Name: אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: למדו לזהות הרג אנטיגני ספציפי בתוך הגוף במודל עכברי באמצעות שיטת CTL in vivo. הטכניקה מאפשרת הערכה ישירה ומהירה של פוטנציאל ציטוליטי ללא תלות בגידול גידולים או זיהום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מחקר NIH (A1R03AI120027 (RN) ו 1R21AI20012 (RN)), מענק מחקר מוסדיים (RN), סטארט-אפ הענק (RN) ו MD אנדרסון CIC זרע הענק (RN).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת טקסס MD Anderson Cancer Center.
1. הכנה של פפטיד של חיסון
<ol><li>להמיס את פפטיד lyophilized עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז המתאים, מערבולת ב-30 s. הערה: עבור25–hgp10033, הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/מ"ל, עבור ביצית257–264, הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל. לשקם פפטיד לפני ההזרקה. אל תאחסן אחרי שיחזור.</li>
</ol>2. בידוד של Splenocytes מכל עכבר מהונדס
הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.
<ol><li>
המתת חסד OT-1 העכבר הטרנסגניים בשיטה שאושרו CO2 חנק, להסיר את הטחול. הערה: העכבר הטרנסגניים המתאים מנוצל בשלב זה ספציפי פפטיד של בחירה.<ol>
<li>הנח את העכבר בצד ימין שלה. תרסיס בצד השמאלי של העכבר עם 70% אתנול (EtOH). משוך את העור בעזרת מלקחיים, לחתוך את העור באמצעות מספריים כירורגיים; הטחול יהיה גלוי בתוך חלל הצפק. בעדינות לפתוח את החור בצפק לגשת הטחול. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disaggregate הטחול על-ידי הצבתו במסנן מיקרומטר 70 בצלחת פטרי בינונית 2 מ ל- A (PBS עם 1% סרום שור עוברית (FBS)) ו לנפץ את הטחול עם סוף פומפה.
	<ol>
<li>לאסוף את splenocytes צלחת פטרי והמקום צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ של מדיום פעמיים כדי לאסוף את כל התאים. הוסף בינוני למעלה מ 25 ל ' centrifuge את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ב 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>וארוקן את התאים, resuspend 1 מ"ל / לכל מאגר פירוק של תאי הדם האדומים (RBC) טחול. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק להוסיף 10 מ"ל של מדיום A, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 475 x g... Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום A, הסרת לכלוך על-ידי סינון התליה תא דרך מסנן מיקרומטר 70 לתוך נקי 50 מל חרוט.</li>
	<li>
לספור תאים באמצעות trypan blue ושל hemocytometer. Resuspend תאים ב- PBS ריכוז סופי של 106 -6 תאים/מ ל. עבור ביצית257–264 ספציפי להרוג, resuspend ב- 106 תאים למ"ל, עבור hgp10025–33 ספציפי להרוג, resuspend-6 תאים/מ.
	<ol>
<li>ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- 15 מ"ל PBS קר כדי לשטוף את התאים. חזור על השלב לשטוף פעם נוספת. ספין התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- PBS קר על-פי אמצעי האחסון הסופי שנקבע בשלב 2.4.</li>
		<li>תא בודד ההשעיה להעביר צינור microcentrifuge 1.5 mL ולשמור על הקרח עד זריקה לתוך עכבר C57/BL6 הנמען.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הזרקה של Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים
<ol><li>את המקום העכבר הנמען C57/BL6 restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה (סעיף 2) דרך הווריד לווריד הזנב באמצעות מחט 27 G עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.</li>
</ol>4. Covax ניהול
הערה: אם תאים מוזרקים בשעות אחר הצהריים, covax ובחולים למחרת בבוקר בתוך 18 h של הזרקת תאים.
<ol><li>הנח את העכבר בתיבת הרדמה ברור עם 1-3% איזופלוריין. אחרי עכברים הם מורדם לחלוטין, להעביר הקונוסים האף מחובר את סעפת בבית הבליעה הרדמה העכברים. לשמור על עכברים מאופקת עם הצד הגבי למעלה. הערה: ההרדמה אושר על ידי צביטה הבוהן קצרה כדי לוודא שתגובת הנסיגה היא לא elicited. החוק הפדרלי מגבילה את השימוש איזופלוריין גודל וטרינר מורשה.</li>
	<li>תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. מזריקים µL 100 של פפטיד פתרון (מתוך סעיף 1) subcutaneously באמצעות מחט 27 G עם המזרק לחדור 4-5 מ מ לתוך האזור בסיס הזנב, הצד שיקוע המחט פונה כלפי מעלה. הערה: עכברים הם חוסנו באגף אחד עם הזרקה תת עורית בבסיס של הזנב10.</li>
	<li>להזריק 100 µL, אנטי-CD40 נוגדנים (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל) לרוחב באתר הזרקת החיסון.</li>
	<li>בזהירות החל imiquimod קרם 50 mg/עכבר על האתרים חיסון. מרחו קרם imiquimod על פני השטח עד הקרם אינה גלויה, נספג באופן מלא.</li>
	<li>מזריקים µL 100 של 100,000 IU/mL rhIL-2 חלבון intraperitoneally (i.p.) על אזור הבטן התחתונה. להתבונן עכברים במשך 5 דקות אחרי שהם יתאושש לגמרי מן ההרדמה. הערה: ניסוי מושהה בנקודה זו במשך 3 ימים.</li>
</ol>5. בידוד של המטרה Splenocytes של תיוג עם CFSE
הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.
<ol><li>המתת חסד העכברים C57BL/6 לפי שיטת חנק של2 CO שאושרו. הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>להסיר תאים עבור ספירה באמצעות של hemocytometer, לחישוב ריכוז סופי של תאים ב- 106 תאים למ"ל בפתרון תיוג CFSE (המתוארים בשלב 7). ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.</li>
