Name: הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: חקור את מנגנוני הפחתת הרגישות וההתאוששות של פוטורצפטורים בסרטן הנהרות באמצעות הקלטות חשמליות תוך-תאיות. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פעילות חשמלית תלוית מחזורים צירקדיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי D, UNAM IN224616-RN224616 גרנט. המחברים רוצים להודות לגברת ג'וזפינה בולאדו, ראש המחלקה לתרגום ניירות מדעיים, מאליפות דה בדיקה בפסולטד דה מדיטינה, UNAM, לעריכת הגרסה האנגלית של כתב יד זה.

הערה: הניסויים עומדים בחוק הגנת בעלי חיים של מקסיקו.
1. התקנה ניסויית
<ol><li>קשרים כלליים<ol>
<li>חבר את המגבר למחשב מתאים באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי והשתמש באולוסקופ כדי לנטר את הניסוי (איור 1).</li>
		<li>חבר את מגירוי התמונה ל-A/D המומר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תא הקלטה<ol>
<li>מניחים את חדר ההקלטה על גבי שולחן אנטי-רטט ומאתרים אותו בתוך כלוב פאראדיי. הערה: הדבר מונע רטט מכני ורעש חשמלי העלולים להשפיע על ההקלטה. כלוב פאראדיי היה עשוי. מרשת תיל חשוכה בבית, 2 מ ל, חדר הקלטה אקרילי משמש (איור 2).</li>
		<li>להכין את הפתרון אמבטיה כדי לשמור על ההכנה בחיים13: 205 מ"מ; 5 מ"מ KCl; 2 מ"מ MgSO4; 13 מ"מ קאל2; .7.3 מילימטר. הערה: הפתרון אינו כולל דקסטרוז או כל מבעבע על ידי 95% O2, 5% CO2 תערובת כי ההליך הניסיוני הוא קצר מספיק כדי לזהות נזק על ידי ההקלטה החשמלית (ראה שלב 4.2.3 לשלמות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אלקטרודות<ol>
<li>השתמש באלקטרודה מצופה כלוריד בחוט כסף כאלקטרודה ההפניה הערה: ציפוי כסף כלוריד חיוני כדי לאפשר תגובת האלקטרודה: AgCl (s)+ e-↔ Ag (s) + Cl-.</li>
		<li>חול חוט כסף (עובי ~ 1 מ"מ, אורך ~ 10 ס מ) עם נייר כיתה בסדר משובח כדי לנקות את פני השטח שלה.</li>
		<li>שטפו את חוט הכסף במים מזוקקים.</li>
		<li>הישאב את החוט הכסוף הנקי בתמיסה של 4-6% נתרן היפוכלוריט ("נלאו") עד שיופיע כהה (כ-20 דקות).</li>
		<li>השתמש בפיפטות זכוכית דקות מלאות בתמיסת אלקטרוליט (2.7 M KCl) כאלקטרודה תאיים.</li>
		<li>משוך צינור נימי זכוכית (קוטר פנימי ≈ 1 מ"מ) עם פולר מיקרו-פיילט כדי לקבל טיפ דק עם פתח קטן (0.01-0.1 מטרים)14.</li>
		<li>ממלאים את הזכוכית הקפילר עם פתרון 2.7 M KCl. ראשית למלא אותו על ידי קפילריות (לטבול את העצה הצינורות לתוך הפתרון 2.7 M KCl) ולאחר מכן למלא את החצי של הפיפטה עם מחט הזרקה קנס. אם יש צורך, הקש על הצנרת אלקטרודה כדי לחסל בועות אוויר.</li>
		<li>חבר את האלקטרודות למחזיק בו. חבר את המחזיק לשלב הכותרת של המגבר עם המגבר. הצב את השלב עם מחזיק האלקטרודות במיקרומניפולציה תלת-ממדית יציבה. הנמך את האלקטרודה עד שפתרון האמבטיה יכסה את קצהו. הערה: על האלקטרודה להיות בעלת אוריינטציה אנכית</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר במצב גשר של המגבר (במקטע ' מצב ' של המגבר, לחץ על הלחצן Bridge) ומלא את התנגדות האלקטרודה. ודא כי ההתנגדות היא כ 50 MΩ11. הערה: גודל האלקטרודה הזה מאפשר הקלטה חשמלית באיכות טובה עם נזק מוגבל לתא.</li>
	<li>Null את ההיסט הנוכחי ופיצוי הטרנזיטים קיבולי באמצעות לחצן החזקת מיקום במקטע קלאמפ מתח של המגבר, ואת לחצן ניטרול קיבוליות במקטע מיקרואלקטרודה 1 של המגבר.</li>
	<li>מערכת סופרפיוז<ol>
<li>יוצקים את הפתרון לאמבטיה (שלב 1.2.2) לתוך כלי קיבול מתאים (בקבוק סרום מ250 mL) ולחבר אותו לערכת אבובים השקיה (3.2 מ"מ קוטר פנימי), ובכך חיבור תא ההקלטה. השתמש במערכת היתוך הכבידה מונחה. ויסות קצב הזרימה ל-~ 0.5 mL/s.</li>
