Name: Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור גין עריכה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: למדו פרוטוקול מיקרו-הזרקה של CRISPR/Cas9 לעוברי שפמנון Ictalurus punctatus לעריכת גנים. השיטה אומתה בנוקאאוט של הגנים TICAM1 ו-RBL הקשורים במערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג'ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג'ין עם דגים 30 , 42. בפרוטוקול הנוכחי הוכיח כדי להיות מוצלחת וגורם indels של שפמנון ערוץ 1 טיקם ו RBL גנים. הליכים אלה אמין ויעיל להניח את הבסיס ליצירת הגן העתידי הסתרה בתוך הערוץ שפמנון. ...

Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג'ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.
השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילויות פנאי דיג בארצות הברית. יש צורך להגדיל ללמוד גנומיקה תפקודית ב ערוץ שפמנון ומגביר את רצף הגנום המלא של ערוץ שפמנון השירות של התפתחויות אחרונות הגנום-6,כלים-עריכה-7. להבנת תפקוד הגן לא רק להעשיר את המחקר מתנהל על שפמנון, אך גם להוביל תוכניות שיפור גנטי יעיל יותר כדי לשפר את תעשיית שפמנון. ברגע גנים קריטי עבור תכונה נתונה עניין מזוהים, הם יכולים לשמש לשיפור גנטית שפמנון ייצור באמצעות הגנום עריכה כדי להפיק תועלת אללים, הבחירה עבור אלה אללים, דיכוי של אללים מזיקה, העברת אללים מועיל דרך transgenesis, או שילוב של אפשרויות אלה. שילוב של הגנים הטובים ביותר עבור תכונות מועילות מסחרית שונים מ מינים שונים של דגים אחד לשפר במידה רבה פריון ורווחיות של דגים הפקה פעילות8.
נוקאאוט גנטי היא שיטה ישירה ללמוד ג'ין פונקציות בתוך vivo. מוטציות סמני דנ א תעבור בירושה לדורות אשר יקל את חקר ההשפעות שלהם בדורות שונים. כלי עריכה הגנום שונים יש כבר מפותחת כולל אבץ אצבע nucleases (ZFNs), תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs), מקובצים באופן קבוע interspaced קצר palindromic חזרה/CRISPR-הקשורים חלבון 9 (CRISPR/Cas9 ) מערכת9,10,11,12.
מערכת CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה, יעיל ששימש לעריכת רצפי דנ א גנומי כולל נוקאאוט גנטי בדגים עד מונחה RNA ספציפי לאתר ה-DNA המחשוף5,13. המערכת מורכבת RNA מדריך (gRNA), אשר קובע את רצף יישוב הגנום, אנזים endonuclease דנ א, Cas9. ניתן לעצב את מערכת CRISPR/Cas9 היעד כל רצף הגנום עם מספר יתרונות על ZFNs ועל TALENs: נמוך (1) עלות (2) קל הנדסה קשירה (3) יותר ספציפי של מדריך RNA רצף המטרה, צמצמה את המטרה מוטציות (4) ניתן לפלח רצפים מרובים עם gRNA שונים באותו זמן (5) מוטגנזה מכוונת גבוה קצב גנים יכול לא להיות מוטציה על ידי TALENs, (6) קצב השידור germline משופרת של מוטציות עבור עד 6-fold בהשוואה ZFNs, TALENs14, 15,16,17,18.
שיטת אלטרנטיבית הראשי עבור microinjection היא אלקטרופורציה, שבו מוחלות דחפים חשמליים העוברים או לתאים להגברת חדירות הממברנה ואת ספיגת של מולקולות ביולוגיות19,20. מספר דגים הטרנסגניים נוצרו באמצעות אלקטרופורציה כגון ערוץ שפמנון, שישן (Sparus sarba), סלמון צ'ינוק (Oncorhynchus tshawytscha), דג זברה (רזבורה rerio), medaka (Oryzias latipes), נפוץ קרפיון (קרפיון carpio)21,22,23,24,25,26.
