Name: עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: למדו כיצד לגרום לנזק רטינלי ממוקד באמצעות לייזר בדג זברה ולעקוב אחרי תהליכי ההתחדשות התאית בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הריפוי הרשתתי בדגם בעלי חיים זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מרטין Zinkernagel, MD, PhD, מרים Reisenhofer, PhD לקלט המדעי שלה להקים את הדגם ואת Federica Bisignani לסיוע טכני מעולה שלה.

כל ניסויים דבקה ההצהרה עבור שימוש של בעלי החיים לרפואת עיניים ומחקר החזון של האגודה לחקר רפואת עיניים (ארוו) וחזון ולכבד את תקנות הקשורות מרשויות השלטון-
 1. חיות <ol><li>לשמור על TgBAC (gfap:gfap-GFP) זן (אלב) 167 דג זברה בגילאי 6-9 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורת 26.5 ° C עד 18/כהה מחזור 18 14/10 h.</li>
	<li>עקוב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי חיים לאחר אישור על ידי הרשויות הממשלתיות.</li>
</ol> 2. הרדמה מערכתית הפיך <ol><li>להכין הפתרון מניות של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate מלח (tricaine) על ידי המסת 400 מ ג של אבקת tricaine ב mL 97.9 מיכל מים ו- 2.1 מ של 1 מ' של טריס buffered תמיסת מלח (TBS). התאם ל pH 7.0 מ' 1 טריס (pH 9), חנות-4 מעלות צלזיוס עד חודש אחד כהה. 
	הערה: Tricaine צריך להיות מוכן בתוך המים כמו תנאי המחייה הטבעי של החיה, רצוי להשתמש המים במיכל המקורי.</li>
	<li>לדלל את הפתרון מניות 1:25 בתוך מיכל המים ולהשתמש מיד.</li>
	<li>למקם את דג זברה 10 ס מ פטרי המכילות 50 מ של הרדמה פתרון עד שהם הופכים משותק אינם מגיבים לגירויים חיצוניים (כ 2-5 דקות, תלוי משקל וגיל).</li>
	<li>להעביר כל דג בעבודת יד בעל פין סיליקון בהזמנה אישית עבור טיפול לייזר ( איור 1 א'). 
	זהירות! הדג יכול להישאר anesthetized מחוץ למיכל עבור עד 10 דקות בלבד-</li>
	<li>להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה, למקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.</li>
	<li>כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.</li>
</ol> 3. לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית הערה: א 532 ננומטר דיודת לייזר משמש כדי ליצור מוקד נזק האור על הרשתית של דג זברה. הסידור ניסיוני של הלייזר מאפשר הקמת פגיעה ברשתית מוקד לשחזור של דג זברה בוגרת.
<ol><li>להגדיר את הפלט עוצמת הלייזר: 70 mW; קוטר אווירי: 50 מיקרומטר; משך פעימה: גב' 100 זהירות! השימוש של אור לייזר דורש הגנה אישית המתאימה וסימון של האזור.</li>
	<li>להחיל 1-2 טיפות של 2% hydroxypropylmethylcellulose topically בעיניים לפני הטיפול ולהשתמש 2.0 מ מ הפונדוס לייזר העדשה למקד את קרן הלייזר-מכוון על הרשתית- 
	זהירות! hydroxypropylmethylcellulose טיפות צמיגה, עלול לגרום לבעיות נשימה, אם זה ממשיך הזימים.</li>
	<li>מקום ארבעה כתמים בלייזר סביב עצב הראייה בצד השמאל העין ולהשתמש העין נכון, לא מטופל כמו בקרה פנימית-</li>
</ol> 4. אין ויוו הדמיה של המורפולוגיה רשתית <ol><li>ביום 0, להמחיש הרשתית דג זברה ישירות לאחר אינדוקציה לייזר בלי להחיות אותם מן ההרדמה. נקודות פעם כל אחרות, מעסיקים הרדמה כללית (ראה סעיף 2: הרדמה מערכתית הפיך). מניחים את דג זברה קיבוע על בעל פין סיליקון בהזמנה אישית ( איור 1 B, B.1).</li>
	<li>כדי לקבל תמונות אופטימלית, חתך עדשות מגע הידרוג זמינים מסחרית כדי להתאים את עין דג זברה (Ø = 5.2 מ מ, r = 2.70 מ מ, עובי מרכז = 0.4 מ מ) על-ידי אגרוף חור. למלא את השטח קעורה של העדשה methylcellulose ומניחים אותו על פני הקרנית.</li>