</ol>6. פפטיד הפועמים של יעד Splenocytes
הערה: פפטיד הפועמים חייב להתבצע בצורה סטרילית.
<ol><li>Resuspend תאים על 106 תאים למ"ל בתקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)). לחלק את התאים 2 צינורות (conicals 15 מ"ל). תווית כל שפופרת פעמו או unpulsed.</li>
	<li>
הוסף פעמו פפטיד כדי ברכבת התחתית. תווית. עבור ביצית257–264 הפועמים, להוסיף 1 µg/mL, hgp10025–33 הפועמים, להוסיף 2 µg/mL. הערה: התאים unpulsed עוברים הדגירה זהה של התאים פעמו רק בלי תוספת פפטיד.<ol>
<li>דגירה תאים + פפטיד ב 37 ° C עבור 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)) כדי כל שפופרת לשטוף שניהם פעמו ו unpulsed התאים היעד. ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.</li>
</ol>7. הכנת CFSE עבור תיוג יעד Splenocytes
<ol><li>
להכין פתרון תיוג CFSE במהלך לתא הכביסה בשלב 6.3; התאים פעמו יסומנו כסעיפים CFSE. היי , את unpulsed כמו CFSEהלאו. להכין 1 מ"ל של פתרון תיוג CFSE 106 תאים. הערה: CFSE הוא רגיש אור, צריך להיות מוגן מפני אור בכל עת.<ol>
<li>להכין CFSEהיי -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 5 מ מ) עבור ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר/mL בתקשורת RPMI 1640 עם 2% FBS.</li>
		<li>להכין CFSEהלאו -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 0.5 מ מ) עבור ריכוז סופי של 0.5 המדיה RPMI מיקרומטר/mL 1640 עם 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. תיוג של היעד Splenocytes עם CFSE
הערה: תיוג CFSE חייב להתבצע בצורה סטרילית.
<ol><li>Resuspend תאי היעד פעמו ו- unpulsed (מתוך שלב 6.3) 106 תאים למ"ל תיוג CFSE מדיה. Resuspend התאים פעמו עם מוכן CFSEהיי-תיוג מדיה והתאים unpulsed עם מוכן CFSEהלאו-תיוג מדיה.</li>
	<li>מערבבים תאים ומדיה תיוג CFSE על-ידי היפוך עדין או לטמיון. אינן מתאימות על ידי vortexing דגירה תאים, תיוג CFSE מדיה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות רמיקס התאים בכל 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה תאי השעיה ו ספין כל תא בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב g 475 x.</li>
	<li>האחות תגובת שיקוע, resuspend תאים ב- PBS קר 10 מ"ל. לסובב תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 475 x g.</li>
	<li>חזור על שלב 8.4.</li>
	<li>לספור את התאים ואת תערובת פעמו פפטיד, CFSEהיי-עם unpulsed, CFSEהלאותוויות-שכותרתו תאים ביחס של 1:1 להזרקה לתוך עכברים הנמען. לשמור על aliquot של עונה 1 פרק 106 מעורב תאים לשימוש עבור הערכה cytometry זרימה בסיסית (סעיף 11). הערה: עוצמת הקול הסופי להזרקה היא µL 100 לכל העכבר. ספירת הסופי הוא 10e6 תאים. אובדן נפח המזרק ואת המחט צריך להילקח בחשבון והוא צריך להיות מוערך 500 µL.</li>
</ol>9. הזרקה של תאי המטרה
הערה: לשמור על התווית על-ידי CFSE תאים מוגן מפני אור לפני ובמהלך ההזרקה ככל האפשר.
<ol><li>את המקום הנמען עכברים C57BL/6 ב restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה לווריד לווריד הזנב עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.</li>
</ol>10. בידוד מחדש של התאים היעד
הערה: העיתוי של שלב זה הוא קריטי, תלויים cytotoxicity CTL את הכוח של אנטיגן לגירוי. להערכת ברצח היעד פעמו257–264 ביצית, התאים צריכים להיות שנקטפו 4-6 שעות לאחר ההזרקה. מאז התווית על-ידי CFSE תאים הם טחולים רגיש, תהליך אור בחושך.
<ol><li>המתת חסד העכברים C57BL/6 הנמען בהתאם לשיטה חנק שאושרו CO2 .</li>
	<li>הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Resuspend התאים בתא פלורסצנטיות מופעל 1 מ"ל, מיון (FACs) מאגר (1% BSA + PBS) להערכת מאת cytometry זרימה.</li>
</ol>11. gating ההיגיון לקבוע CTL פעילות על-ידי Cytometry זרימה
<ol><li>
לבצע הערכה של CTL פעילות באמצעות פרוטוקול cytometry זרימה רגילה. רוכשים תאים באמצעות ערוץ FITC על cytometer זרימה עם 488 ננומטר לייזר עירור11.
	<ol>
<li>שער על לימפוציטים בשידור חי באמצעות הפרמטרים פיזור (האס) לעומת פיזור קדמי (FSC) בצד. לעבד בתוך השער לימפוציט בשידור חי עבור מכלל האוכלוסייה CFSE-חיוביות. הערה: התאים התווית על-ידי CFSE מוזרק יפצה תת קבוצה קטנה של לימפוציטים הכולל נוכח הטחול. התאים CSFE-חיובית צריך להופיע שתי אוכלוסיות נפרדות בסולם יומן.</li>
		<li>השתמש בתבנית היסטוגרמה כדי לקבוע את אחוז unpulsed (השמאלי שיא, CFSEהלאו) ואת פעמו (נכון שיא, CFSEשלום) אוכלוסיות. אובדן תאי CFSEשלום מציין פעילות CTL אנטיגן ספציפי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד פרוטוקול זה היא פשוטה, ישנם כמה צעדים קריטיים זה חייב להתבצע בקפידה. לקרקע covax לאחר ההזרקה של אנטיגן ספציפי T-cell הנבדקת יש צורך לראות יש הריגתו של המטרות פעמו. אמנם זה אפשרי כי החיסון covax על בסיס מים יוצר תנאי דלקתית חריפה, עבור שלב דלקתי כרוני, החלפת ניסוח קצר על בסיס מים עם גישה המבוסס על שמן-שחרור איטי-אנטיגן עשויה לייצר טוב יותר תוצאות7,12.
בנוסף, CFSE-תיוג של תאי היעד בעקבות אנטיגן הפועמת צריך להיות אחיד לבדיקה cytometr...