אלקטרופורציה שימש כדי לספק חלבון ה-DNA, RNA ו- Cas9 פלסמיד עבור נוקאאוט גנטי. בתרבית של תאים, Cas9/gRNA פלסמיד ה-DNA, Cas9 mRNA/gRNA, Cas9 חלבון/gRNA מתחמי נשלחו באמצעות אלקטרופורציה, תעריפי מוטגנזה מכוונת הגבוהה ביותר באמצעות קומפלקסים של חלבונים/gRNA Cas9 עבור אלקטרופורציה רוב התנאים נבדקו27. Ascidian מיתרניים (Ciona intestinalis), היו TALENs המבטאת מבנים electroporated לתוך הביצים לזירוז נוקאאוט של גנים מרובים28. ZFNs לבטא פלסמיד בונה היו electroporated לדפוק את הורמון מחלמן שפמנון ערוץ29. עם זאת, ברגע הציג לתוך התא, בונה פלסמיד יהיה עליך להיות עיבד את ה-RNA, תרגם חלבונים פונקציונליים לפני בהם ניתן לסמן את רצף ה-DNA הרצוי, אשר סביר להניח יעכב את הזמן של מוטגנזה מכוונת לעומת microinjection של RNA / חלבון. כאשר העובר מתפתח, מוטגנזה מכוונת מושהית מגביר את פסיפס של מייסדי מוזרק. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים סביר להשגת רמת ביטוי אפשרי עם microinjection, מוריד את היעילות מוטגנזה מכוונת.
כאמצעי ידביקו כלי עריכה הגנום בתאים, microinjection יש כמה יתרונות על פני אלקטרופורציה. הגנום עריכה מולקולות שיוכל אמינה להיכנס לתוך התאים או עוברי דרך microinjection30. חומר ההזרקה פחות נחוץ. . זה קל לקבוע את הכמויות של חומר מוזרק... מוטציה גבוהה המחירים עם פסיפס נמוך ב הדג מייסד יכולה להיות מושגת אשר תשפר germline שידור של מוטציות F1. דגים מייסד פחות צריך להיות מנותח כדי לייצר את הדור הראשון, עקב קצב מוטציה גבוהה יותר. אלקטרופורציה, עוד דגים מייסד צריך להיות מנותח אשר יגדיל עלויות. עם זאת, ההישרדות של ערוץ שפמנון microinjected עוברי הוא נמוך יותר electroporated אלה, אבל זה ניתן להתגבר על ידי הזרקת העוברים עוד31,32. ערוץ שפמנון, ההישרדות של microinjected-חלמון עוברי נע בין 16 ל- 55%, בהתאם הגנים מהווים מטרה, את המינון של חלבון gRNA/Cas932.
Microinjection קבוע של שפמנון העוברים הוא תובעני מבחינה טכנית, זמן רב, עם זאת, פרוטוקול microinjection חלבון CRISPR/Cas9 מהיר ויעיל מוצג עבור ערוץ שפמנון עוברי. פרוטוקול זה דורש פחות זמן ומומחיות מאז הפתרון חלבון CRISPR/Cas9 מוזרק לתוך החלמון של עוברי לתא אחד. יכול להיות מוזרק מאות הביצים ב h 1 (כ הזמן הדרוש עבור ליגה תא להתרחש). כדי לאמת את הפרוטוקול, שני גנים למחלות הקשורות הרגישות קיבלת מכה שפמנון ערוץ, את האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, הגן לקטין (RBL) מחייב rhamnose. 1 טיקם מעורב מסלול איתות שיזם קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3. ערוץ שפמנון, טיקם 1 היה דרמטי upregulated בעקבות האתגר חיידקי עם Edwardsiella ictaluri, עוד הייתה downregulated ב כחול שפמנון, עמיד ictaluri ה33מינים. RBL ממלא תפקיד חשוב ב זיהום מוקדם עם Flavobacterium columnare, סוכן סיבתי של מחלת columnaris, שבו חריפה, קולטנים upregulation חזקים נרשמה זן שפמנון ערוץ columnaris, רגישים בהשוואה זן עמיד columnaris34.