	<li>לצייד את המערכת OCT עם עדשה מנורה ללא מגע שסע 78D.</li>
	<li>למקד את התמונה אינפרא-אדום (IR) ב- IR + מצב OCT ( איור 2 א) כדי להמחיש את הפונדוס של העין ולקחת IR תמונות על ידי לחיצה &#34; ידרשו &#34; לחצן ( איור 2B) כדי להתאים לשפה כתמים על הרשתית באמצעות המערכת לייזר &#39; תוכנה s.</li>
	מצב <li>Visualize מקטע תלת מימדי של השכבות ברשתית IR + OCT ולקחת את התמונות על ידי לחיצה &#34; ידרשו &#34; לחצן ( איור 2B). לצפות את חומרת פגיעה בשכבה הגרעינית החיצונית (גרת) (ר' סעיף 3: לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית) בתמונות האלה.</li>
	<li>להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה של מקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.</li>
	<li>כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.</li>
	<li>לבצע דומה ויוו הדמיה של מורפולוגיה רשתית על יום 1, 3, 7, 14 ושבוע 6-</li>
</ol> 5. Hematoxylin &#38; אאוזין (H &#38; E) Staining <ol><li>המתת חסד דג זברה על ידי צלילה אל תוך קר (4 ° C) פתרון הרדמה על קרח לפחות 10 דקות, enucleate העיניים מיד על ידי אמצעי מלקחיים קטנים מעוקלים.</li>
	<li>לתקן את העיניים כל ב- 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עבור 20 h, ואז מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול מדורגת (קסילן 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 96% למשך 3 דקות פעמיים, אתנול 70% 3 mi n פעם אחת). 
	זהירות! מחברים יכול להיות מעצבן העיניים, האף, המסלול בדרכי הנשימה העליונות. כדורגלן הוא חומר מסרטן ידוע אנושי, סיכון הרבייה חשד.</li>
	<li>להטביע את הדגימות פרפין, לחתוך קטעים 5 מיקרומטר ברמה של ראש עצב הראייה, לטעון אותם בשקופיות זכוכית-</li>
	<li>כתם הסעיפים deparaffinized 0.1% חומצה hematoxylin פתרון עבור 5 דקות וטבול את השקופיות פעמיים במים מזוקקים לאחר טובלים את השקופיות בתמהיל חומצה הידרוכלורית (2 מ ל 25% מזוקקים HCl ב 250 מ ל מים) ו אמוניה לערבב (2 מ ל 25% אמוניה ב 250 מ ל מים מזוקקים). כתם הסעיפים עם אאוזין גרם תמיסה מימית 0.5% למשך 3 דקות לאחר התפתחות hematoxylin צביעת על-ידי מי ברז במשך לפחות 10 דקות</li>
	<li>הר השקופיות מיובש שרף אקרילי הרכבה בינונית ולבחון את השקופיות במיקרוסקופ אור.</li>
</ol> 6. אימונוהיסטוכימיה עבור ההפעלה MC <ol><li>לחמם הסעיפים deparaffinized במאגר אנטיגן אחזור (טריס-EDTA + דטרגנט ללא יונית 0.05%, pH 9.0) למשך 3 דקות של דוד אידוי מזון המתאים או במיקרוגל למשך 10-15 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם TBS עבור 5 מינימום לכל.</li>
	<li>מעגל הסעיפים עם סיליקון עט ולהוסיף 100 µL חסימת פתרון (TBS + סרום נורמלי עז 10% + 1% אלבומין שור, pH 7.6) בטמפרטורת החדר במשך ה 1</li>
	<li>הכתם עם נוגדנים polyclonal של הארנב אנטי-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) ועם נוגדנים חד שבטיים של העכבר המעביר אנטי-גלוטמין (אלף), שניהם לדילול 1:200 (40 µL עבור דגימה). דגירה השקופית בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. תשטוף שלוש פעמים עם TBS + 0.1% 20 Tween למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>סיום ויזואליזציה עם המתאים נוגדנים משניים. פרוטוקול זה משמש ארנב נגד עז IgG H &#38; L ירוקה נוגדנים משניים עבור GFAP ועכבר נגד עז IgG H &#38; L אדום בהיר עבור GS, שניהם לדילול שבערך בטמפרטורת החדר במשך ה 1</li>
	<li>הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל דאפי ולבחון את השקופיות תחת המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