		<li>. חברו את התא למכשיר יניקה ויסות מערכת השאיבה של התמיסה באופן כזה, הנפח הכולל של תא ההקלטה אינו משתנה. . תשתמש במשאבת ואקום לשאיבה הערה: כמות קבועה בחדר ההקלטה חשובה לשמור על יציבות מתמדת במהלך הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. חומר ביולוגי
הערה: השימוש המבוגר הדגים P. clarkii (7-10 ס מ ארוך) בשלב intermolt של סקס ברור.
<ol><li>זמן מעגלי<ol>
<li>חודש לפני הניסויים, לשמור על 100 כלדגים תחת אור 12-h מחזור כהה 12-h15 (אור לבן, 2.4 kW/m2). הערה: חודש אחד מספיק זמן כדי לסנכרן את אוכלוסיית סרטני הסרטן.</li>
		<li>לקבוע את הזמן המעגלי של אוכלוסיית סרטני הסרטן על ידי הערכת משרעת של אלקטורנוגרמות של חמש בעלי חיים שנבחרו באופן אקראי15. הערה: הזמן של 0 h אחראי (CT 0) מציין את תחילתו של יום סובייקטיבי, כלומר, זמן שבמהלכו אורגניזם פעיל בדרך כלל16,17,18,19 (איור 3). סרטן הנהרות הוא חיה לילית, ולכן תחת מחזור כהה של 12 שעות או 12-h, הוא פעיל במהלך השלב האפל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוהל בידוד<ol>
<li>בזמן המעגלי הרצוי, השקיעה במים מהברז ב-0-4 ° c, במשך 15 דקות.</li>
		<li>בעזרת מספריים דקים, נתק את העיניים מהבסיס.</li>
		<li>גישה הרשתית באמצעות להב תער כדי ליצור פתח (~ 1-mm2) בקרנית הגבי.</li>
		<li>מניחים את קנה העין במרכז חדר ההקלטה (החור המכוסה בסיליקון) עם הגישה הפותחת לרשתית בחלק העליון של החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמרו על העיניים בחשיכה. מתמדת במשך 20 דקות הערה: 20 דקות מספיק זמן עבור התא תא קולט אור להיות כהה לחלוטין מותאם.</li>
</ol>3. פוטורקטור בחלוקה
<ol><li>הניחו את המיקרואלקטרודה ואת ציר האורך של העין במקביל באופן שהמיקרואלקטרודה ממורכזת לגישה לרשתית. השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי (10X) כדי למקם את ההתקנים בתצורה הנכונה.</li>
	<li>נטר את הפרש המתח בין אלקטרודות ההפניה וההקלטה על-ידי בחירת מצב Bridge11 של המגבר.</li>
	<li>הנמך את האלקטרודה לתוך האמבטיה ולאחר מכן למקם אותו ישר מעל הרשתית.</li>
	<li>הזיזו את המיקרוסקופ ומקמו את מנורת הפוטוגירוי במקביל לציר האורך של העין. הערה: המרחק בין המנורה לבין חדר הסופרפיוז הוא כ-15 ס מ.</li>
	<li>הנמך באיטיות את המיקרואלקטרודה עד שמתגלה ירידה פתאומית במתח. הערה: ירידה במתח של כ-50 mV מציינת את החלוקה של תא תא קולט אור בריא.</li>
	<li>לספק אור מבחן-פלאש (אור לבן, 7.2 kW/m2, 10 μs משך) כדי להקליט את הפוטנציאל הקולטן photorector. הערה: הפוטנציאל של קולטן photoreceptor הוא פוטנציאל הקיטוב של משרעת 10-15 mV ו 300 ms משך (איור 4).</li>
</ol>4. הקלטה חשמלית
<ol><li>ודא כי התאים תא קולט אור מותאמים לחלוטין לתנאים כהים (ראה שלב 2.3).<ol>
<li>העבר הבזק מבחן לאור כל 2 דקות. הפוך את הזמן בין הבזקים על-ידי בחירת ערך הולם (120 s) של "זמן בין פרקים" בתוכנה לרכישת נתונים. הערה: 2 דקות הוא הזמן הדרוש כדי לאפשר את ההתאוששות הכוללת של הזרמים המשמשים את תגובת החשמל של photoreceptor.</li>
		<li>לנטר את הפוטנציאל ממברנה המנוחה, כמו גם משרעת ומשך של פוטנציאל הקולטן. נניח כי תא קולט אור מותאם לחלוטין לאחר הפוטנציאל קרום, משרעת, ומשך הפוטנציאל הקולטן להישאר ללא שינוי. Eyestalks שמרו בעבר תחת חושך קבוע עבור 20 דקות (שלב 2.3) להשלים את ההסתגלות שלהם כ 5 דקות.</li>
		<li>הפסק לגרות את התא 2 דקות לפני הקלטת זרם מעורר האור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקלטה נוכחית<ol>
<li>הדק את המתח על הערך הפוטנציאלי של הממברנה הנמדד של התא על-ידי בחירה באפשרות "החזקת משרעת" בתוכנת רכישת הנתונים (בצורת גל באזור ערוץ הפלט האנלוגי).</li>
