאמה.</li>
	<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>זרע עונה 1 פרק 10 תאים6 MCF10A יחד עם 3 מ"ל של תרבות בינוני בקערה 10 ס מ. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>להוסיף את התערובת siRNA טיפה על ידי שחרור המנה 10 ס מ.</li>
	<li>לנער את המנה כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה לפני לשים אותו לתוך החממה 37 º C.</li>
	<li>לאחר 6 שעות של דגירה, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.</li>
	<li>יום 2, להכין עוד קבוצה של siRNA תערובות, דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>תשאף החוצה 8 מ של המדיום לתרבות הוסיף ביום 1 ולהחליף אותו עם 3 מ"ל של מדיום תרבות טריים.</li>
	<li>להוסיף הקבוצה השנייה של תערובת siRNA המנות טיפה על ידי ירידה. לנער את הכלים על מנת להבטיח כי ריאגנטים מעורבבים באופן מלא לפני ומכניסים אותם לתוך החממה.</li>
	<li>לאחר 6 שעות, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.</li>
</ol>3. זרע תאים עבור וזמינותו ריפוי פצע
<ol><li>יום 3, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ"ל באגירה פוספט מאגר (PBS) מלוחים. לבטל את המאגר PBS.</li>
	<li>Trypsinize את siControl ואת התאים siTIP60 שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 x טריפסין-EDTA מאגר לצלחת. תכניס אותו בחזרה החממה במשך 20 דקות.</li>
	<li>להוסיף 4 מיליליטר בינוני תרבות שלמה כל צלחת, resuspend את התאים על ידי pipetting, וכן להעביר אותם ל צינור 15-mL.</li>
	<li>צנטריפוגה-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>מחדש להשעות את התאים עם 5 מיליליטר בינונית ללא סרום ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>להתכונן תא השעיה של 6 x 105 תאים למ"ל siControl והן siTIP60; ודא כי התאים נמצאים מעורבב היטב. להוסיף 500 µL של התליה תא אחד טוב של צלחת 24-טוב כדי להבטיח 100% confluency. זרע בארות 5 עד 6 כל עבור siControl ו- siTIP60.</li>
	<li>לנער בעדינות את צלחת הלוך ולאחר מכן מצד לצד כדי להבטיח הפצה אפילו. הימנע תנועה מעגלית. השאירו את הצלחת החממה במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לקצור את התאים הנותרים כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים TIP60. כדי לעשות זאת, centrifuge התליה תא הנותרים-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לבודד RNA באמצעות תגובה כימית מסחרי, הפרוטוקול של היצרן, והמשך PCR כמותי בזמן אמת כדי להעריך את היעילות תמונות ציפורים.</li>
</ol>4. ליצור את הפצע
<ol><li>בדוק במיקרוסקופ ניגוד שלב על מנת להבטיח כי התאים מחוברים באופן מלא. לבחון את התאים במיקרוסקופ (4 X 10 X, 20 X הגדלה) כדי להבטיח התאים מחוברים באופן מלא טפט confluent של תאים הקימה. הערה: תאים siControl לצרף בדרך כלל טוב יותר תאים siTIP60. זה צפוי כי דלדול של TIP60 גורם לתאים mesenchymal כמו עוד20. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד benchtop רגילה שלב אור לבן.</li>
	<li>כדי להפיק את הפצע, לגרד בעדינות בקו ישר על פני המרכז של הבאר עם טיפ פיפטה 200 µL; האורך של הפצע שנוצר הוא בדיוק כמו הקוטר של הבאר. חזור על שלב זה עבור כל בארות הנותרים. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.</li>