התחדשות/ניוון הרשתית דג זברה נחקר על ידי גישות שונות כגון מוות תא בתיווך cytotoxin22, פגיעה מכנית23פציעה תרמי24. אנחנו מועסקים 532 ננומטר דיודת לייזר לפגיעה ברשתית דג זברה. ובכך, המודל שלנו מציע מספר יתרונות. למשל, במהירות יצרנו אזור מוגדר היטב של פגיעה מקומית הרשתית החיצונית, במיוחד ברובד PRs. יתר על כן, ניתן לשנות את הגדרת ניסיוני לייצר אזורים גדולים של נזק ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים, לדוגמה, על-ידי פגיעה ממברנה של ברוך לזירוז neovascularization...

החזון הוא כנראה תחושת החיוניות ביותר של האדם, ליקוי שלה יש השפעה סוציו-אקונומי גבוה. בעולם המתועש, מחלות ניווניות של הרשתית חשבון עבור הרוב המכריע של אובדן ראייה ועיוורון בקרב אוכלוסיית הבוגרים1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הגורם תורשתית השכיחה ביותר לעיוורון בקרב אנשים בין הגילאים 20-60, להשפיע על 1.5 מיליון אנשים ברחבי העולם2,3. זה משפחה הטרוגנית של הפרעות רשתית תורשתיות מאופיין על ידי אובדן הדרגתי של photoreceptors (PRs) ואחריו ניוון של אפיתל הפיגמנט ברשתית, לאחר מכן, gliosis ובניה של נוירונים הפנימית4. הקורס של המחלה יכולה להיות מוסברת על ידי אובדן מצטבר שני סוגי יחסי ציבור תא, מתחיל בדרך כלל עם מוטות, אשר אחראים על חזון אכרומטי אור עמום, קונוסים, המהווה מרכיב חיוני עבור צבע חזון, חדות הראייה5. פגם גנטי יחיד מספיקה לגרום RP. עד כה יותר מ-130 מוטציות בגנים מעל 45 קושרו עם מחלת6. זה מוביל פנוטיפים מחלות בדרגות שונות, היא אחת הסיבות לכך ריפוי גנטי שאינו להכליל ובכך גישה טיפולית מסובכים. לכן, יש צורך דחוף לפתח גישות טיפוליות כללי חדש לטיפול degenerations רשתית במסנוור מחלות.
ניוון הרשתית לעתים קרובות כרוך אובדן יחסי ציבור; לכן, מוות של תאים PR הוא סימן היכר של התהליכים ניווניות הרשתית7. זה כבר הוכח כי מוות של תאים יחסי ציבור מעוררת מולר עכשיו, דונלד תא (MC) הפעלת והתפשטות8. MCs, הסוג של תא גליה הגדולות ב הרשתית חוליות, נחשבו בעבר להיות לא יותר מאשר "דבק" בין הנוירונים ברשתית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הראו כי MCs לפעול כתמיכה יותר מבני גרידא9. בין הפונקציות השונות, MCs להשתתף גם נוירוג'נסיס ותיקון10. אכן, בתגובה גורמים diffusible של הרשתית המתנוונת, MCs להגדיל באופן משמעותי ביטוי חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). לכן, GFAP תוויות יכול לשמש כסמן להפעלה MC כתגובה משני פגיעה ברשתית, ניוון11.
