Name: הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למד הכנת הידרוג'לים מבוססי כיטוזן להזרקה באמצעות כימיה דינמית של אימין. שיטה זו מאפשרת תרבות תאים תלת-ממדית עם תכונות התאוששות עצמית ליישומים ביורפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הלאומי למדע קרן של סין (21474057 ו- 21604076).

אזהרה: נא היוועץ כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. אנא השתמש נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע ניסויים בכימיה, כולל השימוש של הוד fume וכן ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות מגן, חלוק המעבדה, וכו '). הפרוטוקול מחייב תא רגיל בטיפול טכניקות (לחיטוי, שחזור תא, passaging תא, תא הקפאה, תא מכתים, וכד').
 1. הכנה של Hydrogels <ol><li>סינתזה של benzaldehyde הסתיים di functionalized פוליאתילן גליקול (DF PEG) <ol><li>לייבוש מראש של פג פולימר <ol><li>שוקל 4.00 ג'י פג (4,000 מגה-וואט, 1.00 mmol), להעביר את זה לתוך בקבוקון התחתון עגול (250 מ"ל), ולהוסיף טולואן (100 מ"ל). 
			הערה: אחרים יתדות עם משקולות מולקולרית שונים יכולים לעבוד על היווצרות הידרוג אך יוביל קשיחות שונות.</li>
			<li>מחממים את הפתרון על ידי אקדח חום (או פלטה בסביבות 40 ° C) במתינות כדי לעזור לפזר את כל פולימרים. לאחר כל פולימרים התמוססות, להשתמש של המאייד כדי להסיר את כל ממיסים. חזור על זה התמוססות ותהליך יבש פעמיים כדי להפוך פג מיובשים פולימרים. 
			התראה: זו צריכה להתבצע בשכונה fume בזהירות מרבית. טולואן הוא דליק.</li>
		</ol></li> <li>Benzaldehyde התגובה סיום של פג <ol><li>להוסיף פגים ו tetrahydrofuran (THF, 100 מ ל) ל הבקבוק, להמיס פג באמצעות של בחישה. להוסיף 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6.0 mmol) ו- 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0.6 mmol) ברצף הפתרונות כדי להמיס כל מוצקים לחלוטין.</li>
			<li>הוסף N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol) לפתרון, ולהוסיף צינור ייבוש מלא CaCl נטול מים 2 הבקבוקון. לשמור את התגובה תחת ערבוב בטמפרטורת החדר (~ 20 ° C) במשך כ- 12 ח'</li>
		</ol></li> <li>פוסט-תגובה תהליך <ol><li>לסנן מוצקים לבן המופקים הפתרון על ידי ואקום בסיום התגובה. שופכים את הפתרון לתוך קר דיאתיל אתר (500 mL) תחת זע, כדי לזרז את מוצקים לבן. לאסוף את כל המוצקים לבן על-ידי מסנן ויבשה מוצקים בשכונה fume.</li>
			<li>יתמוסס מוצקים לבן THF שוב, לסנן מוצקים לבן לא מסיסים, שופכים את הפתרון לתוך טריים דיאתיל קר, כדי לזרז את מוצקים לבן, לייבש אותו. חזור על תהליך זה שתיים עד שלוש פעמים, ולאחר מכן מקם מוצקים לבן בתנור ייבוש ואקום (20 ° C, 0.1 mbar) כדי לייבש אותם לחלוטין. לאסוף את אבקה לבנה כמו המוצר הסופי: benzaldehyde הסתיים DF פג.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>הכנת hydrogels <ol><li>לשקול כמויות שונות של DF פג (0.11 גרם, 0.028 mmol גרם 0.22, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) צינור (10 מ"ל), להוסיף מים יונים (5.0 מ"ל) ולהשתמש למערבולת או פגים כדי לעזור להמיס הפולימר.</li>
		<li>לפזר משקם גליקול (0.495 ז, 6.18 x 10 -3 mmol) במים יונים (15.0 מ ל) צינור (50 מ"ל), והשתמש מערבולת לכמה דקות כדי homogenize את הפתרון משקם (3 wt %).</li>
		<li>להוסיף את פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) ו- DF יתד פתרונות (0.2 מ"ל) ברצף בצינור (2.0 מ"ל). השתמש מערבולת לערבב את הפתרונות homogeneously hydrogels טופס מספר דקות. בצע את היחס טבלה 1 כדי לגרום hydrogels של חוזק מכני שונה. 
