הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכוון ביעילות את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי אפיתל פיגמנט ברשתית בשכבה הומוגנית. שיטה זו מסייעת לענות על שאלות בתחום חקר הרשתית והעיניים כגון כיצד מתפתחת הרשתית וכיצד לבסס מודל למחלת תאי גזע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ויעילה יותר משיטות ספונטניות.

שיטה זו משתמשת בשילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לכוון את ההתמיינות של תאי גזע להפוך ל-RPE לא בשלים תוך 14 יום ול-RPE תפקודי בוגר לאחר שלושה חודשים. תדגים חלקים מההליך קסידי ארנולד, מנהלת שותפה של המעבדה לביולוגיה והנדסה של תאי גזע באוניברסיטת קליפורניה בסנטה ברברה. כדי להתחיל בהליך זה, גדל מושבות תאי גזע בתנאים נטולי הזנה וללא סרום עד למפגש של כ-80% לפני המעבר.

לאחר מכן מצפים צלחת של 12 בארות בהידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית לפי המלצות היצרן ומניחים לה להתייצב למשך שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לציין את נפח אמצעי ההתמיינות ברשתית ו-PBS ללא סידן או מגנזיום הדרושים ליום האפס ולחמם אותם באמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף את גורמי הגדילה ל-RDM המחומם והביא את ה-EDTA לטמפרטורת החדר.

במידת הצורך, הסר את כל המושבות הממויינות באמצעות קצה פיפטה P10 המבוסס על מורפולוגיה מתאי הגזע שיעברו להתמיינות. תאים פיברובלסטיים בין מושבות כמו גם התאים האטומים בתוך המושבות מצביעים על התאים המובחנים שיש להסיר. הסרה ידנית של תאים היא אחד השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול מכיוון שהתחלה עם אוכלוסיית תאי גזע לא ממוינים לחלוטין תאפשר העשרה יעילה יותר.

לאחר מכן, העבירו באר אחת של צלחת של שש בארות לארבע בארות של צלחת של 12 בארות על ידי שאיבת המדיום מתאי הגזע ושטיפת הבארות פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS שחומם מראש. לאחר מכן יש לשאוב את ה-PBS ולשטוף כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של EDTA לבאר. לאחר מכן הטה בעדינות את הצלחת ושאף את ה-EDTA.

אין לערבב את הצלחת בשום צורה כדי למנוע הרמה מוקדמת של התאים. לאחר הכביסה השלישית, הוסיפו שוב מיליליטר אחד של EDTA ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר במכסה המנוע למשך שלוש עד חמש דקות. אל תפריע לצלחת במהלך הדגירה הזו.

לאחר מכן, שאפו את ה-EDTA והוסיפו מיליליטר אחד של RDM לכל באר שיושב בתוספת 0.5 מיליליטר של מדיום נוסף. לדוגמא, שטפו באר אחת של צלחת שש בארות עם 4.5 מיליליטר RDM לצלחת על ארבע בארות של צלחת 12 בארות. לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי לנתק בעדינות את התאים.

שלשו את התאים ב-RDM על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים בבאר והשלימו שלב זה במהירות כדי למנוע היצמדות מחדש לצלחת. מניחים בצינור חרוטי. נתק גושים גדולים של תאים אך אינו משולש לתרחיף תא בודד.

חלקו את התאים באופן שווה בפיפטה והשלימו שלב זה במהירות כדי למנוע הצמדה מחדש לצלחת. אם תרצה, השתמש במיקרוסקופ אור כדי להתבונן בגודל גושי התאים. לאחר מכן, זרעו את התאים על צלחות מצופות ECM עם 12 בארות.

הטה את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה בכל הבארות והנח אותה באינקובטור תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד לשינוי המדיום הבא. בהליך זה, מצפים צלחת בת שש בארות עם גורם גדילה מופחת ECM לפי המלצות היצרן. הניחו לו להתייצב למשך שעה בטמפרטורת החדר במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן ציינו את כמות ה-DPBS הדרושה ומיליליטר אחד של RDM לבאר העשרה וחממו אותם ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. הביאו את האנזים דמוי הטריפסין לטמפרטורת החדר וחממו את הכמות הנדרשת של RPE התומך במדיום עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף ריאגנט אנטי-מיקרוביאלי ומעכב ROCK ל-RSM כדי להשיג ריכוז סופי של מעכב ROCK אנטי-מיקרוביאלי פי 0.5 ו-10 מיקרו-מולרי.