לאחרונה, פיתחנו עיבוד הרומן של פגיעה נקודתית באמצעות לייזר לזירוז ניוון רשתית בדג זברה (רזבורה rerio). פגיעה נקודתית יש יתרון ללימוד תהליכים ביולוגיים מסוימים כגון ההעברה של תאים לתוך האתר פצוע ותזמון מדויק של האירועים המתקיימים במהלך התחדשות ברשתית12. יתר על כן, דג זברה הפך חשוב במחקר חזותי בגלל הדמיון בין מערכת הראייה שלה וגם של בעלי החוליות. תכונות היסטולוגית מורפולוגיים ברוטו של האדם ושל teleost retinae להציג כמה הבדלים. בהתאם, retinae האדם, דג זברה מכילים את אותן הכיתות תא מרכזי שאורגן אותו דפוס בשכבות, איפה אור חישה photoreceptors לכבוש את השכבה החיצונית ביותר, בעוד הנוירונים ברשתית הקרנה, תאי גנגליון, שוכנים לנגדו שכבת עצביים, מקורב על העדשה. את interneurons ברשתית, אמקרין, הפרעה דו קוטבית, תאים אופקיים, להתאים בין קולט אור, גנגליון תא שכבות13. יתר על כן, הרשתית דג זברה הוא נשלט-חרוט, ולכן קרוב יותר הרשתית האנושית מאשר, למשל, הרשתית מכרסמים למד באופן אינטנסיבי. הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא נוירוג'נסיס מתמיד דגים רשתית, חידוש ברשתית לאחר נזק. דג זברה, MCs יכול dedifferentiate, לתווך התחדשות רשתית נפצעו14,15. עוף, MCs יש יכולת גם להזין מחדש את מחזור התא, dedifferentiate. בעקבות פגיעה ברשתית בדגים הבוגרים, MCs לאמץ מאפיינים מסוימים של קדמון, תאי גזע, להגר ברשתית הרקמה הפגועה, לייצר נוירונים חדשים16. ג'ין ביטוי פרופיל של MCs יונקים חשף דמיון לא צפוי אבות ברשתית, וגדל ראיות על הפוטנציאל neurogenic מהותי של MCs עוף, מכרסם, רשתית העין האנושית אפילו17. ובכל זאת, למה התגובה משובי ציפורים, יונקים מושווה נמוך עם תגובת חזקים ב דגים הוא לא הבנתם. לכן, הבנת מנגנוני תיקון אנדוגני דג זברה יכול להציע אסטרטגיות עבור התחדשות ברשתית מגרה יונקים ובבני אדם. העסקת מנגנון תיקון אנדוגני של MCs כמכשיר טיפולי לטיפול של חולים עם ניוון הרשתית תהיה השפעה יוצאת דופן בחברה שלנו.
במסמך זה, אנו מספקים את השלבים הנחוצים להפיכת להעסיק את המודל ניוון/התחדשות במחקר אופטלמולוגיות. אנחנו התמקדנו קודם גרימת נזק מוקד ברשתית neurosensory, ואז על ההדמיה של אירועים פיתוח אתר הפציעה, ו סוף סוף להמחיש במעורבות MCs סמוכים. פרוטוקול כללי קל יחסית לבצע ופותח מגוון רחב של אפשרויות להערכת הרשתית לאחר מכן.

