הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

המטרה הכללית של שיטה זו היא להכווין ביעילות את ההבדלתו של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי אפיתל של הרשתית בשכבה הומוגנית. שיטה זו מסייעת במתן מענה לשאלות בתחומי המחקר של הרשתית והעין, כגון כיצד מתפתחת הרשתית וכיצד ניתן לבסס מודל של מחלה המבוסס על תאי גזע. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ויעילה יותר משיטות התבססות ספונטניות.

שיטה זו משתמשת בשילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע לכדי RPE לא בשלים תוך 14 ימים ו-RPE פונקציונליים בשלים לאחר שלושה חודשים. את חלקי ההליך תדגים Cassidy Arnold, סגנית המנהל של המעבדה לביולוגיה והנדסת תאי גזע ב-UC Santa Barbara. כדי להתחיל בהליך זה, גודלו מושבות של תאי גזע בתנאים ללא תאי מאכילה וללא סרום עד להגעה לכ-80% confluence לפני המעבר.

לאחר מכן, כסו פלטה בעלת 12 בארי (12-well plate) עם הידרוג'ל המבוסס על מטריצה חוץ-תאית בהתאם להמלצות היצרן, והמתינו שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה שלם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חלקו לאליקוט את הנפח הנדרש של מדיום לדיפרנציאציה רטינלית (retinal differentiation media) ו-PBS ללא סידן או מגנזיום עבור יום אפס, וחממו אותם במקלח למספר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו את גורמי הגדילה ל-RDM המחומם והביאו את ה-EDTA לטמפרטורת החדר.

במידת הצורך, הסירו את כל המושבות המובחנות באמצעות טיפ פחית P10 על סמך מורפולוגיה, מהתאי הגזע שיעברו מעבר לצורך גדילה (passaged) להבחנה. תאים פיברובלסטיים בין המושבות, כמו גם תאים עכורים בתוך המושבות, מעידים על התאים המובחנים שיש להסיר. הסרה ידנית של תאים היא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול, שכן התחלה עם אוכלוסיית תאי גזע שאינה מובחנת לחלוטין תאפשר העשרה יעילה יותר.

בשלב הבא, העבירו תאי גזע מבאר אחת של פלטה בעלת שש בארות לארבע בארות של פלטה בעלת 12 בארות, על ידי שאיבת המצע מהתאים ושטיפת הבארות פעם אחת עם 2 milliliters של PBS שחומם מראש. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS ושטפו כל בארה שלוש פעמים עם 1 milliliter של EDTA לכל בארה. לאחר מכן, הטו את הפלטה בעדינות שאבו את ה-EDTA.

אין לנער את הפלטה בשום דרך כדי למנוע תלישה מוקדמת של התאים. לאחר השטיפה השלישית, יש להוסיף שנית מיליליטר אחד של EDTA ולהדגיר את הפלטה בטמפרטורת החדר בתוך המנדף למשך שלוש עד חמש דקות. אין להפריע לפלטה במהלך ההדגרה זו.

לאחר מכן, שאבו את ה-EDTA והוסיפו מיליליטר אחד של RDM לכל באר שתושב, בתוספת 0.5 מיליליטר של מצע נוסף. לדוגמה, שטפו באר אחת של פלטה בעלת שישה בארות עם 4.5 מיליליטר של RDM כדי לזרוע בארבעה בארות של פלטה בעלת 12 בארות. לאחר מכן, השתמשו בגרדת תאים (cell scraper) כדי להפריד בעדינות את התאים.

בצעו טריטורציה (Trituration) לתאים ב-RDM על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) חמישה פעמים בתוך הבאר, והשלימו שלב זה במהירות כדי למנוע הידבקות חוזרת לפלטה. העבירו למבחנה קונית. פרקו גושי תאים גדולים, אך אל תבצעו טריטורציה עד להגעה לתליה של תאים בודדים.

פזרו את התאים באופן שווה בתוך הפפיטה והשלימו שלב זה במהירות כדי למנוע היצמדות חוזרת לפיתח. במידת הצורך, השתמשו במיקרוסקופ אור כדי לבחון את גודל גושי התאים. לאחר מכן, זרעו את התאים בלוחות בעלי 12 בארות מצופים ב-ECM.

הט את הפלטה קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה בכל הבארות, והנח אותה באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 עד להחלפת המצע הבאה. בהליך זה, צפה פלטה של שש בארות ב-ECM עם רמה מופחתת של גורמי גדילה בהתאם להמלצות היצרן. השאר את הפלטה להתייצב במשך שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בטמפרטורה של four degrees Celsius.