		<li>בחר במצב dSEVC של המגבר. במקטע ' מצב ' של המגבר, בחר את לחצן SEVC והחלף את המנוף במיקום הפירוק.</li>
		<li>הגדר את קצב המעבר ל-500-1000 הרץ (באמצעות לחצן התאמת קצב של המגבר), כפי שנקבע לפי מהירות האלקטרודה11.</li>
		<li>העבר מבזק אור, והתבונן בזרם היונים המעורר. הערה: זהו זרם הנוצר באור או התמרה (איור 5).</li>
		<li>חזור למצב גשר על המגבר והקלט פוטנציאל קולטן על-ידי שליחת הבזק אור (ראה סעיף 3). ודא כי התא תא קולט אור מותאם לחלוטין לתנאים כהים. למדוד את המאפיינים הפוטנציאליים לקולטן (משרעת ומשך) ולהשוות עם המידות הראשונות. להניח כי התא תא קולט אור שופד הוא תא בריא אם יש להם את אותם מאפיינים. הערה: לאחר אבלציה העיניים, הכנה ביולוגית הוא בר קיימא במהלך 2 השעות הבאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שני פרוטוקול פולס: למדוד את ההחלמה מפני הפחתת הרגישות עם שני פרוטוקול פלאש-light. הערה: שני הפרוטוקולים למבזק אור דומים לפרוטוקול המתח הסטנדרטי בעל שני הפעימות המשמש למדידת ההחלמה מפני הפעלה של ערוצים מגודרת במתח20. מבזק האור הראשון גורם לשינוי זמני ברגישות של התא תא קולט אור וההבזק השני מעריך את מצב מוליכות האור המופעל.<ol>
<li>. מסור זוג פולסים קלים החל את המבזק השני לאחר מרווח זמן רצוי (מ-300 ms עד 2 דקות).</li>
		<li>דיגיטייז את הזרמים בדגם של 10 KHz עם תוכנת רכישת הנתונים ושמרו את הנתונים לניתוח לא מקוון11. הערה: טבלה עם ערכי התצורה של התוכנה נכללת כחומר משלים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>קינטיקה של זרם האור מעורר<ol>
<li>מדוד שלושה פרמטרים נוכחיים: השהיית הפעלה L, הזמן שחלף ממסירה הבזק האור עד שהזרם מגיע ל -10% מהשרעת המקסימלית (איור 5); משרעת הפסגה או המקסימלית הנוכחית Ip; והפחתת הרגישות מתמדת T. מדידה קבוע הפחתת הרגישות (Τ) על ידי התאמת שלב ריקבון הנוכחי כדי: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq1.jpg"> כאשר, A =-I (t = 0) הוא קבוע חיובי (איור 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפחתת רגישות והתאוששות הערה: שחזור מתוך הפחתת רגישות הוערך כיחס p2/p1, כאשר p1 הוא הפרמטר הרלוונטי (או L, Ip, או T) של הפקד הנוכחי, ו-p2 הוא הפרמטר המתאים של המבחן השני זרם.<ol>
<li>העלילה p2/p1 (או L, Ip, או T) כפונקציה של זמן בין פולסים.</li>
		<li>בהתאם לפרמטר, התאם את הנקודות של כל מזימה ל: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq2.jpg"> או ל: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq3.jpg">
</li>
		<li>השתמש בבדיקה סטטיסטית מתאימה כדי לקבוע את מספר המונחים המעריכית הדרושים להתאמת הנתונים הניסיוניים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pigment+dispersing+hormone+on+the+electrical+activity+of+crayfish+visual+photoreceptors+during+the+24-h+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).</li>
<li>Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desensitization+and+recovery+of+crayfish+photoreceptors.+Dependency+on+circadian+time%2C+and+pigment-dispersing+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).</li>
<li>Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+protoc.+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological techniques.</a> Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).</li>
<li>Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrette%2C+R+%22Handbook+of+Neural+Activity+Measurement%22">Handbook of Neural Activity Measurement</a>. , 44-91 (2012).</li>