קיימים פרוטוקולים מרובים כדי להעריך את הפוטנציאל (CTL) cytolytic של CD8+ או CD4+ T-cell. ההערכה יכול להיעשות בקלות במבחנה תחת תנאים מבוקרים1,2,3. בנוסף, מודלים מחלה זיהומית, כגון LCMV, בחנו בסגנון קלאסי CTL פונקציה באמצעות באופן שונה CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר) שכותרתו התאים היעד בו CFSEשלום-תאים עם תוויות פעמו עם פפטיד, CFSEהלאו-שכותרתו היעד תאים נשארו unpulsed. התאים אז מוזרק ביחס של 1:1, שקובעת אובדן CFSEהיי-תווית פעמו מטרות באמצעות cytometry זרימה4. חיסון דגמים דחייה גם השתמשו אסטרטגיות דומות עבור הערכה של ויוו להרוג על ידי שני CD8+ ו CD4+ T תאים כמו גם תאי NK5,6. זה וזמינותו עוצמה, אך מחייב שימוש מדבקים זה פריים המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד.
פרוטוקול זה, מצד שני, דורש אין זיהום מוקדמת של המחשב המארח, במקום מנצל אסטרטגיה חיסון לשפר את המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד. לחיסון זה מורכבת ניסוח על בסיס מים של חיסון פפטיד המחייב מתן immunostimulatory קוקטייל בשם covax7, המורכב קולטן דמוי אגרה 7 (TLR7) אגוניסט (imiquimod קרם), של אנטי-CD40 היתה ללא-חת נוגדן, interleukin-2 (il-2) שמוביל שילוב סינרגיסטי של סוכנים immunostimulatory ההתמחרות פפטיד ספציפי לקרקע ואת התגובה החיסונית חזקה. ככזה, וזמינותו הזה מספק של הבדיקה מהירה של CTL פונקציה כמו החיסון ניתנת יחד עם התאים עבור הערכה של תפקוד רק שלושה ימים לפני הזרקה של תאי היעד. בנוסף, לקרקע covax הוא מספיק חזק, כי ניתן לראות את קיבולת הריגתו של תא T אנטיגן ספציפי להתקפת בין 4 ו- 24 שעות לאחר ההזרקה.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא לזהות את ציר הזמן ויוו עבור הגילוי של הריגת היעד המתאים אנטיגן והן את ההשערה הנבדקת. יש לבצע הערכה זהירה, כשלל וריאציות אנטיגן כוח, כמו גם שינויים גנטיים במקצועות תאי-T עלולה לגרום דיפרנציאלית בפונקציה CTL המחייב של זיהוי תזמון שונה היעד ההרג. בנוסף, בזמן הריכוז המתאים של פפטיד עבור חיסון מוטבה עבור מלנומה אנושית אנטיגן glycopeptide 100 (hgp10025-33) ו אובלבומין257-264 (ביצית257-264)8,9 , שימוש אחר מודל אנטיגן אשר עשוי להיות מתאים יותר ממחקר נתון ידרוש יותר אימות. בשל הבדלים קיבולת של אנטיגנים היעד לעורר CTL לתפקד אפקטור בשילוב עם covax כמו אדג'וונט הצפויה, אופטימיזציה של ריכוז המינון il-2 ותדירות המינון עשוי להיות חיוני להשגת המטרה הרצויה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.