		הערה: השתמש בשיטת היפוך-צינור כדי לקבוע אם הידרוג כבר הקים.</li>
	</ol></li> <li>Rheology ניתוחים <ol><li>לבצע rheology ניתוח על rheometer המסתובבת עם צלחת פלדה מקבילים (קוטר: 20 מ מ). עבור הבדיקה gelation, התפשטה פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) על צלחת התחתון. לאחר מכן, מוסיפים DF יתד פתרונות מימית (0.2 מ"ל, 2 wt %) שווה dropwise על גבי המשטח פתרון משקם ומערבבים עם פיפטה במהירות. נמוך יותר למטה את הלוח העליון ולהתחיל כשהילדים</li>
		<li>עבור הידרוג &#39; s נוקשות מבחן, של הידרוג לחתוך עיגול (קוטר: 20 מ מ) ולמדוד את המודולוס אחסון (G &#39;) ערכים לעומת ניתוח תדירות-זן 1%. G טיפוסי &#39; ערכים-ראד 6.3 s &#8722; 1 המפורטים בטבלה 1- 
		הערה: לבצע את הבדיקות rheology של הידרוג 0.5 h לאחר היווצרות הידרוג כדי להבטיח ייצוב דינמי בונד הידרוג-</li>
		<li>עבור הידרוג &#39; s healable עצמי לבדוק, לחתוך חתיכות של הידרוג ורכוש לאסוף את החלקים יחד כדי self-heal אל כלי נפרד של. ואז לחתוך את פיסת הידרוג לעשות עיגול (קוטר: 20 מ מ), שים rheometer כדי לבצע את הניתוח rheology.</li>
	</ol></li></ol> 2. תא תלת-ממד, בטיפוח Hydrogels <ol><li>ההכנה של פתרונות gelation הידרוג <ol><li>שוקל DF פג (0.44 g, 0.11 mmol) בצינור סטרילי (4.0 מ"ל), להוסיף תא תרבות בתקשורת (RPMI-1640, 2.0 mL), ולהשתמש למערבולת או קדירות לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון פולימר (20 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולחטא אותו לאחר מכן על ידי העברתו דרך מסנן חיידקים-לפרטים מיקרון (0.22 מיקרומטר).</li>
		<li>שוקל את משקם גליקול (0.165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) בצינור סטרילי (15.0 מ ל), להוסיף תא תרבות המדיה (RPMI-1640, 4.0 מ"ל) ב, מערבולת כדי לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון משקם גליקול (4.0 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולסנן אותו עם מסנן חיידקים-לפרטים מיקרומטר 0.22.</li>
	</ol></li> <li>תא בטיפוח hydrogels זהירות: לבצע כל תא שגרות בשכונה תרביות רקמה. ידע בסיסי סטרילי טכניקה צפוי.
	<ol><li>הכנה של השעיה תא <ol><li>התרבות L929 תאים RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 5% פניצילין (10 מ"ל) ב- פטרי צלחת (בקוטר 10 ס מ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. מחליף המדיום כל יום לפני השימוש.</li>
			<li>לקצור את התאים L929 עם PBS המכיל טריפסין (0.025% w/v) ו- EDTA (0.01% w/v), ואז צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשהות את התאים בטווח הבינוני RPMI-1640 (1.0 מ"ל). לבצע ספירת תאים באמצעות הפעולה הרגיל של לוח ספירת דם. מחדש להשעות את התאים כדי להתאים את הריכוז תא ל ~ 3.75 × 10 6 תאים למ"ל.</li>
		</ol></li> <li>תא כימוס ב- hydrogels <ol><li>לערבב את המתלים תא L929 (0.4 mL, 3.75 x 10 6 תאים מ ל -1) עם פתרון משקם גליקול (0.4 מ"ל) צינור (4.0 מ"ל) על ידי מערבולת. Pipette הפתרון משקם L929/גליקול (0.8 מ ל) אל מרכז צלחת פטרי קונאפוקלית (קוטר 2.0 ס מ). Pipette הפתרונות DF פג (0.2 מ"ל) לתוך אותה המנה, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הפתרון זירוז היווצרות הידרוג- 
			הערה: להעריך את היווצרות הידרוג בהטיית הפטרי.</li>
			<li>לקבלת תרבית תאים ישירה, להוסיף סכומים נוספים של RPMI-1640 תרבות המדיה (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג. לשים את hydrogels תא מוטבע (1.0 מ"ל, 1.5 wt % גליקול משקם, wt 4.0% DF פג, 1.5 × 10 6 תאים מ ל -1) בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ושנה את המדיום כל יום. להתכונן תא הדמיה ביום 1, 3, 5 ו- 7 אחרי כימוס תא.</li>
		</ol></li> <li>עבור התרבות שלאחר תא תלת-ממד ב- hydrogels לאחר ההזרקה, להכין הידרוג התא טעון (מל ' 1.0, ראה שלב 2.2.2) במזרק (10.0 mL, המחט 48 גרם). לאחר הטפסים הידרוג להזריק את הידרוג לאט לתוך צלחת פטרי עבור הדמיה קונפוקלי. להוסיף סכום נוסף של תרבות התקשורת (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג ולשנות אותו כל יום. לשים את צלחת פטרי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ולהתכונן הדמיה לאחר מכן. 
