הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להכין הידרוג'ל צ'יטוזן להזרקה לתרבית תאים תלת מימדית לשימוש בסופו של דבר בטיפולים טיפוליים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות בתחום ההידרוג'ל המרפא את עצמו, כגון כיצד להכין הידרוג'ל לריפוי עצמי על ידי טבילה לאורך כל הדרך וכיצד להשתמש בו לתרבית תאים תלת מימדית. היתרון שלי בטכניקה זו הוא, על ידי ריפוי עצמי תואם ניתן להכין הידרוג'ל בצורה פשוטה מאוד, ושימוש בתרבית תאים תלת מימדית.

הידרוג'ל זה ניתן גם להזרקה, כך שהוא יכול לשמש כנשא לטיפול תאי. כעת מר יונגסאן לי יראה לך כיצד להכין את ההידרוג'ל וכיצד לבצע את תרבית התאים התלת מימדית באמצעות הידרוג'ל זה. יונגסאן לי הוא סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו.

כדי להכין את ההידרוג'לים, ראשית מסנתזים DF PEG. במכסה אדים שוקלים ארבעה גרם של 4,000 PEG במשקל מולקולרי לבקבוק תחתון עגול, ומוסיפים 100 מיליליטר טולואן. ואז, כדי להמיס את הפולימרים, יש לחמם את התמיסה.

לאחר שכל הפולימרים מתמוססים, השתמש במאייד כדי להסיר את כל הממיסים. לאחר מכן, חזור על תהליך ערבוב הטולואן ואידויו פעמיים נוספות להכנת פולימרי ה-PEG היבשים. לאחר מכן, בעזרת מערבל מגנטי ו -100 מיליליטר DHF, ממיסים את הפולימרים.

לאחר מכן, ממיסים 0.9 גרם של 4-Carboxybenzaldehyde לתמיסה. לאחר מכן, ממיסים 0.07 גרם דימתילאמינופירימיד לתמיסה. כעת הוסף 1.25 גרם DCC בצינור ייבוש מלא בסידן כלורי נטול מים.

כעת אפשר לתגובה לערבב בטמפרטורת החדר למשך כ -12 שעות. למחרת, השתמש ב-500 מיליליטר של אתר דיאתיל קר כדי לזרז את המוצקים הלבנים, והשתמש בסינון ואקום כדי לאסוף את המוצקים. השליכו את המומס וייבשו את המוצקים תחת אוורור טוב.

לאחר מכן, ממיסים את המוצקים הלבנים ב-100 מיליליטר THF. יש לסנן את כל המוצקים הלבנים הבלתי מסיסים לפני שתמשיך. כעת זרז את המוצקים המומסים באמצעות אתר דיאתיל קר טרי.

לאחר מכן השתמש בסינון ואקום כדי לאסוף את המוצקים, ותן להם להתייבש שוב. חזור על תהליך זה פעמיים-שלוש, ולאחר מכן הכניס את המוצקים הלבנים לתנור ייבוש בוואקום לייבוש מלא. האבקה הלבנה המתקבלת היא המוצר הסופי: DF PEG עם סיומת בנזלדהיד.

כדי לעטוף את התאים בהידרוג'ל לצורך תרבית, יש להמיס תחילה 0.44 גרם של DF PEG לשני מיליליטר של מצע גידול תאים בצינור של ארבעה מיליליטר. מערבלים את התערובת לתמיסה של 20% לפי משקל. לאחר מכן, עקר את הפתרון.

טען אותו למזרק של 10 מיליליטר, ולחץ אותו דרך מסנן שומר חיידקים של 0.22 מיקרון. כעת מערבבים 0.165 גרם של גליקול-צ'יטוזן עם ארבעה מיליליטר של מצע תרבית תאים, תוך שימוש במערבולת ליצירת תמיסת צ'יטוזן של 4% לפי משקל. לאחר מכן, עקר את התמיסה באמצעות מסנן נוסף של 0.22 מיקרון לשימור חיידקים.