<li>Cummins, D., Goldsmith, T. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00605738">Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye.</a> J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).</li>
<li>Eguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhabdom+structure+and+receptor+potentials+in+single+crayfish+retinular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+and+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells.</a> J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).</li>
<li>Nosaki, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00340549">Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii.</a> Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).</li>
<li>Miller, C. S., Glantz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+adaptation+modulates+a+potassium+conductance+in+retinular+cells+of+the+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish.</a> Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+patch-clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Sperm patch-clamp.</a> Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).</li>
<li>Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B. , Springer Science & Business Media. (2013).</li>
<li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.3181/00379727-34-8647c">A physiological solution for freshwater crustacea.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22pipette+cookbook%22">pipette cookbook</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. 97(2008).</li>
<li>Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/030096298390573X">The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).</li>
<li>Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+sleep%3A+genetics%2C+cellular+physiology+and+subcortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. <a target="_blank" href="NULL">Circadian Clocks</a>. Aschoff, J. , North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19820591945">Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms</a>. Aschoff, J. , Plenum, New York. 94-124 (1981).</li>
<li>Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res.+Health%22%5BJournal%5D)">Overview of circadian rhythms.</a> Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).</li>
<li>Dircksen, H., Strauss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+crustaceans%3A+identified+neuronal+and+cellular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems.</a> Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).</li>
<li>Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+GTP-binding+protein+Gq+with+photoactivated+rhodopsin+in+the+photoreceptor+membranes+of+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish.</a> FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).</li>
<li>Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulated+localization+of+the+beta-subunit+of+Gq-type+G-protein+in+the+crayfish+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).</li>
<li>Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-modulated+subcellular+localization+of+the+alpha-subunit+of+GTP-binding+protein+Gq+in+crayfish+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors.</a> Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).</li>
</ol>