		התראה: בבקשה לבדוק ולעקוב אחר הפרוטוקול מבצע בטיחות של מזרק.</li>
	</ol></li> <li>תא הכדאיות ניתוח <ol><li>תצפית קונאפוקלית <ol>
			<li>לשטוף את hydrogels עם PBS (1.0 מ"ל) עבור שתי פעמים. מכתים את hydrogels עם diacetate Fluorescein (ה-FDA, 0.5 mL, 0.05 מ"ג/מ"ל) ופתרונות יודיד (PI, 0.5 mL, 0.08 מ"ג/מ"ל) propidium למשך 15 דקות. לאחר צביעת, להסיר כל ממיסים את.</li>
			<li>לבחון את hydrogels באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תחת עירור אורכי הגל של 488 ננומטר, 543 nm לדמיין חיים ומתים תאים, בהתאמה. לקחת את z-במחסן דרך כל עומק מיקרומטר 2 hydrogels כדי לאמת ריפודי כתופיים של תאים בכל רחבי. 
			הערה: ה-FDA כתמי תאים חיים בזמן PI כתמי תאים מתים.</li>
		</ol></li> <li>לבזות את הידרוג (1.0 מ"ל) עם חומצה אצטית (HAc, 3 v %, 1.0 מ"ל) במשך 5 דקות, פיפטה לתוך צינור (4.0 מ"ל). איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשעות את התאים RPMI-1640 תא תרבות בינוני (1.0 מ"ל). לבצע תא ספירת דם ספירת לוח.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li>
<li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li>
<li>Breslin, S., O’Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255762985_Facilely_prepared_inexpensive_and_biocompatible_self-healing_hydrogel_A_new_injectable_cell_therapy_carrier">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/TB/c4tb01705f#!divAbstract">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li>
<li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid.+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li>
<li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable%2C+Self%E2%80%90Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li>
<li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c7py00112f#!divAbstract">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/CC/c2cc34745h#!divAbstract">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c6py01704e#!divAbstract">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li>
<li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הידרוג הוצג פרוטוקול זה (איור 1) מכיל שני רכיבים מרכזיים: את משקם גליקול פולימרים טבעיים, benzaldehyde סינתטי הסתיים פולימר gelator פג DF, אשר שניהם חומרים מסתיימים. סינתזה של DF פג מוצג באמצעות תגובת שינוי בשלב אחד. יתד של משקל מולקולרי 4,000 נבחר ב פרוטוקול זה, חששות, המסיסות, שינוי יעילות, וכן הידרוג נוקשות. סדרה של hydrogels עם חוזק מכני שונה הוכנו תוך שימוש שונות לתוכן מוצק יחסי של גליקול משקם, DF פג. Hydrogels הומוגנית נוצרו במהירות תוך דקות על ידי ערבוב gelation פתרונות מתחת לטמפרטורת...