השתמש במדיום זה בארבעת עד שבעה הימים הראשונים כדי לשפר את ההתקשרות. לאחר מכן, שאפו את המדיום המושקע מכל הבארות והוסיפו מיליליטר אחד לבאר של RDM שחומם מראש ללא גורמי גדילה. במידת הצורך, נתחו וגרדו את כל התאים שאינם RPE באמצעות קצה פיפטה P10 תחת מיקרוסקופ ניתוח.

לאחר הדיסקציה, שאפו RDM וכל פסולת התא ושטפו אותם פעמיים עם מיליליטר אחד של DPBS מחומם מראש לבאר. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר TDE לבאר של צלחת של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי להסיר בעדינות תאים מהצלחת.

יש למשוך בעדינות את תרחיף אנזים התא על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים ליצירת תרחיף אחיד. לאחר מכן, יש לדלל את תרחיף אנזימי התא ביחס של 1 עד 10 ב-RSM שחומם מראש ללא מעכב ROCK. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-173 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, שאפו את המדיום מכדור התא והשעו מחדש את התאים ב-RSM עם מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי. לאחר מכן, מסננים את התאים באמצעות מסננת תאי רשת ניילון עם נקבוביות של 40 מיקרומטר. ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וחשבו את ריכוז התאים בתמיסה המתוחה.

לאחר מכן, זרעו את התאים על גורם הגדילה צמצמו את הלוחות המצופים ב-ECM ב-10 פעמים 10 לחמישה תאים לסנטימטר רבוע בארבעה מיליליטר של RSM עם מעכב ROCK מיקרו-מולרי של 10. החלף את ה-RSM ב-10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים 48 שעות לאחר זריעת התאים והמשך להחליף את המדיה כל שלושה עד ארבעה ימים. הפסק להוסיף מעכב ROCK ל-RSM לאחר ארבעה עד שבעה ימים.

אפשרו לתאים להתבגר במשך 28 עד 35 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 והמשיכו להחליף את ה-RSM כל שלושה עד ארבעה ימים. מוצגים כאן תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים מיד לפני המעבר להתמיינות. תאי הגזע קטנים ודחוסים בצפיפות בתוך המושבות, שנראה כי אינם מכילים תאים מובחנים כגון פיברובלסטים בין או מעברים אטומים בתוך המושבות.

הנה תאי ה-RPE הלא בשלים ביום השני. התאים בשלב זה עדיין צריכים להיות תת-מפגשים ולהרחיב את ההקרנות לתוך החללים הריקים שבין התאים. תאים אלה נמצאים לפני הבחירה להסרת העשרה ביום ה-14.

תאים שאינם RPE מופיעים כתיקאים או כסרטים אטומים. הטלאי העגול מכיל תאים בעלי מורפולוגיה פיברובלסטית ואילו הכתמים האטומים נחשבים לרשתית עצבית. תמונות אלה מציגות RPE במעבר אפס, 1 ו-3 ביום ה-30.

בכל מעבר, התאים צריכים להיות מתכנסים ונראה שיש להם את סימני ההיכר של מורפולוגיה אפיתל פיגמנטית ברשתית, כולל גבולות בהירים וצורה מצולעת. לאחר השליטה, ניתן להשלים את טכניקות המעבר וההעשרה תוך שעה עד שעתיים בהתאם לקנה המידה של תרבית התאים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות כגון כימות גנים או חלבונים ומבחנים פונקציונליים על מנת לענות על שאלות לגבי יכולתו של RPE להפריש גורמי גדילה או מקטעים חיצוניים של פגוציטוז.

מאמרים שפורסמו על ידי דייב בוכהולץ ב-2013 ולינדזי ליץ' ב-2015 מפרטים את הפיתוח והאופטימיזציה של שיטה זו. סיפקנו הדגמה מפורטת ויסודית של כל שלב בהליך כדי להפוך אותו לזמין לחוקרים בתחום. התנסות מהנה.