	<li>בעדינות לשטוף כל טוב 5 פעמים שימוש ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא סרום כל טוב והמשך הדמיה לחיות תאים.</li>
</ol>5. כיוונון של הדמיה לחיות תאים
<ol><li>הפעלת המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורה לפחות שעה לפני הגדרת לחיות תאים הדמיה כדי לוודא הטמפרטורה בתא יגיע 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל את אספקת גז פחמן דו-חמצני (CO2) לפני שמתחילים את הדמיה לחיות תאים. הגדר CO2 ריכוז 5%.</li>
	<li>למקם את הצלחת 24-טוב על הבמה של המיקרוסקופ ובחר את העדשה המטרה עם 10 X הגדלה עבור הדמיה. לכוון האור הנפלט עיניות במקום המצלמה והתאימו את המוקד כדי לאתר את הפצע והתאים סביבו. הערה: במקרה זה, אור לבן עם ניגודיות שלב שימש.</li>
	<li>להשתמש במערכת הצופה לחיות תאים כדי לסמן את המיקום של הפצע כל טוב. הערה: השלב אוטומטיות של מערכת הדמיה לחיות תאים מאפשרת ייבוא תמונות מרובות ומעמדות. תמונות נלקחים על המיקום מסומן כל פעם בכל פרק זמן.</li>
	<li>להגדיר את התנאי זמן: 1 h מרווח הזמן ואת משך 72 h; על פי הגדרה זו, המערכת תיקח תמונות במיקום מסומנים כל כל שעה במשך 72 ה להגדיר את מרווח הזמן הרצויים ותקופת לניטור. הערה: כאן, משך זמן של 72 h הוא הטוב ביותר כי תאים אלה יתחילו למות לאחר 72 h במדיום נטול סרום.</li>
</ol>6. מעקב אחר תנועה תא בודד
<ol><li>יצא את הנתונים לאחר ה 72 לייצא את הנתונים כמו תמונות בתבנית JPEG וכן קטעי וידאו בפורמט AVI. הערה: זה חשוב כי התוכנה ImageJ רק יכול לזהות קטעי וידאו בפורמט AVI. המהירויות נדידת תאים שונים בין תאים siTIP60 ו- siControl יכול להיות שנצפו בבירור את הוידאו.</li>
	<li>פתח את וידאו AVI בתוכנה ImageJ.</li>
	<li>פתח את התוסף MTrackJ (התוסף בטח יורדו ויותקנו בנפרד): תוספים > MtrackJ.</li>
	<li>הוסף מסלול תאים בודדים שנבחרו מן הווידאו על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'הוסף' בסרגל הכלים MtrackJ. בחר תא בקצה הקדמי פולשנית תא יכול להעביר בכוחות עצמו (תא בודד העברה). לעקוב אחר התנועה של התאים שבחרת על הוידאו ולאתר אותם באמצעות MtrackJ.</li>
	<li>למדוד את המרחק של התנועה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "מדידה" בסרגל הכלים. הערה: כאן, כמעט לא התאים siControl עבר כמו תאים בודדים, עושה את זה קשה למדוד את תנועת מתא בודד, ואילו רבים מן התאים siTIP60 מתנועעות כמו תאים בודדים. עם זאת, התנועה של תאים הממוקמים בחזיתו פולשנית יכול עדיין להיות במעקב ומחושבים בתאים הן siControl והן siTIP60.</li>
	<li>לשמור את הווידאו עם שירים בפורמט AVI.</li>
</ol>7. כימות של יכולת העברה תא
<ol><li>על כימות, בחר תמונות ב- 0 h תמונות ב- h "n", איפה "n" מפנה timepoint כאשר תאים siTIP60 או siControl לחלוטין לסגור את הפצע. הערה: כאן, 48 שעות נבחר, כמו הפצעים בתאים siTIP60 נסגרו כמעט לחלוטין.</li>
	<li>לכמת את ההעברה אחוז שימוש ImageJ באמצעות הנוסחה הבאה: (אזור הפצע-0 h - אזור הפצע ב h "n") / אזור הפצע ב- h 0 x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