Hydrogels הם חומרים פולימריים תפור עם כמויות גדולות של מים רכים תכונות מכניות, הם שימשו. יישומים ביו-רפואיים רבים1,2. Hydrogels יכולים להציע סביבה רך ורטוב, אשר דומה מאוד הסביבה פיזיולוגיים עבור תאים ויוו. לכן, hydrogels הפכו לאחד פיגומים הפופולרי ביותר עבור תא 3D-תרבות-3,-4. בהשוואה ל תרבית תאים 2D פטרי, תרבית תאים 3D התקדמה במהירות להציע שמטריצה חוץ-תאית (ECM) חיקה microenvironment עבור תאים ליצור קשר עם ולהרכיב למטרות של התפשטות ובידול -5. בנוסף, hydrogels המכילה פולימרים טבעיים יכול להציע ביו תואמי וקידום סביבות עבור תאים להתרבות, להבדיל3. Hydrogels נגזר פולימרים סינתטיים עדיפים רכיבי שלהם פשוטה וברורה, אשר לא לכלול השפעות מורכבות כמו חיה-מקור חלבונים או וירוסים. בין כל הידרוג המועמדות תרבית תאים 3D, hydrogels מוכנים בקלות, יש מאפיין עקבי הם תמיד המועדף. המתקן כדי להתאים את המאפיינים של הידרוג כדי להתאים לדרישות מחקר שונים חשוב כמו טוב6.
כאן אנו מציגים נתיישב הכנת גליקול מבוססי משקם הידרוג באמצעות כימיה אימין דינאמי, אשר הופכת פלטפורמה תכליתי הידרוג תרבות תלת התא7. בשיטה זו, משקם גליקול ביו תואמי ידועים משמשים להקים מסגרות של הרשתות של הידרוג. קבוצות אמינו שלה הם הגיבו benzaldehyde הסתיים פוליאתילן גליקול כמו פולימר gelator כדי ליצור חוב אימין דינמי כמו crosslinkages של hydrogels8. אימין דינמית אג ח ניתן ליצור, מתפרקים הפיכה ואת responsively לסביבתם, שהעניקו את hydrogels עם תפור באופן מכני מתכוונן רשתות9,10,11. בשל שלה לתוכן מים גבוהה, חומרים ביו-תואם, חוזק מכני מתכוונן, הידרוג מיושמת בהצלחה בדומה לפיגום עבור תאים L929 תא 3D תרבות12,13. פרוטוקול כאן פרטים ההליכים, לרבות פולימר gelator סינתזה, הכנה הידרוג, תא הטבעה culturing תא תלת-ממד.
הידרוג מציגה גם מספר תכונות אחרות בשל שלה crosslinkages אימין דינמיים, כולל שלה רב מגיב לגירויים שונים ביו-(חומצה/pH, pyridoxal נגזרות ויטמין B6, חלבון פפאין, וכו '), המציין כי הידרוג יכול להיות המושרה מתפרקת תחת התנאים הפיזיולוגיים8. הידרוג הוא גם עצמית healable להזרקה, מה שאומר הידרוג אפשר יהיה לנהל באמצעות שיטת הזרקת פולשני מינימלי ולהשיג יתרון סמים ותא משלוחים14,15. על ידי הוספת תוספים תפקודית או פולימר ספציפיות מוגדרות מראש gelators, הידרוג מתאים להשגת מאפיינים ספציפיים כמו מגנטי, טמפרטורה, pH מגיבים, ועוד16,17, אשר יכול להגשים מגוון רחב של דרישות המחקר. מאפיינים אלה חושפים יכולת פוטנציאלית של הידרוג ניתן בהזרקה ספקים מרובים עבור תאים בתוך חוץ גופית ו ויוו מחקר ביו-רפואי והן יישומים וסמים.