לאחר מכן, קצרו את התאים, כגון תאי L929 באמצעות טריפסין. שטפו את התאים שנאספו, והשעו אותם במדיה ב-3.75 מיליון תאים למיליליטר. בשלב הבא התאים נטועים במטריצה תלת מימדית.

ביצוע הצעדים הללו במדויק הוא קריטי כדי לייצר הצלחה. כעת מערבבים 0.4 מיליליטר מתרחיף התא עם 0.4 מיליליטר תמיסת צ'יטוזן באמצעות מערבולת. הכניסו את התערובת הזו למרכז צלחת פטרי בקוטר שני סנטימטרים, והכניסו 0.2 מיליליטר מתמיסת DF PEG לתוך הצלחת.

לאחר מכן, השתמש בצנרת עדינה כדי לגרום להיווצרות ההידרוג'ל. העריכו את היווצרות ההידרוג'ל על ידי הטיית הצלחת והתבוננות בצמיגות התמיסה. כדי לבדוק את יכולת ההזרקה של התאים העטופים, הכינו את אותו תכשיר במזרק של 10 מיליליטר.

לאחר מכן, לאחר היווצרות ההידרוג'ל, הוציאו לאט את ההידרוג'ל דרך מחט בגודל 48 לתוך צלחת הפטרי. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מצע תרבית לתערובת תאי ההידרוג'ל בצלחת, והעביר את הצלחת לחממה לתרבית. כל יומיים, החליפו את המדיה, וכסו את תרבית תאי ההידרוג'ל התלת-ממדית.

כדי להכין את התאים העטופים בהידרוג'לים להדמיה, יש לשטוף תחילה את ההידרוג'לים במיליליטר אחד של PBS פעמיים. לאחר מכן, צבעו את ההידרוג'לים בתמיסת פלואורסצאין-דיאצטט ותמיסת יודיד פרופידיום. שכבו 0.5 מיליליטר משתי התמיסות על ההידרוג'ל, ודגרו על ההידרוג'ל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה הקצרה עם תמיסות הכתמים, שאפו את כל הממיסים. כעת צפו בהידרוג'לים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, עם עירור ב-488 ננומטר לצפייה בתאים חיים, ועירור ב-543 ננומטר לצפייה בתאים מתים. אסוף ערימות תמונות עם פרוסות של שני מיקרון כדי לאמת את התפלגות התאים בהידרוג'ל.

תאי L929. קו תאים טיפוסי של עכבר-פיברגלס עם קשיחות רקמה בסביבה in-vivo של כ-5,600 פסקל היו עטופים בהידרוג'ל. הכדאיות שלהם הייתה גבוהה מאוד לאורך תהליך התרבית, והם השיגו צפיפות תאים יוצאת דופן.

לאחר שבעה ימים של תרבית בהידרוג'ל, מספר התאים גדל ב-200%הידרוג'לים שנפלטו לצלחת תרבית התאים שלהם דרך מחט בגודל 48 יכלו לרפא את עצמם כדי לתקן הידרוג'ל משולב לאחר כשעה. לאחר שבעה ימים בתרבית, תאים אלה גם התרבו באופן דרמטי. ניתן היה למצוא עדויות לאירועי ביקוע תאים שבהם חלק מהתאים נראו מחולקים לשניים.

בדיקת המת החי הראתה כדאיות גבוהה מאוד, והדגימה את התפשטות התאים המוצלחת בהידרוג'ל התלת-ממדי לאחר ההזרקה. קצב התפשטות תאים זה היה בערך 3/4 מזה של תאים שלא הוזרקו לאחר שבעה ימי תרבית. לכן, למרות שלכוח העצום במהלך ההזרקה יש השפעה שלילית מדידה, התאים שהוזרקו עדיין היו די מתרבים.

לאחר צפייה בסרטון זה עליכם לדעת כיצד להכין הידרוג'ל לריפוי עצמי וכיצד להשתמש בהידרוג'ל זה לתרבית תאים תלת מימדית וכיצד להעביר את התא עם הידרוג'ל זה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות ההליך הטוב ביותר, ניתן לבצע שיטה אחרת, כמו הזרקת in-vivo לטיפול בתאים או מתן תרופות.