<table><tbody><tr><td>נקבה בת 6 עד 12 שבועות C57BL/6 עכברים&nbsp;</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>027</td><td>C57 שחור 6 עכברים</td></tr><tr><td>OT-1 עכברים נקבות בני 6-12 שבועות&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33</תת>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264</תת>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>קרם אימיקימוד 5%&nbsp;</td><td>פוגרה</td><td>51672-4145-6</td><td>קרם אלדרה</td></tr><tr><td>ספציפי ל-CD40 mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>שיבוט FGK4.5</td></tr><tr><td>חלבון rhIL-2&nbsp;</td><td>הופמן לרוש בע"מ</td><td>136</td><td>חלבון IL-2 אנושי רקומביננטי</td></tr><tr><td>70% אלכוהול איזופרופיל הכנה &nbsp;</td><td>קנדל</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>מאגר פוספט מלוח</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td> מאגר ליזה RBC <td>בסרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(ו-6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל MCT בוגר טבעי&nbsp;</td><td>פישר</td><td>05-408-129</td><td>שפופרת מיקרוצנטריפוגה</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>פישר</td><td>BP8201500</td><td></td></tr><tr><td>EtOH תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>פישר</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 מחט BD</td><td></td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

אין ויוו assay גילוי של הפונקציה cytolytic תא t אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