<table><tbody><tr><td>גליקול צ'יטוזן</td><td>Wako תעשיות כימיות טהורות</td><td>39280-86-9</td><td>90% דרגת דה-אצטילציה</td></tr><tr><td>4-קרבוקסיבנזלדהיד</td><td>שנחאי אלאדין&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>שנחאי Aladdin&nbsp; Bio-Chem טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr> <tr><td>סידן כלוריד נטול מים</td><td>שנחאי Aladdin&nbsp; Bio-Chem טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr> <tr><td>4-dimethylamiopryidine</td><td>שנחאי Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., Ltd</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr> <tr><td>פוליאתילן גליקול</td><td>סינו-פארם מגיב כימי</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr> <tr><td>טטרה-הידרופוראן</td><td>סינו-פארם מגיב כימי</td><td>109-99</td><td>%</td></tr> <tr><td>טולואן</td><td>סינו-פארם מגיב כימי</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr> <tr><td>אתיל אתר</td><td>סינו-פארם מגיב כימי</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>מגיב כימי סינו-פארם</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr> <tr><td>מגיב כימי CaCl2 נטול מים</td><td>סינו-פארם</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr> <tr><td>פלואורסצאין דיאצטט</td><td>סיגמא</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr> <tr><td>פרופידיום יודיד&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr> <tr><td>RPMI-1640 מדיה תרבית</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>תמיסת סטרפטומיצין פניצילין</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>ריאומטר</td><td>TA מכשיר</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי AR-G2</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3channel</td></tr><tr><td>L929 תאים</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC שיבוט 929; תא L, L929, נגזרת של מאייד מתח L</td></tr><tr><td></td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48 מחט מחט</td><td>שנחאי Zhiyu חומר רפואי ושות', בע"מ</td><td></td><td>48-guage</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקדח חום</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

הפרוטוקול מציג שיטה נתיישב, יעיל, ו תכליתי כדי להכין hydrogels מבוססי משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. הידרוג מוכן על ידי ערבוב פתרונות של גליקול משקם עם gelator פולימר benzaldehyde מסונתז הסתיים, hydrogels מתקבלים ביעילות תוך מספר דקות בטמפרטורת החדר. על ידי יחסי משתנות בין גליקול משקם, פולימר gelator ותוכן מים, מתקבלים hydrogels רב-תכליתי עם gelation שונים פעמים וקשיחות. כאשר פגום, הידרוג יכול לשחזר שלה הופעות, המודולוס, בשל הפיכות מכבלי אימין דינמי כמו crosslinkages. מלון healable עצמית זה מאפשר את הידרוג להיות להזרקה, שכן הוא יכול להיות עצמי נרפא מפיסות סחוט הידרוג בצובר נפרד לאחר תהליך ההזרקה. הידרוג הוא גם רב מגיב לגירויים ביו-אקטיביות רבות בשל מצבים שונים equilibration מכבלי אימין דינמי. הידרוג הזה אושר כמו ביו-תואם, תאי פיברובלסט העכבר L929 היו מוטבעים הבאים הליכים סטנדרטיים, התפשטות תא הוערכה בקלות על ידי תהליך הטיפוח תא תלת-ממד. הידרוג יכולים להציע פלטפורמה מתכווננת למחקר אחר שבו לחקות פיזיולוגיים של סביבה תלת-ממד עבור תאים הוא מרוויח. יחד עם תכונותיו רב מגיב healable עצמית, זריקות, פוטנציאל ניתן להחיל את hydrogels כמו ספקים מרובים עבור תאים יישומים ביו-רפואיים עתידיים וסמים.

מצגת סכמטי של פרוטוקול זה על הידרוג ההכנה והשימוש בה כמו תרבית תאים 3D מוצע באיור1. פרטים של התוכן של הידרוג יחסי המוכנים חוזק מכני שונה מסוכם בטבלה1. הידרוג healable עצמית, rheology מאפיין מציג נוקשות של הידרוג על-ידי אחסון מודולוס לעומת מבחן תדירות באיור2. תמונות קונאפוקלית התא ואת מספרי הטלפון הנייד עם ימים תרבות hydrogels מוצגים באיור 3, המאשרת את התא הכדאיות ואת התפשטות תאים באמצעות תרבית תאים תלת-ממד. <strong ...

כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להכין הידרוג'ל קיטוזן להזרקה עבור תרבית תאים תלת-ממדית, במטרה להשתמש בו בסופו של דבר בטיפולים טיפוליים. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות בתחום ההידרוג'לים בעלי יכולת ריפוי עצמי, כגון כיצד להכין הידרוג'ל בעל יכולת ריפוי עצמי בדרך פשוטה וכיצד להשתמש בו לתרבית תאים תלת-ממדית. היתרון של טכניקה זו הוא שניתן להכין הידרוג'ל תואם בעל יכולת ריפוי עצמי בדרך פשוטה מאוד, ולהשתמש בו לתרבית תאים תלת-ממדית.הידרוג'ל זה הוא גם הניתן להזרקה, כך שניתן להשתמש בו כנשא לטיפול בתאים. כעת מר Yongsan Li יראה לכם כיצד להכין את ההידרוג'ל וכיצד לבצע תרבית תאים בתלת-ממד באמצעות הידרוג'ל זה. Yongsan Li הוא סטודנט לתארים מתקדמים במעבדה שלנו.כדי להכין את ההידרוג'לים, תחילה יש לסנתז DF PEG. בתוך מנדף כימי, שקלו ארבעה גרם של PEG במשקל מולקולרי 4,000 אל תוך בקבוק בעגית, והוסיפו 100 milliliters של toluene. לאחר מכן, כדי להמיס את הפולימרים, חממו את התמיסה.לאחר שכל הפולימרים נמסים, השתמש במאדה כדי להסיר את כל הממיסים. לאחר מכן, חזור על תהליך הערבוב בטולואן והאידוי פעמיים נוספות כדי להכין את פולימרי ה-PEG היבשים. בשלב הבא, המס את הפולימרים באמצעות בוחש מגנטי ו-100 milliliters של DHF.לאחר מכן, המיסו 0.9 גרם של 4-Carboxybenzaldehyde בתוך התמיסה. בשלב הבא, המיסו 0.07 גרם של dimethylaminopyrimide בתוך התמיסה. כעת הוסיפו 1.25 גרם של DCC בתוך צינור ייבוש הממולא בסידן כלורי (calcium chloride) אנहाइडרי.כעת יש להניח לתגובה להמשיך בערבוב בטמפרטורת החדר למשך כ-12 שעות. למחרת, השתמש ב-500 milliliters של diethyl ether קר כדי להשקיע את המוצקים הלבנים, והשתמש בסינון בוואקום כדי לאסוף את המוצקים. השלך את התמיסה, וייבש את המוצקים תחת אוורור טוב.בשלב הבא, המיסו את המוצקים הלבנים ב-100 milliliters של THF. יש לסנן כל מוצק לבן שאינו מסיס לפני ההמשך. כעת, השקיפו את המוצקים המומסים באמצעות diethyl ether קר וטרי.לאחר מכן, השתמשו בסינונן בוואקום כדי לאסוף את המוצקים, והניחו להם להתייבש שוב. חזרו על תהליך זה פעמיים עד שלוש פעמים, ולאחר מכן הניחו את המוצקים הלבנים בתנור ייבוש בוואקום כדי לייבש אותם לחלוטין. האבקה הלבנה המתקבלת היא המוצר הסופי: benzaldehyde-terminated DF PEG.כדי להקיף את התאים בתוך ההידרוג'ל לצורך תרבית, המיס תחילה 0.44 גרם של DF PEG לתוך שני מיליליטר של מצע גידול תאים במבחנה של ארבעה מיליליטר. ערבב את התערובת באמצעות וורטקס עד לקבלת תמיסה בריכוז של 20% לפי משקל. לאחר מכן, סטריליז את התמיסה.העבירו את התמיסה למזרק של 10-milliliter, והעבירו אותה דרך מסנן לסינון חיידקים של 0.22-micron. כעת, ערבבו 0.165 grams של glycol-chitosan עם ארבעה milliliters של מצע גידול תאים, באמצעות vortex, כדי להכין תמיסת chitosan בריכוז של 4% ממשקל. לאחר מכן, סטריליזו את התמיסה באמצעות מסנן נוסף לסינון חיידקים של 0.22-micron.בשלב הבא, קצרו את התאים, כגון תאי L929, באמצעות trypsin. שטפו את התאים שנאספו, והשעיו אותם מחדש במצע גידול בריכוז של 3.75 מיליון תאים למילליליטר. בשלב הבא, התאים נשתלים בתוך מטריצה תלת-ממדית (3D matrix).ביצוע מדויק של שלבים אלו הוא קריטי להצלחת התהליך. כעת, ערבבו 0.4 milliliters של תגלוס התאים עם 0.4 milliliters של תמיסת chitosan באמצעות vortex. העבירו באמצעות פיפטה את התערובת למרכז של Petri dish בקוטר שני סנטימטרים, והוסיפו בפיפטה 0.2 milliliters של תמיסת DF PEG אל תוך הדיש.לאחר מכן, השתמשו בפיפטור עדין כדי להשרות את היווצרות ההידרוג'ל. העריכו את היווצרות ההידרוג'ל על ידי הטיית הצלחת ובחינת צמיגות התמיסה. כדי לבחון את יכולת ההזרקה של התאים העטופים, הכינו את אותה תערובת במזרק של 10-milliliter.