<table><tbody><tr><td>תמיסת המטוקסילין חומצה</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץ</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץ</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>דאקו פן</td><td>דקו, גלוסטרופ, דנמרק</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור, ברלינגיים, קליפורניה, ארה"ב</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G תמיסה מימית 0.5%</td> <td>Carl Roth, ארלסהיים, שוויץ</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG H& L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, צוג, שוויץ</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, צוג, שוויץ</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>עז סרום רגיל</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>עדשות מגע הידרוג'ל</td><td>Johnson & Johnson AG, צוג, שוויץ</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td> <td>OmniVision, נויהאוזן, שוויץ</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr> <tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>A5040</td><td>טריקאין, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, אוברקוכן, גרמניה</td><td>n.a.532</td> <td>ננומטר</td></tr><tr><td>עכבר לייזר נוגדן חד שבטי נגד GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, ארה"ב</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT מערכת הדמיה</td><td>היידלברג הנדסה, היידלברג, גרמניה</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>היידלברג הנדסה, היידלברג, גרמניה</td><td>n.a.גרסה</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץ</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץ</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFAP נוגדן פוליקלונלי</td><td>Invitrogen, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק סיכת סיליקון</td><td>Huco Vision AG שוויץ</td><td>n.a.חתוך</td> <td>ביד ממחצלת סיכת סיליקון של מגש העיקור בהתאם.</td></tr><tr><td>מנורת חריץ BM900</td><td>Haag-Streit AG, קניז, שוויץ</td><td>n.a.Slit</td><td></td></tr> <tr><td>lamp מתאם</td><td>Iridex Corp., מאונטיין וויו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>n.a.</td><td></td></tr> <tr><td>Superfrost Plus זכוכית שקופיות</td><td>Gehard Menzel GmbH, בראונשווייג, גרמניה</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB)</td><td>strain KIT, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris buffered מלח (TBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>עדשת מנורת חריץ ללא מגע 78D</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, ארה"ב</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>עדשת לייזר פונדוס עיניים</td><td>מכשירי עיניים, בלוויו, וושינגטון, ארה"ב</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., סאות'המפטון, בריטניה</td><td>R2100-EU</td><td>ספינת קיטור</td></tr></tbody></table>

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא הפוטנציאל לכל החיים של הרשתית teleost נוירוג'נסיס ברשתית, חידוש לאחר נזק חמור. חוקרים של מסלולים התחדשות של דג זברה עשוי להביא תובנות חדשות לפיתוח אסטרטגיות חדשניות לטיפול במחלות ניווניות ברשתית אצל יונקים. במסמך זה, התמקדנו אינדוקציה של פגיעה נקודתית אל הרשתית החיצונית בדג זברה למבוגרים באמצעות 532 ננומטר דיודת לייזר. פגיעה מקומי מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים המתרחשים במהלך ניוון הרשתית והתחדשות ישירות על האזור של נזק. באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית פולשני (אוקטובר), היינו מסוגלים להגדיר את המיקום של רגנרציה עוקבות אזור וצג פגום ויוו. אכן, OCT דימות מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה, חתך הרוחב של הרשתית דג זברה, מתן מידע אשר זמינים בעבר רק באמצעות ניתוחים היסטולוגית. על מנת לאשר את הנתונים בזמן אמת OCT, בוצעו מקטעים היסטולוגית, התגובה הרגנרציה לאחר אינדוקציה הפגיעה ברשתית נחקר על ידי אימונוהיסטוכימיה.

OCT בזמן אמת: על מנת לנתח את התפקיד של MCs תיקון ברשתית, השתמשנו מודל פגיעת לייזר גרימת אזור מוגדרים היטב היטב של פגיעה ברשתית דג זברה. האתר של נזק צולמה על-ידי OCT ויוו בפעם הראשונה (יום 0) בתוך 60 דקות לאחר הפגיעה (איור 3). כדי לפצות על המערכת האופטית של העין דגים, עדשות מגע מחוייט הונח על הקרנית. מיד לאחר טיפול לייזר, אות hyper-רעיוני ' מאטום לשקוף ' מקומי הרשתית החיצונית (חיצים). זה המורחבת של האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) השכבה החי...

