פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבנות ספריות RNA מדריך מקיפות מ-DNA מטוהר מכל מקור. ספריות gRNA הן אוספי פלסמיד המשמשים במסכים מבוססי CRISPR. שיטת CORALINA משתמשת בעיכול אנזימטי של DNA מטוהר כדי לשכפל את השברים המתקבלים לעמוד השדרה של ספריית RNA מנחה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת את כל ה-RNA המנחה האפשרי מרצף הקלט והיא חסכונית מאוד. למרות שסרטון זה מדגים את ההגנה של ספריית CORALINA מפני כרומוזום מלאכותי חיידקי, ניתן ליישם שיטה זו באופן עקרוני על כל סוג של DNA קלט מכל אורגניזם. יש לבצע אופטימיזציה של עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי עבור כל אצווה חדשה של מיקרוקוק נוקלאז.

הגדר את הדברים הבאים עבור כל תגובה. מיקרוליטר אחד של מאגר נוקלאז מיקרוקוקלי פי 10, אלבומין סרום בקר אחד, מיקרוגרם אחד של DNA מטרה, מיקרוליטר אחד של נוקלאז מיקרוקוקלי ומים עד 10 מיקרוליטר. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

השבת מיד את האנזים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 500 מילי-מולרי EGTA. הוסף מאגר דגימה עם צבע טעינת ג'ל לדגימות ה-DNA וטען מיקרוגרם אחד של DNA לבאר בג'ל פוליאקרילאמיד של 20%. טען סולם DNA מתאים לגודל.

הפעל את הג'ל במאגר ריצה של 1x TBE ב-150 וולט למשך כ-1.5 שעות או עד שחזית הצבע התחתונה מגיעה לקצה התחתון של הג'ל. צבעו את הג'ל באמצעות כתם חומצת גרעין רגיש במיוחד ודמיינו תחת אור UV. בדוגמה זו, הריכוז האופטימלי של נוקלאז מיקרוקוקלי לעיכול הדנ"א לגודל של 20 עד 30 זוגות בסיסים היה 10 יחידות.

השתמש בריכוז אופטימלי זה של נוקלאז מיקרוקוקלי כדי לעכל 10 עד 12 מיקרוגרם של DNA מטרה באותו אופן שהודגם עבור תגובות האופטימיזציה. לאחר הפרדת שברי ה-DNA על ידי PAGE, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את הג'ל ליד נתיב הסמן ולהכתים רק את החלק של הג'ל המכיל את הסולם עם מאגר ריצה טרי של 1x TBE המכיל כתם חומצת גרעין רגיש במיוחד. דמיין את סולם ה-DNA והשתמש בסכין גילוח כדי לכרות מקטעי DNA מעוכלים של מיקרוקוק נוקלאז בטווח הגדלים שבין כ-18 ל-30 זוגות בסיסים.

מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור מיקרו-צנטריפוגה. מכתים את שארית הג'ל בכתם חומצת גרעין כפי שהוצג קודם לכן. חשוף את הג'ל לאור UV ורכוש תמונה כתיעוד של שלב כריתת הג'ל.

התחל הליך זה על ידי שימוש בקצה פיפטה סטרילי כדי לרסק את פרוסת הג'ל הכרותת כנגד דופן צינור המיקרו-צנטריפוגה. הוסף שני נפחי ג'ל של מאגר מסיסות PAGE ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת למשך 16 שעות. למחרת, צנטריפוגה את הדגימה במיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה.

העבירו את הסופרנטנטים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש תוך הקפדה לא להעביר חתיכות ג'ל כתושות. הוסף 0.5 נפחים של מאגר מסיסות PAGE לגלולת הג'ל, מערבולת וחזור על הצנטריפוגה. שלב את הסופרנטנטים וחלץ את שברי ה-DNA בשיטת מיצוי פנול-כלורופורם סטנדרטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במקביל לבידוד של שברי DNA, הגבירו את המקשרים מווקטור ביטוי ה-RNA המנחה באמצעות PCR סטנדרטי. כדי להבטיח שיבוט כיווני, המחברים מתעכלים לאחר מכן עם אנזימי ההגבלה המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל את עיכול אנזימי ההגבלה של המקשרים על ג'ל אגרוז של אחוז אחד.

הסר את הרצועות הנכונות וטהר את ה-DNA מחתיכות הג'ל שנכרתו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. ערכת קהות DNA משמשת לתגובת התיקון הסופית. הוסף את הדברים הבאים לצינור מיקרופוגה.