מתודולוגיות הנוכחי לרצח אנטיגן ספציפי מוגבלים לשימוש במבחנה או שימוש במודלים מחלה זיהומית. עם זאת, יש לא פרוטוקול ספציפי נועד למדוד אנטיגן ספציפי הרג ללא זיהום. פרוטוקול זה תוכנן ומתאר שיטות להתגבר על מגבלות אלה ומאפשר זיהוי אנטיגן ספציפי הריגתו של תא המטרה על ידי CD8+ T תאים ויוו. זו מושגת על-ידי מיזוג מודל החיסון עם יעד התווית על-ידי CFSE מסורתי הורג וזמינותו. שילוב זה מאפשר החוקר להעריך את הפוטנציאל CTL אנטיגן ספציפי ישירות ובמהירות וזמינותו אינה תלויה הגידול או זיהום. בנוסף, המדידה מבוססת על cytometry זרימה, אז צריך להיות נגיש על רוב החוקרים. המגבלה העיקרית של המחקר היא לזהות את ציר הזמן ויוו שהולם ההשערה הנבדקת. וריאציות בעוצמתם אנטיגן מוטציות בתאי T שעלולה להיות דיפרנציאלית בפונקציה cytolytic צריך להעריך בזהירות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור תא הקציר והערכה. הריכוז המתאים של פפטיד לקבלת חיסון מוטבה hgp10025-33 , ביצית257-264, אך בהמשך יהיה נחוץ אימות עבור אחרים פפטידים שעשויים להיות מתאים יותר ממחקר נתון. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.

לפני הזרקת תאי היעד התווית על-ידי CFSE, תערובת 1:1 תא מופעל cytometer זרימה כדי לקבוע את התדרים בסיסית של CFSEשלום והן CFSEהלאו התאים היעד. איור 1 א מציגה את האסטרטגיה חסימה כדי לזהות שינויים על האוכלוסיות CFSE, דרך שער הראשוני הוא עשה שימוש בפרמטרים FSC ו האס. התאים CFSE-חיובי מוחלט ואז subgated לפני הערכת שינויים בתדר, כמו אוכלוסייה זו הוא קטן יחסית בהשוואה splenocytes אנדוגני ללא תווית. התדירות היחסית של CFSEהי <...