לאחר שההידרוג'ל נוצר, דחפו אותו באיטיות דרך מחט בכיול 48 אל תוך צלחת הפטרי. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול לתערובת ההידרוג'ל-תאים בצלחת, והעבירו את הצלחת לאינקובטור לצורך תרבית. מדי יומיים, החליפו את המצע כך שיכסה את תרבית התאים בהידרוג'ל תלת-ממדי.כדי להכין את התאים העטופים בתוך הידרוג'לים לצורך דימות, שטפו תחילה את ההידרוג'לים עם 1 ml של PBS פעמיים. לאחר מכן, צבעו את ההידרוג'לים בתמיסת fluorescein-diacetate ובתמיסת propidium iodide. הוסיפו 0.5 ml מכל אחת מהתמיסות על גבי ההידרוג'ל, ודגרו את ההידרוג'ל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר דגירה קצרה עם תמיסות הצביעה, שאבו את כל הממיסים. כעת בחנו את ההידרוגלים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, עם עירור ב-488 ננומטר לצפייה בתאים חיים, ועירור ב-543 ננומטר לצפייה בתאים מתים. אספו סדרות תמונות (image stacks) עם פרוסות של שני מיקרון כדי לתקף את התפלגות התאים בתוך ההידרוגל.תאי L929. שורת תאים טיפוסית של עכבר-פיברגלס עם קשיחות רקמה בסביבת in-vivo של כ-5,600 Pascals הוכנסו בתוך הידרוג'ל. החיוניות שלהם הייתה גבוהה ביותר לאורך תהליך התרבית, והם הגיעו לצפיפות תאים מרשימה.לאחר שבעה ימי תרבית בתוך ההידרוג'ל, מספר התאים עלה ב-200%. הידרוג'לים שהוזרקו אל צלחת תרבית התאים באמצעות מחט בכיל 48-gauge היו מסוגלים להתרפא באופן עצמי ולהיווצר מחדש כהידרוג'ל מאוחד לאחר כשעה. לאחר שבעה ימים בתרבית, גם תאים אלו השביחו באופן דרמטי. ניתן היה למצוא עדויות לאירועי חלוקת תאים, שבהם חלק מהתאים נראו כחלוקים לשניים.בדיקת חיות התאים (live-dead assay) הראתה חיוניות גבוהה מאוד, מה שמעיד על שגשוג תאים מוצלח בתוך ההידרוג'ל התלת-ממדי לאחר ההזרקה. קצב שגשוג תאים זה היה כ-3/4 מקצב השגשוג של תאים שלא הוזרקו לאחר שבעה ימי תרבית. לפיכך, למרות שכוחות הגזירה במהלך ההזרקה גורמים להשפעה שלילית מדידה, התאים המוזרקים עדיין הפגינו יכולת שגשוג גבוהה למדי.לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם לדעת כיצד להכין הידרוג'ל בעל יכולת ריפוי עצמי, כיצד להשתמש בהידרוג'ל זה לתרבית תאים תלת-ממדית (3D) וכיצד להעביר תאים באמצעות הידרוג'ל זה. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בהתבסס על הפרוטוקול המומלץ, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון הזרקה in-vivo לטיפול בתאים או להולכת תרופות.

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

תיקון סחוס מייצג אתגר רפואי שלא נענה וגישות מבוססות תאים להנדסת סחוס מפרקי אנושי הן פתרון מבטיח. כאן, אנו מתארים הידרוג'לים ביומימטיים תלת מימדיים (תלת מימדיים) ככלי אידיאלי להתרחבות והתבגרות של כונדרוציטים מפרקיים אנושיים.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

פיגום הנדסת רקמות בזריקות מורכב פולי (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAm-ז-CS) microparticles אלגינט המכילים הוכן. כוחו הדבק, נפיחות נכסים ב biocompatibility במבחנה מנותח במחקר זה. טכניקות האפיון שפותחו כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).

היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ'יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג'לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

למד הכנת הידרוג'לים מבוססי כיטוזן להזרקה באמצעות כימיה דינמית של אימין. שיטה זו מאפשרת תרבות תאים תלת-ממדית עם תכונות התאוששות עצמית ליישומים ביורפואיים.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

גלה סרטונים נוספים