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

המטרה הכללית של סרטון זה היא להדגים כיצד לנטר שינויים תאיים in vivo בעקבות נזק רשתית מוקדי שנוצר באמצעות לייזר בדגי Zebrafish. מודל זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנושא רגנרציה של הרשתית, כגון שינויים מורפולוגיים, קינטיקה וכן סוגי התאים המעורבים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות השראת פגיעה מוקדית, ניתן לחקור תהליכים ביולוגיים ישירות באתר הפגיעה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התחדשות רשתית של Zebrafish, ניתן ליישמה גם כדי לחקור את מנגנון התיקון במודלים שונים של בעלי חיים. הכינו תמיסת מלאי של חומר הרדמה על ידי המסה של 400 milligrams של אבקת tricaine ב-97.9 millimeters של מיכל דגים, ו-2.1 millimeters של TBS בריכוז one molar. התאימו ל-pH 7.0 באמצעות tris בריכוז one molar ב-pH 9.להכנת תמיסת העבודה, דללו את תמיסת המלאי של ה-tricaine ביחס של 1 ל-25 במי מיכל והעבירו 50 milliliters לצלוחית פטרי. לאחר מכן, הניחו את דגי הזברה בתמיסת ההרדמה למשך שתי עד חמש דקות, עד שיהיו חסרי תנועה ולא יגיבו לגירויים חיצוניים. העבירו כל דג ידנית למחזיק סיליקון ייעודי לטיפול בלייזר.הרדמה מתאימה היא קריטית לרווחת בעל החיים ולהצלחת הפרוצדורה. לכן, הכנת תמיסת tricaine טרייה היא חיונית, והזמן מחוץ למים לא יעלה באופן משמעותי על 10 דקות. הגדירו את הספק הפלט של הלייזר בעל אורך גל של 532 nanometer ל-70 milliwatts, את משך הפולס ל-100 milliseconds, ואת הקוטר השטחי ל-50 microns.לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת עד שתיים של 2% hydroxypropyl methylcellulose לעין. בעת יישום ה-methylcell לעין, ודאו שהתמיסה הצמיגית אינה חודרת לזימים. לאחר מכן, השתמשו בעדשת לייזר קרנית (fundus laser lens) של 2 millimeter כדי למקד את קרן הכיוון של הלייזר על הרשתית.מקמו ארבע נקודות לייזר מסביב לעצב האופטי בעין שמאל, והשתמשו בעין ימין, שאינה מטופלת, כביקורת פנימית. מיד לאחר ההשראה בלייזר, הניחו את דג הזברה, שעדיין נמצא תחת הרדמה, על מחזיק סיליקון ייעודי עם פינים באזור הדימות. כדי להשיג תמונות אופטימליות, גזרו עדשת מגע מהידרוג'ל הזמינה מסחרית כך שתתאים לעינו של דג הזברה באמצעות מחורר נייר.מלאו את המשטח הקעור של העדשה במתילצלולוז, ולאחר מכן הניחו אותה מעל הקרנית. ציידו את מערכת ה-optical coherence tomography בעדשת מנורת סדק ללא מגע מדגם 78D. התמקדו בתמונה האינפרא-אדומה במצב IR plus OCT כדי להדמיות של קרקית העין.לאחר מכן, צלם תמונות IR על ידי לחיצה על כפתור ה-acquire כדי לאתר את נקודות הלייזר ברשתית. לאחר מכן, הדמיין חתך תלת-ממדי של שכבות הרשתית במצב IR plus OCT, וצלם את התמונות על ידי לחיצה על כפתור ה-acquire. בחן בתמונות אלו את חומרת הפגיעה בשכבה הגרעינית החיצונית (outer nuclear layer).כדי להפסיק את ההרדמה לאחר הטיפול וההדמיה, העבירו את דגי הזברה למיכל המכיל מי אקווריום. כדי לסייע בהתאוששות, צרו זרימה של מי אקווריום רעננים מעל הזימים על ידי הנעת דגי הזברה קדימה ואחורה במים. מיד לאחר הטיפול בלייזר, אות היפר-רפלקטיבי מפוזר אותר ברשתית החיצונית.הוא השתרע מהאפיתל הרטינלי הפיגמנטרי ועד לשכבה הפלקסיפורמית החיצונית. האות ההיפר-רפלקטיבי הדיפוזי אינו קיים ברשתית של עין הבקרה שלא נפגעה. אות היפר-רפלקטיבי דיפוזי דומה זוהה ביום הראשון לאחר הפגיעה.לאחר היום השלישי, אות דיפוזי זה הפך למאורגן וצפוף יותר. הוא נראה בעקביות בשכבה הגרעינית החיצונית, והתרחב אל שכבת הפוטורצפטורים. לאחר השבוע הראשון, חלה ירידה משמעותית בגודל הממוצע של הנגע, וזוהה רק אות היפר-רפלקטיבי קטן.החל מהיום ה-14 ועד לנקודת הזמן המאוחרת ביותר שנבדקה, נקודות הלייזר לא היו נראות יותר בתמונות IR ו-OCT, ומורפולוגיית הרשתית דומה לצד הביקורת, כפי שנראה כאן. צביעת H&E שימשה לבחינת ההיקף והקינטיקה של דגנרציה ורגנרציה של הרשתית. תמונה זו מציגה את נתח הביקורת.תמונה זו מציגה צביעת H&E שלושה ימים לאחר הפגיעה, כאשר אובדן הפוטורספטורים המקסימלי ניכר. בוצע אימונוהיסטוכימיה להדמיית סמני תאי גליה: glutamine synthetase, באדום, ו-glial fibrillary acidic protein, בירוק. תמונה זו מציגה רשתית של ביקורת שבה נצפית פלואורסצנציה ירוקה מועטה מאוד, המעידה על GFAP.אות ה-GFAP עלה ביום השלישי לאחר הפגיעה, בעוד שאות הגלוטמין סינתטז (glutamine synthetase) האדום נותר ללא שינוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיית פוטונים כפולים, וכן אנליזה תאית ומולקולרית, כדי לחקור את מעורבותם של תאים מולקולריים במנגנוני תיקון אנדוגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה כיצד להשרות נזק מוקדי ברשתית של דג הזברה ולנטר in vivo את התהליכים הניווניים והרגנרטיביים הבאים.