. אין לנו מה לגלות

סרטני הנהרות הוכיחו כמודל מצוין בשל יכולתה לשרוד בתנאים שאינם טבעיים. יש גישה קלה בvivo ובניתוחים אלקטרולוגיים מחוץ לגופית . בנוסף, סרטנים הם קבוצה חיובית עבור מחקר נוירוביולוגי בתחום הכרונוביולוגיה21השוואתי.
במאמר זה, המחקר של הפחתת הרגישות וההתאוששות של האור המופעל התמרה-זרם של תאי סרטן תא קולט אור מוצג באמצעות טכניקת ההקלטה תאיים. עם זאת, אנו מאמינים כי אותה טכניקה יכול להיות מותאם למערכות חזותיות אחרות חסרי חוליות כל עוד אפשר לגשת לתאים תא קולט אור...

כדי להיתפס כגירוי ויזואלי, האור המגיע לעיניים חייב להיות מחולק לאות חשמלי. מכאן, בכל האורגניזמים החזותיים, אור מפעיל יון התמרה-זרם, אשר בתורו מייצרת שינוי בפוטנציאל הממברנה של התאים תא קולט אור, הפוטנציאל הנקרא הקולטן. בשל כך, הרגישות הקלה של העין תלויה בעיקר במצב של מוליכות האור המופעלת, שיכולה להיות זמינה להפעלה או לחוסר הרגישות.
ב מנועי סרטן הנהרות, אור מעורר איטי, ארעי, זרם יוני1. עם התאורה, הזרימה הנוכחית מתעוררת לאחר השהיה או השהיה לפני שהגיעה למקסימום; לאחר מכן הוא decays כמו ערוצי התמרה ליפול למצב מתחת לחוסר הרגישות שבו הם אינם מגיבים לגירוי אור נוסף2. כלומר, אור, בנוסף להפעלה האחראית הנוכחית של חזון, משרה גם הפחתה ארעית של הרגישות של תאים תא קולט אור. הפחתת רגישות עשויה לייצג מנגנון הגנה כללי מפני חשיפה יתר לגירוי מספיק. הרגישות של העין לאור הוא התאושש כאשר מוליכות התמרה משחזרת מתוך הפחתת רגישות.
הקלטה תאיים היא טכניקה שימושית למדידת פעילות חשמלית של תאים להתרגש3,4,5,6,7,8. למרות הקלטה תאיים הפכה להיות פחות תכופים עם הופעתו של התיקון מהדק טכניקה9, זה עדיין גישה נוחה כאשר התאים הם קשים לבידוד, או להציג הגיאומטריה שהופך את היווצרות של התיקון-החותמות giga-אטמים קשה (כלומר, חותמות או קשר הדוק בין האלקטרודה תיקון ממברנות עם עמידות החשמל של הסדר של 109ohms). דוגמאות לאלה הן תאי זרע10 ותאים תא קולט אור כאן למדו. הניסיון שלנו, מאוד קשה לבודד ולשמור בתרבות הראשית; בנוסף, הם מוטות דקים הופכים giga-חותם היווצרות קשה להשיג. בהקלטות תאיים, אלקטרודה חדה מתקדמת לתא שנשמר במקום על ידי הרקמה הסובבת. האלקטרודה קצוצה על-ידי המעגלים העוברים במהירות גבוהה של המגבר, ולכן הזרם מנדגם בין פולסים במתח. מצב זה ידוע כתפס מקוטע של מתח יחיד באלקטרודה (מצב dSEVC)11. ההתנגדות הגבוהה (פתיחה קטנה) של האלקטרודה מעכבת את החילוף התפוצא בין התא לפתרונות הפיפטה, ומניב הפרעה מינימלית של הסביבה התאיים3. חיסרון פוטנציאלי של טכניקה זו היא כי החדרת אלקטרודה עשויה לייצר זרם דליפה לא סלקטיבי; לכן, יש לנקוט טיפול כדי למנוע הקלטה מתאים בהם גודל זרם הדליפה עלול להפריע למידות המיועדות4,12.
בזאת, אנו משתמשים בגבעולי סרטנים מבודדים כדי להעריך את הפחתת הרגישות וההתאוששות של מוליכות האור המופעל על ידי ביצוע הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור באמצעות מהדק מתח התנאים.