10 מיקרוליטר של DNA מטוהר, 1.5 מיקרוליטר של מאגר קהה פי 10, 1.5 מיקרוליטר של תערובת dNTP מילי-מולרית אחת, 1.4 מיקרוליטר מים ו-0.6 מיקרוליטר של אנזים קהה. דגירה בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן חימום והפעלה של האנזים על ידי דגירה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף 85 מיקרוליטר מים ובצע ניקוי תגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הגדר תגובת קשירה של 14 מיקרוליטר תוך שימוש בכמויות מולאריות שוות של נוקלאז מיקרוקוקלי מעוכל ומתוקן ורצפי קישור כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר תרגום הכינויים, תוצר הקשירה מוגבר על ידי PCR. כדי להפריד מקטעי נוקלאז מיקרוקוקליים עם חמשת הראשוניים ושלושת המקשרים הראשוניים המחוברים כהלכה משברים עם שניים חמישה ראשוניים או שניים שלושה מקשרים ראשוניים, שלבו את כל 15 תגובות ה-PCR המחזוריות, הוסיפו צבע טעינת DNA והפעילו על ג'ל אגרוז 0.8%.

הסר את הרצועה הבולטת ב-869 זוגות בסיסים וטהר את ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. כמת את כמות ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, שיבוט השברים המוגברים של ה-PCR לווקטור ביטוי ה-RNA המנחה על ידי הרכבת גיבסון כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל בהליך זה, aliquot הכנסת וקטור מטוהר לתוך צינורות PCR סטריליים ומקוררים מראש ולשמור על קרח. מצננים קוביות אלקטרופורציה במרווח של מילימטר אחד על קרח. הוסף 25 מיקרוליטר של תאי TG1 טריים שהוכנו ישירות למנה אחת של DNA והעביר מיד את התערובת לקוביית אלקטרופורציה.

החלק או הקש על הקובט כדי להבטיח שהתאים ותערובת ה-DNA מפוזרים לאורך תא הקובט ללא אוויר כלוא או בועות. הנח את הקובט בתא ההחלקה והתחל את תוכנית האלקטרופורציה המתאימה. הוסף מיד לקובט 475 מיקרוליטר טמפרטורת החדר 2TY.

העבירו את החיידקים החשמליים לצינור של 50 מיליליטר. חזור על האלקטרופורציות הבודדות, אסוף את כל התאים שעברו טרנספורמציה בספרייה אחת בשפופרת אחת של 50 מיליליטר ותעד את הנפח הכולל. כדי להעריך את המספר הכולל של מושבות עבור הספרייה כולה, צלח כמות קטנה מוגדרת של חיידקים שעברו טרנספורמציה עם הספרייה על צלחת אגר של 10 סנטימטר עם מבחר אנטיביוטיקה מתאים.

כדי להפחית את נפח שאר החיידקים, צנטריפוגה בטמפרטורה של כ-4,000 גרם למשך 10 דקות או עד שנוצרת פלטה גלויה והסופרנטנט נראה צלול. הסר את כל הסופרנטנט מלבד כמה מיליליטר והשהה מחדש את התאים. צלחו את החיידקים על צלחות ביולוגיות מצופות אגר 2TY המכילות את מבחר האנטיביוטיקה המתאים.

מורחים נפח מתאים של תגובת האלקטרופורציה של בקרת pUC19 על צלחת אגר נוספת של 10 סנטימטר עם בחירת אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו את צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, ספרו את מספר המושבות על הלוחות המבוקרים כדי להעריך את יחידת יצירת המושבה למיקרוגרם DNA עבור החיידקים וכן את מורכבות הספרייה.

לבסוף, מגרדים את החיידקים מהצלחת לצורך מיצוי DNA פלסמיד. לאחר טיהור הג'ל, 1/6 משברי המיקרוקוק נוקלאז המטוהרים הועמסו על ג'ל 20% PAGE כדי לאשר בחירת גודל וטיהור מוצלחים. אמפליקונים מקשרים עוכלו עם אנזימי הגבלה כדי להבטיח שהמקשרים נקשרים על המקטעים המעוכלים של נוקלאז מיקרוקוקל בכיוון הנכון.

הצד השמאלי של תמונת הג'ל המייצגת הזו מציג חמישה מקשרים ראשוניים ושלושה מקשרים ראשוניים לפני ואחרי העיכול עם HindIII ו-SacII בהתאמה, מה שמצביע על עיכול מלא של המקשרים ל-637 זוגות הבסיסים ו-295 זוגות הבסיסים המנבאים. הצד הימני של תמונת הג'ל מתעד את כריתת שברי המקשר המעוכלים. קשירה מוצלחת של מקשרים לקטעי DNA נותחה באמצעות PCR עם מספר מוגבר של מחזורי PCR.

הפקדים שנכללו היו פקד ללא תבנית המשתמש בפקד ללא תבנית משלב תרגום הכינוי הקודם כקלט ובקרת מקטע נוקלאז ללא מיקרוקוק. רק דגימות שבהן שולבו שברי נוקלאז מיקרוקוקליים עם DNA מקשר ייצרו את האמפליקון הצפוי של 869 זוגות בסיסים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמישה ימים אם היא נעשית כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על מורכבות הספרייה ולבצע תגובות בקרה אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד ליצור ספריית RNA מנחה עבור מסכים מבוססי CRISPR על ידי קיצוץ DNA לחתיכות קטנות ושיבוטם לתוך עמוד השדרה הווקטורי של הספרייה.