זה ידוע כי בתהליך נדידת תאים, התאים יכול ולהעביר בצורה של חסיד גיליונות; אשכולות חופשי; או תאים בודדים, מבודדים. מצב ואת הדינמיקה של הפלישה תא יכול להשתנות ממצב אחד למשנהו, ולשנות פנוטיפ בתוך שעות. וזמינותו ריפוי פצע המסורתית מבוססת על תמונה תמונות שנלקחו מיקרוסקופ עם מרווח זמן, כגון 12 או 24 שעות. זה מקשה ללכוד את הדינמיקה של סגירת הפצע ואת התבנית של התא תנועות.
מצד שני, מערכות הדמיה לחיות תאים לפקח על נדידת תאים מעל הרבה למרווח זמן קצר יותר (30 דקות או 1 h) ובבית באותה התנוחה, וזה לא ריאלי ע...

HIV-טאט-אינטראקטיבי חלבון 60 kDa (TIP60) הוא acetyltransferase ליזין זה יכול acetylate היסטון והן הלא-היסטון חלבונים1,2. הפונקציות שלה נמצאים יש השלכות במשעולים איתות מרובים, כולל תמלול, תיקון נזק לדנ א של אפופטוזיס1,3,4,5,6, 7 , 8. יתר על כן, TIP60 הוא לרוב downregulated ב סרטן, ואת downregulation שלו הוא מתואם עם גרורות סרטן,9,10,11,12, שיעורי ההישרדות המסכן 13,14. גרורות הגידול הוא הגורם העיקרי של מוות מסרטן. זהו תהליך רב שלבי, השלב הראשוני של גרורות מערבת את ההעברה ואת הפלישה של תאים סרטניים לתוך לרקמות סמוכות15,16. לשם כך, תאים סרטניים תחילה יש לנתק בין המוני הגידול העיקרי, גם בצורה של גיליון תא קולקטיבי הפולש או כמו מנותק תאים בודדים17. במהלך תהליך זה, תאים סרטניים לעתים קרובות עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), וכתוצאה מכך לשינויים מורפולוגיה ותא אדהזיה יכולת17,18.
כמה טכניקות פותחו כדי ללמוד את ההעברה, הפלישה יכולת גידול של תאי במבחנה. ביניהם, וזמינותו ריפוי פצע הוא הכי יעיל וחסכוני19. ראשית, שיטה זו כרוכה היצירה של הפער המלאכותי טפט confluent של תאים, ובכך מאפשר לתאים להעביר ולסגור את הפער. שנית, ניתן ללכוד תמונות של הפערים-ההתחלה ואת הסוף של הניסוי. לבסוף, השוואה של סגירת הפער משמש כדי לקבוע את הקצב של נדידת תאים. מיקרוסקופ שלב-ניגודיות משמש בדרך כלל כדי ללכוד תמונות עבור קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. יתרון נוסף של ריפוי פצע וזמינותו היא כי חלקית דומה ויוו נדידת תאים סרטניים. באופן דומה ל ויוו גרורות הגידול, נדידת תאים במבחני ריפוי פצע מציג את ההעברה קולקטיבית של גיליונות אפיתל והן את ההעברה של תאים בודדים מנותקת.
עם זאת, נדידת תאים ידוע להיות דינמי, יש צורך לתעד את התנועה של תאים בזמן אמת. למשל, וזמינותו המקובלת ריפוי פצע אינו מאפשר חוקר לנתח את התנועה תא בודד. מצד שני, תאים תרבותי עבור מבחני ריפוי פצע לעיתים קרובות מורעבים סרום כדי לעכב את התפשטות תאים. זה נעשה כדי לשלול את האפשרות של סגירת הפער עקב התפשטות תאים. למרות זאת, עדיין יהיו כמה התפשטות מוות תאי ואת שלב-ניגודיות מתמונות שצולמו לפני ואחרי הניסוי אינם מסוגלים להבחין ביניהם.
טכניקת דימות לחיות תאים מטפל ם קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות בשילוב עם CO2 החממה ואת בקרת הטמפרטורה המתאימה, חוקרים יכולים למדוד את גודל הפער, את קצב סגירת לאורך זמן תוך מעקב תנועת פעיל העברת תאים הממוקם בקצות חזית פולשני. לפיכך, המימוש של תאים חיים הדמיה לעקוב אחר נדידת תאים לא נספק רק כדי שתראי טוב יותר של נדידת תאים, אך יאפשר גם את האפשרות להבחין בין נדידת תאים והתפשטות תאים, ובכך מספק יותר ניתוח אמין של נדידת תאים.
במחקר זה, לתאי האפיתל של השד MCF10A שימשו כדי להדגים את השילוב של ריפוי פצע assay, תאים חיים הדמיה כדי לחקור את התפקיד של TIP60 ב נדידת תאים. דלדול של TIP60 תוצאות יכולות העברה מוגברת בתאי MCF10A.

<table><tbody><tr><td>תא MCF10A</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>תאי אפיתל שד</td></tr><tr><td>DMEM/F12 מדיה (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A מדיה תרבית</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפיתל (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>תוספי תזונה למדיה תרבית MCF10A רעלן</td></tr><tr><td>כולרה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-8052</td><td>תוספי מזון למדיה</td></tr> <tr><td>תרבית MCF10Aהידרוקורטיזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H-0888</td><td>תוספי מזון לתקשורת תרבית MCF10A</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I-1882</td><td>תוספי מזון לתקשורת תרבית MCF10A</td></tr><tr><td>סרום הבית</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>תוספי מזון למדיה תרבית MCF10A</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>25200-056</td><td>עבור MCF10A להתנתק מהצלחת</td></tr><tr><td>המציטומטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>267110</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>Opti-MEM מדיה סרום מופחתת</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>לתערובת siRNA</td></tr><tr><td>ליפופקטמין RNAiMAX</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>56532</td><td>מגיב טרנספקט</td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>למיצוי mRNA</td></tr><tr><td>iScript cDNA סינתזה ערכת</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>עבור cDNA דור</td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR ירוק Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>לזמן אמת qPCR</td></tr><tr><td>7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת</td><td>Biosystems</td><td></td><td>בזמן אמת qPCR מכונה</td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>664160</td><td>לניסוי נוקדאון</td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>לבדיקת ריפוי פצעים</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>עצמי מעוצב</td><td>עצמי</td><td>מעוצב CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>עצמי מעוצב</td><td></td><td>עצמי UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>צופה תא חי</td><td>Zeiss Zeiss</td><td></td><td>הפוך, תא צופה לניסויים בתאים חיים</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של tip60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