<table><tbody><tr><td>שתל Reproboost</td><td>מרכז ביוטכנולוגיה</td><td></td> ימית <td>הורמון משחרר הורמון אנלוגי (LHRHa) לאינדוקציה של ביוץ בנקבות שפמנון תעלה</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>להרגעה של דגי דגים במהלך הזרקת הורמונים והפשטת ביציות.</td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0.5%,</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td> מסונן <td>סטרילי Olympus</td><td>213709</td><td>להדמיית הביציות במהלך מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>דגם MPPI-3</td><td>לאספקת חומר ההזרקה לעוברים</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>דגם MM33&nbsp;</td><td>לאחיזה ובקרה על תנועת מחט ההזרקה.&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>להעמסת תמיסת הזרקה למחטי מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>חולץ מחט אנכי</td><td>דיוויד קופף מכשירים</td><td>דגם 720</td><td>למשיכת מחטי מיקרו הזרקה</td></tr><tr><td>חלבון Cas9</td><td>PNA Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>חלבון Cas9 רקומביננטי מסטרפטוקוקוס פירוגנס.</td></tr><tr><td>הרחב את מערכת High FidelityPLUS PCR</td><td>&nbsp; Roche Diagnostics, ארה"ב</td><td></td><td>ל-PCR והגברה של תבניות DNA לשימוש בהכנת gRNA</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>פישר סיינטיפיקט</td><td></td><td>קוטר חיצוני 1 מ"מ (OD), לייצור מחטי מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>להחזקת העוברים במהלך המיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>קיצור ירקות לציפוי מחבתות הטלה וצלחות פטרי.&nbsp;</td></tr><tr><td>הפתרון של הולטפרטר</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>59 מ"מ NaCl, 0.67 מ"מ KCl, 2.4 מ"מ NaHCO3, 0.76 מ"מ CaCl2, 1.67 מ"מ MgSO4 כדי לדגור על העוברים המוזרקים עד לבקיעה.</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט USP (מונוהידרט)</td><td>אנטיביוטיקה של Letco Medical</td><td>690904</td><td>הוסיפה לתמיסה של הולטפרטר ל-10 חלקים למיליון למניעת זיהומים חיידקיים.</td></tr></tbody></table>

microinjection crispr/cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג'ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג'ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected.
טיקם 1 רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרים PCR במאגר, משובטים חשף מוטציות ויאסין המושרה בטיקם 1 ג'ין. שיעור מוטציה היה 79% ב- 24 אנשים שנותחו. דוגמאות של מוטציות מומחשים איור 4...

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

מיקרו-הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 לשפמנון תעלה, עוברי Ictalurus punctatus לעריכת גנים. פיתוח פרוטוקול אמין ויעיל לעריכת גנים ממוקדת בשפמנון ערוץ, הוא חיוני לחקר גנומיקה פונקציונלית. במיוחד לאחר שהמשאבים הגנומיים הועשרו על ידי ריצוף הגנום של שפמנון הערוץ.כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום CRISPR/Cas9 בשפמנון ערוץ. פרוטוקול זה פותח ותוקף על ידי התמקדות בגנים הקשורים למערכת החיסון של שפמנון שני ערוצים. תחום הקולטן Toll/interleukin-1 המכיל מולקולת מתאם, או גן TICAM1, והלקטין קושר רמנוז או גן RBL.כל ההליכים בוצעו ביחידת המחקר לגנטיקה של דגים במרכז המחקר לדיג קונכיות EW באוניברסיטת אובורן באלבמה. בחירת מלאי דגים והשרצה. בחר מלאי שפמנון תעלה בריא מזן או קו גנטי שתרצה לערוך.