אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את היעילות של התמדה התאית וההפצה הביולוגית של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי בדלקת מפרקים ניוונית בברך חולדה, או במודל KOA, באמצעות הדמיה פלואורסצנטית in vivo. מעקב אחר תאי גזע in vivo יכול לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום המתמטיקה הרגנרטיבית לגבי גירוי והפצה של שומן אנושי שמקורו בתאי גזע מזנכימליים במודלים של בעלי חיים KOA. היתרון העיקרי בשימוש ב-DiD הוא שספקטרום הפליטה המוסט על ידי חולדה מאפשר הדמיית רקמות עמוקות בבעלי חיים ללא השפעות ציטוטיות או נזק תפקודי לתאים המסומנים בצבע.

התחל בהנחת חולדה מורדמת במשקל 250 עד 300 גרם, בת שמונה עד 12 שבועות במצב רוחבי שמאלי על כרית מחוממת. השתמש בסכין גילוח כדי לגלח היטב את ברך ימין, ולחטא את אזור הניתוח בתמיסת יוד 10% פובידון ו-70% אתנול. כסו את האזור הלא ניתוחי עם פד כירורגי.

והשתמש באזמל כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים לרוחב לאורך גיד הפיקה כדי לחשוף את קפסולות המפרק. לאחר מכן, השתמש באזמל כירורגי כדי לחצות את הרצועה הקולטרלית המדיאלית, המשקפת את המניסקוס לכיוון עצם הירך, ותפס את המניסקוס המדיאלי בעזרת מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את המניסקוס בנקודה הצרה ביותר שלו מחיבור השוקה.

כדי להשיג התחלה אמינה ואפשרית של KOA, יש לחתוך לחלוטין את צד הירך של המניסקוס בכל חיית ניסוי. לאחר מכן, סגור את קפסולת המפרק עם תפר 4-O הניתן לצפייה ועקוב אחר החולדה עד שהיא מתאוששת לחלוטין. שמונה שבועות לאחר הניתוח, נתק תאים מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי מתרבית משולבת של 80% עם שני מיליליטר טריפסין בתוספת EDTA למשך שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מספר דקות, נטרלו את הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית שלם ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בריכוז חד פעמי של 10 עד שישית תאים למיליליטר בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית נטול סרום. ותייגו את התאים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת תיוג תאי DiD למשך 50 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ושוטפים אותם פעמיים בחמישה מיליליטר PBS לכל שטיפה. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, יש לדלל את התאים ל-2.5 כפול 10 עד התאים השישיים לכל 100 מיקרוליטר של ריכוז PBS ולהעמיס את התאים למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26. לאחר מכן, יש לגלח מחדש את הברך הסובלת מדלקת מפרקים של חיית הניסוי הראשונה שחשפה את אזור המפרק, ולחטא את העור החשוף באתנול 70%.

הזרקו את התאים המסומנים למרכז המשולש שנוצר על ידי הצד המדיאלי של רצועת הפיקה, הקונדיל המדיאלי של עצם הירך והקונדיל הטיביאלי המדיאלי, ופתחו את תוכנת ההדמיה. אתחל את מערכת ההדמיה הביו-לומינסנציה in vivo ומקם את בעלי החיים במצב שכיבה בתוך השלב המרכזי של מערכת ההדמיה. כשדלת החדר סגורה, סמן את תיבת הפלואורסצנט ובחר את ערכות מסנני הפלורסנט המתאימות.

הגדר את שדה הראייה ל-D, את כיפוף הפיקסל לשמונה, את ה-F Stop לשתיים ואת זמן החשיפה לאוטומטי. לאחר השגת התמונות, אפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חום עם ניטור עד להחלמה מלאה. לאחר מכן, בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה, בחר את יחידות יעילות הקרינה למדידת הקרינה ואת אזורי העניין לניתוח וכימת את האותות הפלואורסצנטיים מכל תמונה.

בניסוי מייצג זה, חלקים סדרתיים של מפרק הברך של חולדה הנגרמת על ידי דלקת מפרקים ניוונית בברך הוערכו על ידי H&E וצביעה של ספרנין O/Fast Green שמונה שבועות לאחר הניתוח. עובי הסחוס המפרקי דק יותר בברכיים הסובלות מדלקת מפרקים מאשר במפרקים הנגדיים ללא ניתוח, כפי שנצפה בחלקים המוכתמים ב-H&E. יתר על כן, הפרוטאוגליקן יורד והקולגן הפרפור מוגבר במפרק דלקת המפרקים כפי שמוצג על ידי צביעת ספרנין O/Fast Green, מה שמעיד על התקדמות הפנוטיפ הניווני של דלקת מפרקים ניוונית בברך המושרה על ידי הניתוח.

שעה לאחר הצביעה, תאים מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי המסומנים על ידי DiD מציגים צורה עגולה במבחנה. לאחר 24 שעות, תאים מזנכימליים מתורבתים המסומנים ב-DiD מדגימים צורת ציר ארוכה המאשרת כי DiD אינו משנה את יכולת ההיצמדות של התאים. הדמיית הברכיים של בעלי החיים הסובלים מדלקת מפרקים אוסטאוארטריטית שמונה שבועות לאחר הניתוח מגלה את נוכחותם של התאים המסומנים ב-DiD מיום האפס ועד היום ה-70 לאחר ההזרקה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בתאי גזע לקבוע את השגרה והמינון האופטימליים להזרקה בטוחה ואפשרית של תאי גזע מזנכימליים לטיפול בדלקת מפרקים ניוונית בברך בבעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג תאי גזע מזנכימליים אנושיים עם DiD להזרקה ומעקב in vivo במודל KOA של חולדה המושרה בניתוח.