<table><tbody><tr><td>Axoclamp2A&nbsp;</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>מגבר</td></tr><tr><td>Digidata 1200 ממשק</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Digitizer</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ TDS430A</td><td>Tektronix</td><td></td><td>אנלוגי אוסילוסקופ</td></tr><tr><td>פוטוסטימולטור PS33 פלוס</td><td>דשא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנורת חולץ PC-100</td><td>Narishige</td><td></td><td>Micropipette</td></tr><tr><td>חולץ חולץ P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Micropipette Puller</td></tr><tr><td>זכוכית צינור נימי Kimax-51</td><td>Kimble Products</td><td>34502</td><td>0.8, 1.10, 100 מ"מ</td></tr><tr><td>HS-2</td><td>Headstage Axon Instruments Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headstage מיקרומניפולטור MX-4</td><td>Narishige</td><td></td><td>מיקרומניפולטור מכני</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Axon תוכנת</td> רכישת נתונים של Instruments Inc <td></td><td>עבור ממשק digidata 1200</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח Clampfit</td><td>Axon Instruments, Inc</td><td></td><td>מקושרת ל-pClamp</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td>תוכנת ניתוח נתונים וגרפים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S7653</td><td>>99.5%</td></tr> <tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P-9333</td><td>מינימום 99%</td></tr> <tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא</td><td>M7506</td><td>מינימום 99.5%</td></tr> <tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>C5080</td><td>מינימום 99.0%</td></tr> <tr><td>הפס</td><td>סיגמא</td><td>H7523</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>S8045</td><td>98.00%</td></tr> <tr><td>תמיסת נתרן היפוכלוריט</td><td>סיגמא</td><td>425044</td><td>כלור זמין, 10-15%&nbsp;</td></tr></tbody></table>

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

שיטה לחקר הפחתת רגישות והתאוששות של מנועי סרטן הנהרות מוצגת. ביצעת הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור בתוך העיניים מבודדים באמצעות אלקטרודה רציפה בודדת ממותגת מתח-מהדק התצורה. עם סכין גילוח הצלחנו לפתוח את הקרנית. כדי לקבל גישה לרשתית העין לאחר מכן, הוספת אלקטרודה זכוכית דרך הפתח, וחדרה לתא כפי שדווח על ידי הקלטה של פוטנציאל שלילי. פוטנציאל הממברנה היה מהודק בפוטנציאל המנוחה של photoreceptor והדופק האור הוחל על הפעלת זרמים. בסופו של דבר, שני פרוטוקול פלאש האור הועסק כדי למדוד את הפחתת הרגישות וההתאוששות הנוכחית. האור הראשון מפעיל הבזק, לאחר תקופת השהיה, הזרם היוני התמרה, אשר לאחר שהגיע משרעת שיא לקראת מדינה בעלת הרגישות למדינה; ההבזק השני, המוחל במרווחי זמן משתנים, מעריך את מצב הכיוון של מוליכות האור המופעלת. כדי לאפיין את הזרם, שלושה פרמטרים נמדדו: 1) השהיה (הזמן שחלף בין מסירת פלאש קלה לבין הרגע שבו הנוכחי משיגה 10% מהערך המירבי שלו); 2) השיא הנוכחי; ו 3) הפחתת הרגישות קבוע זמן (קבוע זמן מעריכי של השלב ריקבון הנוכחי). כל הפרמטרים מושפעים מהפעימה הראשונה.
כדי לכמת התאוששות מהפחתת הרגישות, היחס p2/p1 היה מועסק לעומת הזמן בין פולסים. p1 היא הפיסגה העדכנית מעורר על ידי פולס האור הראשון, ו p2 הוא השיא הנוכחי מעורר על ידי הדופק השני. נתונים אלה הותאמו לסכום של פונקציות מעריכי. לבסוף, המידות האלה בוצעו כפונקציה של זמן מעגלי.

ראשון, פוטנציאל קולטן הנציג של התאים של סרטן הסרטנים תא קולט אור מתקבל (איור 4). לאחר מכן, הוחל הבזק מבחן על מנת להפעיל את זרם האור הנוכחי (איור 5). הזרימה הנוכחית מפעילה לאחר השהיה, ומגיעה למצב מקסימלי ולאחר מכן יורדת לאט לתוך המדינה הסופגת בצורה מאוד מרחיקת לכת שממנה היא מתאוששת באיטיות.
סביר להניח שההשהיה הארוכה L (עשרות אלפיות שניה) תלויה באי...

פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללמוד desensitization והתאוששות רגישות של photoreceptors סרטנים כפונקציה של הזמן הביולוגי, באמצעות הקלטות חשמליות בין תאיים של תאים photoreceptor במלאי עיניים מבודד, באמצעות אלקטרודה אחת רציפה עברה תצורת מתח מתח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון התלות בזמן הביולוגי של כל כך הרבה תכונות אלקטרו-פיזיולוגיות של פוטורצפטורים בהשבתה והתאוששות. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מאפשרת מדידה של הפעילות החשמלית של פוטורצפטורים.למרות הקושי לבודד תאים ומבלי להפריע למילייה תאי. הדגמת הליך זה יהיו הרופאים קרולינה Barriga-Montoya ו Araceli דה לה O-Maritnez, עמיתים לעבודה של המעבדה שלנו. כדי להכין את האלקטרודה תאית, למשוך את צינור נימי זכוכית עם מושך micropipette כדי לקבל קצה דק עם פתח קטן.לאחר מכן, למלא את זכוכית נימי משך עם 2.7-טוחן אשלגן כלורי פתרון על ידי נימים ולאחר מכן, למלא חצי פיפטה עם מחט הזרקה בסדר. במידת הצורך, הקש על פיפטה אלקטרודה כדי לחסל בועות אוויר. לאחר מכן, מניחים את האלקטרודה על המחזיק שלה.חבר את המחזיק לשלב ראש המגבר עם המגבר. לאחר מכן, מקם את שלב הראש של מחזיק האלקטרודה עם מיקרומניפולטור תלת-מית יציב. מנמיך את האלקטרודה עד שתסתר האמבטיה מכסה את הקצה שלה.בחר את מצב הגשר של המגבר ולמדוד את ההתנגדות אלקטרודה. ודא כי ההתנגדות היא כ 50 מגה-הם. בטל את זרם ההיסט ופצה על ארעיים קיבוליים באמצעות לחצן מיקום ההחזקה במהדק מתח המקטע של המגבר ולחצן נטרול הקיבוליות בחלק Microelectrode 1 של המגבר.כדי לבנות את מערכת היתוך סופר, יוצקים את פתרון האמבטיה לתוך כלי קיבול מתאים ולחבר אותו סט צינורות השקיה, ובכך לחבר את תא ההקלטה. השתמש במערכת עירוי-על מונחית כבידה. לווסת את קצב הזרימה ל 0.5 מיליליטר לשנייה.חבר את התא להתקן יניקה. לווסת את מערכת יניקת הפתרון עם משאבת ואקום באופן כזה שהנפח הכולל של תא ההקלטה אינו משתנה. כדי לבודד את מלאי העיניים של סרטנים בוגרים, נתק אותו מהבסיס עם זוג מספריים עדין.הפוך פתח של מילימטר מרובע אחד בקרנית הגב באמצעות סכין גילוח כדי לגשת לרשתית. לאחר מכן, מניחים את מלאי העיניים במרכז תא ההקלטה עם הפתח לרשתית הפונה כלפי מעלה. שמור את מלאי העין בחושך במשך 20 דקות.מניחים את המיקרו-אלקטרוד במקביל לציר האורך של מניות העין באופן כזה שהמיקרו-אלקטרוד מרוכז כדי לגשת לרשתית. השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי למקם את ההתקנים בתצורה הנכונה. לאחר מכן, נטר את הפרש המתח בין ההפניה לבין אלקטרודות ההקלטה על-ידי בחירת מצב הגשר של המגבר.מנמיך את האלקטרודה לאמבטיה ומ מניח אותה ממש מעל הרשתית. הסר את המיקרוסקופ ומקם את מנורת פוטוטימולטור במקביל לציר האורך של מניות העין. לאחר מכן, מנמיך באיטיות את המיקרו-אלקטרוד עד לגילוי ירידת מתח פתאומית.לאחר מכן, לספק הבזק אור הבדיקה כדי להקליט את פוטנציאל הקולטן של photoreceptor. כדי להשיג הקלטות מתאימות של זרמים מעוררי אור, זה קריטי כדי להפוך פגיעה טובה של תא פוטורצפטור בריא. בהליך זה, מהדקים את המתח בפוטנציאל הממברנה הנמדד של התא על ידי בחירת משרעת מחזיקה בתוכנת רכישת הנתונים.לאחר מכן, בחר את מצב DSEVC של המגבר. במקטע המצב של המגבר, בחר בלחצן SEVC והבריד את הידית לדיסקונט. עמדת SEVC.הגדר את קצב המיתוג ל- 500 עד 1,000 הרץ, כפי שנקבע על-ידי מהירות האלקטרודה. לאחר מכן, לספק הבזק אור ולצפות שטף היונים עורר. לאחר מכן, לספק זוג פולסים אור ולהחיל את ההבזק השני לאחר מרווח הזמן הרצוי.הפוך את הזרמים לדיגיטליים בדגימה של 10 קילוהרץ באמצעות תוכנת רכישת הנתונים ושמור את הנתונים לניתוח לא מקוון. מוצג כאן הוא פרוטוקול שני פעימות. גירויים קלים יישמו באפס אלפיות שנייה ו-700 אלפיות שנייה.נתון זה מציג את ההתאוששות מניתוח רגישות. הנה התאוששות השהיה, הנה התאוששות זרם שיא, והנה זמן רגישות התאוששות טאו מתמדת. ניסויים בוצעו באפס שעות בסביבות הזמן הביולוגי.נתון זה מציג את ההתאוששות מניתוק רגישות כפונקציה של הזמן הביולוגי. זוהי התאוששות iP, זוהי התאוששות L, וזה התאוששות טאו, וגרף זה מראה את קבועי הזמן משוקלל. תהליכים ביפאיים מסומנים בחץ.לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד שעתיים, אם זה נעשה כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכוון רעש נמוך זרם דליפה נמוכה, פגיעה פוטורצפטור. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו בדיקות פרמקולוגיות, ניתן לעשות על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מעורבות של ערוצים מסוימים, קולטנים, או איתות מסלולים.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את התלות בזמן הביולוגי של תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי פוטורצפטור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ללמוד רגישות והתאוששות של זרם טרנסדוקציה מופעל אור באמצעות טכניקת הקלטה תאית.