לאחר מכן, חלקו למשבצות (aliquot) את כמות ה-DPBS הדרושה ואת מיליליטר אחד של RDM לכל באר העשרה, וחממו אותם ל-37 °C באמבט מים. הביאו את האנזים דמוי ה-trypsin לטמפרטורת החדר וחממו את הכמות הדרושה של מצע תמיכה ל-RPE ל-37 °C. לאחר מכן, הוסיפו רכיב אנטימיקרובי ומעכב ROCK ל-RSM כדי להגיע לריכוז סופי של 0.5x אנטימיקרובי ו-10 µM מעכב ROCK.

השתמשו במצע זה במהלך ארבעת עד שבעת הימים הראשונים כדי לשפר את ההיצמדות. לאחר מכן, שאבו את המצע המשומש מכל הבארים והוסיפו מיליליטר אחד לבאר של RDM שחומם מראש ללא גורמי גדילה. במידת הצורך, בצעו דיסקציה וגרדו את כל התאים שאינם RPE באמצעות טיפ של פיפט P10 תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

לאחר הניתוח, שאבו את ה-RDM ואת כל ששאריות התאים ושטפו אותם פעמיים עם מיליליטר אחד של DPBS שחומם מראש לכל באר. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של TDE לכל באר בלוח בעל 12 בארות והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמשו בגרד תאים (cell scraper) כדי להסיר בעדינות את התאים מהלוח.

שאיפה והזרקה חוזרת בעדינות (טריטורציה) של תרחיף האנזימים התאי שלוש עד ארבע פעמים בעזרת פיפט, כדי ליצור תרחיף אחיד. לאחר מכן, דללו את תרחיף האנזימים התאי ביחס של 1:10 ב-RSM שחומם מראש ללא ROCK inhibitor. סובבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-173g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, שאבו את המצע ממשקע התאים והשעיקו את התאים ב-RSM עם 10 µM ROCK inhibitor. לאחר מכן, סננו את התאים באמצעות מסננת תאים מרשת ניילון עם נקבים של 40 µm. ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וחשבו את ריכוז התאים בתמיסה המסוננת.

לאחר מכן, זרעו את התאים על פלטות מצופות ECM עם רמות מופחתות של גורמי גדילה בריכוז של 10⁵ תאים לסמ"ר בארבעה מיליליטר של RSM עם 10 µM מעכב ROCK. החליפו את ה-RSM עם 10 µM מעכב ROCK כ-48 שעות לאחר זריעת התאים, והמשיכו להחליף את המצע מדי שלושה עד ארבעה ימים. הפסיקו להוסיף מעכב ROCK ל-RSM לאחר ארבעה עד שבעה ימים.

אפשרו לתאים להבשיל למשך 28 עד 35 ימים ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2, והמשיכו להחליף את ה-RSM בכל שלושה עד ארבעה ימים. מוצגים כאן תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מיד לפני מעבר עבור גזירה (differentiation). תאי הגזע קטנים ודחוסים בתוך המושבות, אשר אינן נראות כמכילות תאים מובחנים כגון פיברובלסטים ביניהן או אזורים עמומים בתוך המושבות.

כאן מוצגים תאי RPE לא בשלים ביום השני. תאים בשלב זה צריכים להיות עדיין בסוב-קונפלואנציה (subconfluent) ולהושיט שלוחות אל החללים הריקים שבין התאים. תאים אלו הם לפני שלב המיון להסרת העשרה ביום 14.

תאים שאינם RPE מופיעים ככתמים או כסרטים עמומים. הכתם העגול מכיל תאים בעלי מורפולוגיה פיברובלסטית, בעוד שהכתמים העמומים נחשבים לרשתית עצבית. תמונות אלו מציגות RPE במעבר אפס, אחד ושלוש ביום ה-30.

בכל מעבר, התאים צריכים להיות קונפלואנטים ולהפגין את המאפיינים של מורפולוגיית אפיתל רשתית פיגמנטי (RPE), כולל גבולות בהירים במיקרוסקופ פאזה ומבנה פוליגוני. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את טכניקות המעבר וההעשרה תוך שעה עד שעתיים, בהתאם להיקף תרבית התאים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות כגון כימות גנים או חלבונים ובבדיקות תפקודיות כדי לענות על שאלות בנוגע ליכולתו של ה-RPE להפריש גורמי גדילה או לבצע פגוציטוזה של מקטעים חיצוניים.

מאמרים שפורסמו על ידי Dave Buchholz בשנת 2013 ועל ידי Lindsay Leach בשנת 2015 מפרטים את הפיתוח והאופטימיזציה של שיטה זו. סיפקנו הדגמה מפורטת ומקיפה של כל שלב בפרוצדורה כדי להפוך אותה לנגישה עבור חוקרים בתחום. בהצלחה בניסויים.