המטרה של פרוטוקול זה נועד לאפשר זיהוי של in vivo הריגתו של תא המטרה במודל מאתר של אנטיגן ספציפי.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לאפשר זיהוי של הריגה ספציפית לאנטיגן של תא מטרה in vivo במודל עכברי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום האימונולוגיה, כגון מספיקות וזיהוי של הריגה ציטוליטית ספציפית לאנטיגן של תאי מטרה במערכת חיסונית תוקפת, וכיצד ניתן לשנות זאת באמצעות מניפולציה של תאי T כדי לשפר את התפקוד in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקר להעריך באופן ישיר ומהיר את הפוטנציאל הציטוליטי הספציפי לאנטיגן, שכן הבדיקה אינה תלויה בצמיחת גידול או בזיהום.את הפרוצדורות הללו יעבירו Cara Haymaker ו-Yared Hailemichael מהמחלקה לאונקולוגיה רפואית של מלנומה. לאחר הרדמת העכברים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להתיז 70% isopropyl alcohol על אזור בסיס הזנב לצורך ההזרקה. באמצעות מחט בכישור 27 המחוברת למזרק, כאשר צד השחית פונה כלפי מעלה, יש לחדירה של ארבעה עד חמישה מילימטרים אל תוך אזור בסיס הזנב ולהזריק 100 µL של תמיסת פפטיד שהוכנה מראש.לאחר מכן, הזרק 100 µL של נוגדן anti-CD4D לצד אתר הזרקת החיסון. מרח בזהירות 50 mg למשקולת עכבר של קרם imiquimod על אתרי החיסון. שפשף את הקרם על פני השטח עד שהקרם אינו נראה יותר ונספג במלואו.לאחר מכן, הזרק 100 µL של חלבון rhIL-2 אנושי רקומביננטי בריכוז של 100,000 IU למילליטר באופן תוך-peritonal, באזור הבטן התחתונה. לאחר בידוד ספלנוציטים מעכברים וליזיס של תאי דם אדומים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצע דחיסת פפטידים (peptide-pulsing) על ידי השיתוף מחדש של התאים בריכוז של 10⁶ תאים למילליטר במצע גידול מלא. חלק את התאים לשתי מבחנות קוניות של 15 מילליטר וסמן אותן כדחוסות (pulsed) או לא דחוסות (unpulsed).עבור דחף (pulsing) של OVA 257 עד 264, הוסיפו מיקרוגרם אחד למילליטר של פפטיד למבחנה המסומנת כ-pulsed. לאחר מכן, דגרו את התאים שעברו דחף ואת התאים שלא עברו דחף בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. הוסיפו 10 milliliters של מצע מלא הן למבחנה שעברה דחף והן למבחנה שלא עברה דחף כדי לשטוף את תאי המטרה.לאחר מכן, סובב את התאים שנותרו ב-475 x g ובטמפרטורת החדר, למשך חמש דקות, לפני שאיבת הנוזל העליון (supernatant). הכן מצע סימון גבוה של CSFE על ידי הוספת 1 µL למילליטר של CSFE ל-RPMI 1640 עם 2% FBS, לריכוז סופי של 5 µM למילליטר. לאחר מכן, הכן מצע סימון נמוך של CSFE על ידי הוספת 0.1 µL למילליטר של CSFE ל-RPMI 1640 עם 2% FBS, לריכוז סופי של 0.5 µM למילליטר.כדי לסמן את הספלנוליטים (splenolytes) המטרה, השעה 10⁶ תאים למילליטר של תאים שעברו פולס בתוך מדיום CSFE לסימון גבוה (high-labeling) שהוכן, ו-10⁶ תאים למילליטר של תאים שלא עברו פולס בתוך מדיום CSFE לסימון נמוך (low-labeling). ערבב את תרחיפי התאים על ידי הפיכה עדינה או סיבוב. לאחר מכן, דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות, תוך ערבוב מחדש של התאים מדי חמש דקות.בשלב הבא, הוסיפו 10 milliliters של מצע מלא לכל תרחיף תאים, וסובבו את התאים בצנטריפוגה ב-475 x g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשתמשו ב-10 milliliters של PBS קר כדי לתרחף מחדש את התאים. סובבו את התאים ב-475 x g ובטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך חמש דקות, לפני חזרה על שטיפת ה-PBS.ספרו את התאים ועזבו תערובת של תאי CSFE high שקיבלו פולס של פפטיד עם תאי CSFE low שלא קיבלו פולס ביחס של 1:1 לצורך הזרקה לעכברי רקיב. שמרו מנה של 1x10⁶ תאים מהתערובת לצורך הערכת בסיס בציטומטריית זרימה. לאחר ההזרקה ובידוד התאים המטרה מחדש, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו הערכה של פעילות CTL באמצעות פרוטוקול סטנדרטי של ציטומטריית זרימה, תוך רכישת תאים בערוץ FITC עם לייזר של 488 nanometer לעירור.לפני הזרקת תאי המטרה המסומנים ב-CSFE, תערובת התאים ביחס של 1:1 הועברה בציטומטר זרימה כדי לקבוע את תדרי הבסיס של תאי המטרה בעלי ביטוי CSFE גבוה (CSFE high) וביטוי CSFE נמוך (CSFE low). מוצגת כאן אסטרטגיית ה-gating לזיהוי שינויים באוכלוסיות ה-CSFE. שער ראשוני (gate) נקבע באמצעות פרמטרי FSC ו-SSC.התאים החיוביים ל-CSFE בסך הכל עברו תת-גating, לפני הערכת השינויים בתדירות, מכיוון שאוכלוסייה זו קטנה יחסית בהשוואה לספנוציטים אנדוגניים לא מסומנים. דוגמה לתדירות היחסית של אוכלוסיות ה-CSFE לפני ההזרקה מוצגת כאן ואמורה להיות קרובה ליחס של אחד ለአחד. הצורך בהפעלת covex נראה בלוח זה, שבו לא נצפתה הריגה של תאי מטרה עם CSFE גבוה שקיבלו פעימה של אנטיגן, 24 שעות לאחר ההזרקה.איור זה מדגים הרגה יעילה של תאי מטרה עם סימון CFSE גבוה שעברו דחיסת אנטיגן (antigen-pulsed), שכן השיא שנצפה לפני ההזרקה כמעט ולא זוהה, והיחס השתנה באופן דרמטי מ-50% ל-1% זיהוי. לבסוף, האיור מראה גם את קינטיקת ההרגה של תאי מטרה עם סימון CFSE גבוה שעברו דחיסת אנטיגן, על ידי הערכת אובדן אוכלוסייה זו בנקודות זמן של 6 ו-24 שעות לאחר ההזרקה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך יומיים עד שלושה ימים, תלוי באנטיגן ובתפקוד תאי ה-T.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי סימון ה-CSFE חייב להיות אחיד, ויש להעריך את קינטיקת תגובת ה-CTL לפני ביצוע הבדיקה. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע גם שיטות אחרות כגון ELISA, ELISPOT וצביעה בציטומטריית זרימה תוך-תאית כדי להעריך שינויים בתפקוד האפקטורי ולענות על שאלות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של האופן שבו מעריכים תפקוד CTL in vivo בהיעדר זיהום או גידול.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של...