desensitization-recovery-crayfish-photoreceptors-upon-delivery-light

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרט זה אנו מבצעים הקלטה electroretinogram, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal עם הסרטן האמריקנית...

שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

פיתחנו שתי שיטות ללימוד ההשפעות של רמזים חזותיים על התנהגות בהיעדר רמזים משושי כימיים. שיטה אחת כרוכה התגובות בווידיאו של סרטנים על קירות רעיוני באקווריום, והשני בוחן את ההשפעות של תשומות חזותיים הניתנים על ידי סרטנים חי מאחורי מחיצה שקופה.

הקלטה תגובות התנהגותיות כדי השתקפות של סרטן הנהרות

סרטון זה מדגים את גידולו של Drosophila melanogaster בתנאי אור ספציפיים כדי לחקור את תפקידם של חלבוני Bruchpilot בשחרור מוליכים עצביים ואת המודולציה הנובעת מכך של פעילות סינפטית.

אפנון סינפטי בדרוזופילה לאחר חשיפה לאור ממושך

אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

מיפוי מעגל בסיוע (CRACM) הוא טכניקה מדויקת עבור מיפוי פונקציונלי של הקרנות נוירואליות ארוכת טווח בין קבוצות מבחינה אנטומית ו/או גנטית מזוהה של נוירונים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש CRACM כדי למפות את הקשרים שמיעתי גזע המוח, כולל השימוש של opsin העביר אדום, ChrimsonR.

מתקשר לטווח ארוך-מיפוי מעגל בסיוע של היפוקולוס נוירונים בצבע כחול ואדום הוזז

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

חקור את מנגנוני הפחתת הרגישות וההתאוששות של פוטורצפטורים בסרטן הנהרות באמצעות הקלטות חשמליות תוך-תאיות. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פעילות חשמלית תלוית מחזורים צירקדיים.

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

גלה סרטונים נוספים