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים הליך לגרימת ניוון רשתית בדגי זברה בוגרים באמצעות פגיעה בלייזר. הלייזר מכוון לתאים קולטי אור ברשתית, וגורם למוות תאי ולתהליך ניווני. נזק זה מפעיל תאי גליה מולר (MG), מה שמוביל להתמיינותם לאבות תאי גזע המסייעים בהתחדשות הרשתית.

מידול ניוון והתחדשות הרשתית בדגי זברה באמצעות פגיעת לייזר מוקדית

מקור: Lahne, M., et.al. תרבית של צמחי רשתית של דג זברה טרנסגני בוגר להדמיית תאים חיים על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדמיה של תא חי של נדידת גרעין גליה של מולר באקספלנטים של רשתית דג הזברה המשובץ באגרוז בעקבות נזק לקולטני אור המושרה על ידי אור. גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) המשתחרר על ידי קולטני אור פגומים מפעיל תאי גליה של מולר, ומפעיל נדידה גרעינית דרך השכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות למיטוזה ויצירת אבות עצביים. התמונות שצולמו חושפות את הדינמיקה של הגירה...

הדמיית תאים חיים של נדידת גרעין גליית מולר במהלך התחדשות רשתית דג הזברה

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

מניפולציות ממוקדות לגרימת מתח מכוון או מוות בתאים בודדים היו קשות יחסית לביצוע. כאן, מתוארת גישת אבלציה ברזולוציה של תא יחיד ללחץ סלקטיבי ולהרוג תאים בודדים בתרבית תאים ובבעלי חיים על בסיס לייזר UV קונפוקלי סטנדרטי.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

למדו כיצד לגרום לנזק רטינלי ממוקד באמצעות לייזר בדג זברה ולעקוב אחרי תהליכי ההתחדשות התאית בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הריפוי הרשתתי בדגם בעלי חיים זה.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

גלה סרטונים נוספים