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

סרטון זה מדגים תא דנדריטי שמקורו במונוציטים, בדיקה מבוססת MoDC למדידת האימונוגניות של חיסונים זמינים מסחרית. מבחני MoDC חוקרים תגובות תאים דנדריטיים לאנטיגנים, פתוגנים או טיפולים ויכולים לספק תובנות לגבי תגובות חיסוניות, פיתוח חיסונים ומחקר אימונותרפיה.

בדיקת תאים דנדריטיים בפולסים במבחנה המבוססת על חיסון כדי לגרום לשגשוג לימפוציטים

הסרטון מדגים שיטה אימונולוגית לניטור in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte או CTL production. עכבר מוזרק מראש עם לימפוציטים CD8+ T מהונדסים גנטית, מוכתמים בצבע מתרבים. הזרקה תת עורית של אובלבומין עם אדג'ובנטים מייצרת לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ T המזוהים לאחר הקציר באמצעות אימונוסטיין וציטומטריית זרימה.

טכניקה אימונולוגית לניטור יצירת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T בתיווך אדג'ובנטי

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך&gt; 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

למדו לזהות הרג אנטיגני ספציפי בתוך הגוף במודל עכברי באמצעות שיטת CTL in vivo. הטכניקה מאפשרת הערכה ישירה ומהירה של פוטנציאל ציטוליטי ללא תלות בגידול גידולים או זיהום.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

גלה סרטונים נוספים