ריפוי פצע וזמינותו יעיל ואחת הדרכים החסכונית ביותר ללמוד תא העברה בתוך חוץ גופית. כמקובל, תמונות נלקחים ב ההתחלה ואת הסוף של ניסוי בעזרת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, היכולות ההעברה של תאים מוערכות על-ידי סגירת פצעי. עם זאת, תנועת התא הוא תופעה דינמית, שיטה המקובלת אינה מאפשרת מעקב אחר תנועה תא בודד. כדי לשפר את מבחני ריפוי פצע הנוכחי, אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לחיות תאים לעקוב אחר נדידת תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע את קצב ההעברה תא מבוססת על תא מערכת מעקב ומספק הבחנה ברורה בין נדידת תאים והתפשטות תאים. . הנה, נדגים את השימוש הדמיה לחיות תאים של ריפוי פצע מבחני ללמוד על היכולות ההעברה שונה של תאי אפיתל כנגד השד מושפע הנוכחות של TIP60. כמו תא תנועתיות הוא דינמי מאוד, השיטה שלנו מספק יותר תובנות תהליכי ריפוי מאשר תמונה של סגירת הפצע שצולמו באמצעות טכניקות הדימות המסורתי המשמש עבור מבחני ריפוי פצע הפצע.

גנרל סכימה של תא מבוססת הדמיה לחיות תאים ההעברה Assay איור 1A הוא סכימה של פרוטוקול זה. MCF10A תאים transfected עם siControl הראו מורפולוגיה אפיתל טיפוסי. לאחר דלדול של TIP60, תאים MCF10A היו mesenchymal יותר בהשוואה לתאי בקרה (איור 1B).
בחינת יעילות תמונות ציפורים TIP60 איור 2 מציג את היעילות תמונות ...

כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את ההשפעות של דילול גנים ספציפיים מרכזיים על נדידת תאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנושא גרורות סרטניות, כגון נדידת תאי סרטן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנטר את נדידת התאים הדינמית בזמן אמת.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר צפינו בשינויים במורפולוגיה של התאים בעקבות השפעת TIP60, מדכא גידולים. התחילו בהזרעה של מיליון תאי אפיתל של השד בשלושה מיליליטר של מצע גידול לכל צלחת בנפח 10 סנטימטר.נערה ידנית את שתי הצלחנות כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן אחיד לפני הנחתן באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius. לאחר שש שעות, החליפו את העל-נוזל (supernatants) בשמונה מיליליטרים של מצע גידול טרי לכל צלחנה והחזירו את התרביות לאינקובטור. למחרת בבוקר, החליפו את העל-נוזל בשלושה מיליליטרים של מצע גידול טרי לכל צלחנה והוסיפו מנה שנייה של תערובת SIRNA לתרבית התאים הניסויית, כפי שהודגם זה עתה, תוך ניעור הצלחנה כדי להבטיח שהריאגנטים מעורבבים באופן מלא לפני החזרת התאים לאינקובטור.לאחר שש שעות, החליפו את העל-נוזלים בשמונה מיליליטרים של מצע גידול טרי והדגירו את התרביות למשך הלילה. ביום השלישי, שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטרים של BPS לכל צלחת, ונתקו את התאים בשתי הצלחות באמצעות מיליליטר אחד של tripson EDTA לכל צלחת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 °C. בסיום הדגירה, עצרו את התגובה עם ארבעה מיליליטרים של מצע גידול מלא לכל צלחת.יש להשHיב את התאים באמצעות פיפטינג ולהעביר את תרחיפי התאים למבחנות נפרדות של 15 מיליליטר. אספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה והשִיבו את המשקעים בחמישה מיליליטר של מצע ללא סרום למבחנה. לאחר ספירה, דללו את שני תרביות התאים לריכוז של 600,000 תאים למיליליטר והוסיפו 500 מיקרוליטר של תאים מכל תרבית לבאר אחת בלוח של 24 בארות כדי להבטיח 100% confluency.לאחר זריעת כל התאים, נענעו בעדינות את הפלטה קדימה ואחורה ומצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד, והכניסו את הפלטה לאינקובטור לתרביות תאים למשך 24 שעות. כדי לבדוק את יעילות השקיעה (knock down) של הגן הנבדק, אספו את התאים שנותרו במבחנות האיסוף באמצעות סנטריפוגה נוספת, ובודדו את ה-RNA מהמשקעים באמצעות ריאגנט מסחרי, בהתאם להוראות היצרן, לצורך הערכה ב-PCR כמותי בזמן אמת (real time quantitative PCR). למחרת בבוקר, לפחות שעה אחת לפני תחילת הדמיית התאים החיים, הפעילו את המיקרוסקופ ואת בקרת הטמפרטורה.כוון את הטמפרטורה ל-37 °C ואת אספקת הגז פחמן דו-חמצמאי ל-5%. כאשר התא הגיע ל-37 °C, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast) כדי לוודא שהתאים נמצאים במצב של התמזגות (confluent) ומודבקים באופן מלא לתחתית הבארות. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפט של 200 µL כדי לשרוט בעדינות קו ישר לאורך כל מרכז הבארה, ושטוף בעדינות את כל הבארות חמש פעמים עם מצע ללא סרום כדי להסיר את התאים שהסתיירו. לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 1 mL של מצע ללא סרום לכל בארה.הניחו את הפלטה על במה המיקרוסקופ תחת עדשה בעוצמה של 10 והכווירו את האור הנפלט לעיניות במקום למצלמה. התאימו את הפוקוס באופן ידני כדי לאתר כל פצע ואת התאים שסביבו. לאחר מכן, החזירו את האור הנפלט למצלמה והשתמשו במערכת לצפייה בתאים חיים כדי לסמן את מיקומי הפצעים ולהגדיר את תנאי הזמן.צלמו את התאים למשך תקופת הניסוי המתאימה, ולאחר מכן פתחו את סרטון ה-avi הראשון בתוכנת ההדמיה המתאימה ופתחו את התוסף m track j. לחצו על לשונית add כדי להוסיף עקיבה עבור תאים בודדים, ובחרו תא אחד בקצה החזית הפולשנית ותא אחד המסוגל לנדוד באופן עצמאי. עקבו אחר תנועת התאים הנבחרים בסרטון באמצעות mtrackJ כדי למפות את מסלול נדידתם.לאחר מכן, לחצו על לשונית המדידה (measure) כדי למדוד את מרחק תנועת התאים ושמרו את הסרטונים עם העקבות בפורמט avi. לאחר דילול של TIP60, תאי אפיתל השד הם מזנכימליים יותר בהשוואה לתאי ביקורת שהוצמחו בתרבית. ואכן, ביטוי TIP60, כמו גם ביטוי של מולקולת היצמדות של תאי אפיתל, פוחת באופן משמעותי לאחר טיפול ב-siTIP60.מצד שני, הביטוי של גנים מניעים ספציפיים של מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי עולה בעקבות דילול של TIP60. הדמיה חיה של תרביות התאים לאחר יצירת פצע מעידה על נדידה מהירה יותר של תאים שעובדו עם siTIP60, בהשוואה לתרביות siControl, כאשר נצפתה עלייה משמעותית באחוז התאים הנודדים בתגובה לדילול TIP60. יתרה מכך, תאי siControl נעים כגיליון, בעוד שבתוך תרביות siTIP60 נצפתה תנועה מרובה יותר של תאים בודדים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בטכניקת דימוי תאים חיים למעקב אחר שינויים דינמיים של נדידת תאים.

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

כאן, אנו מתארים שיטה של מיקרוסקופיה ארוכת טווח כדי לעקוב לאורך תאים בודדים בתגובה לטיפולים אנטי-סרטניים.

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

במאמר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול המתאר שיטה in vivo למדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל (MCF-7TXT). בשיטה זו משתמשים במערכת הדמיה של מיקרוסקופיה דה-קונבולוציה כדי לזהות את הביטוי של GFP-tubulin בתאי מטרה.

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

חקור נדידת תאים בזמן אמת בתאי אפיתל השד MCF10A לאחר דלדול TIP60 באמצעות הדמיה חיה. שיטה זו מאפשרת ניטור דינמי של תנועת תאים בודדים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני מתastasis בסרטן.

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

גלה סרטונים נוספים