זכרים ונקבות שפמנון תעלה צריכים להפגין מאפייני מין משניים טובים. בחר זכרים בעלי ראש שרירי רחב ורחב יותר משאר גופם עם פפילה איברי מין מפותחת. צבע כהה ופצעים מצולקים מלחימה טריטוריאלית הם גם סימנים למוכנות מינית.בחר נקבות בעלות ראשים צרים יותר משאר גופן ובעלות בטן רכה, מוחשית ומעוגלת היטב. לדיוק וכדי להימנע מלחץ על הדגים במהלך הטיפול הראשוני, הפסיקו להאכיל את הנקבות יומיים-שלושה לפני שתבחנו את מוכנותן להשרצה. הטיפול בדגים צריך להיעשות במהירות אך בזהירות כדי להפחית את מתח הטיפול.כל ההליכים הדורשים טיפול בנקבות צריכים להיעשות בזמן שהדגים מוחזקים בשקיות השרצה. רגע לפני הזרקת ההורמונים, קבל את משקל הגוף של הנקבות. לאחר מכן ניתן לתלות שקיות הטלה עם נקבות בפנים במיכל זרימה עם זרימת מים רציפה ואוורור נאות.טען אספטית את השתל בעל מחט בגודל 14 עם 85 מיקרוגרם לק"ג של הורמון משחרר הורמון אנלוגי. להרהה. יש לשטוף את מקום ההזרקה ואת שרירי הגב בתמיסת מלח סטרילית 0.9% לפני ההזרקה. הכנס את השתל בזווית של 45 מעלות ושחרר את השתל.משוך את המחט ונגב את מקום ההזרקה עם כותנה שהושרה בעבר באתנול 70%. הנח את שקית ההטלה במיכל האחיזה כך שהדג יהיה שקוע לחלוטין במים 15 עד 20 סנטימטרים מתחת לפני המים. אוורור נאות כולל חמישה חלקים או יותר למיליון של חמצן מומס, איכות מים טובה חשובים לביוץ של ביציות באיכות גבוהה.חזו את זמן הביוץ על סמך טמפרטורת המים באמצעות יחס מעלות שעה. בדרך כלל הבדיקה הראשונה לביציות נעשית כ-36 שעות לאחר הזרקת ההורמונים ולאחר מכן במרווחים של ארבע שעות. כדי לבדוק ביוץ, הרם בעדינות את שקית ההטלה מעל פני המים בזמן שאתה מחפש את הביצים המחוברות לחלק הפנימי של השקית.כשאתה רואה ביצים לפחות 10 בערך הנקבה הזו מבייצת ומוכנה להפשטת ידיים. הכנת זרע. ניתן להכין זרע מספר שעות לפני מועד הביוץ הצפוי.הדגים הזכרים מורדמים והאשכים נאספים במחבת שקילה קטנה. קבע את משקל האשכים. הסר כל טישו ושטוף את האשכים במי מלח של 0.9% כדי להסיר דם במידת הצורך.אשכים מפותחים הם לבנים עם בליטות רבות של villiform. מועכים את האשכים ומסננים את הזרע באמצעות רשת של 100 מיקרון. השתמש בתמיסת מלח של 0.9% כדי לשטוף את הזרע מהרשת לתוך צינור של 50 מיליליטר.ניתן להוסיף תמיסת מלח עד 10 מיליליטר לגרם אשכים. קבע את ריכוז הזרע. בדוק את התנועתיות והכדאיות.עם זאת, עבור הליכים אלה אין צורך בכך אם האשכים מפותחים היטב. לאחר מכן ניתן לאחסן זרע בארבע מעלות צלזיוס ויש להשתמש בו תוך 24 שעות לאחר ההכנה. איסוף ביציות והפריה.מרחו שכבה דקה מאוד של קיצור ירקות על תבנית הטלה יבשה ונקייה בקוטר 20 סנטימטרים. הכניסו את הנקבה לתמיסת הרדמה המכילה 100 חלקים למיליון של טריקאין מתאן סולפונאט עם סודיום ביקרבונט עד שהדג מורדם לחלוטין. הוציאו בזהירות את הדג משקית ההטלה וטבלו אותו במי מלח של 0.9% כדי לשטוף את חומר ההרדמה.יבש את הדג לחלוטין באמצעות מגבת נקייה והימנע מהסרת שכבת הריר על פני גוף הדג. מרחו קיצור ירקות על האזור סביב האוורור כולל סנפירי האגן כדי להציג הצמדה של הביצים במהלך הפשטת הידיים. הפשיטו את הביצים ביד לתוך תבנית ההטלה המשומנת על ידי הפעלת לחץ עדין על השחלות.ביצים טובות צריכות לזרום בחופשיות, להיות בצבע צהוב זהוב ובעלות גושים או קרישי דם מינימליים או ללא קרישי דם. הימנע ממגע בין הביצים למים לפני ההפריה מכיוון שמים יכולים לעורר את סגירת המיקרופיל. כדי להפרות את הביצים להזרקת מיקרו, העבירו ל-200-300 ביצים לתבנית ההטלה המשומנת.מוסיפים מיליליטר עד שניים מתמיסת הזרע לביציות ומערבבים בעדינות. הוסף מים מתוקים לביצים כדי להפעיל את הזרע והביציות. יש להוסיף מספיק מים כדי לכסות מעט את הביצים.מערבבים בעדינות את הביצים למשך 30 שניות. ההפריה צריכה להתרחש תוך דקה עד שתיים. חשוב להפרות את הביצים בשכבה אחת.ביצי שפמנון נדבקות זו לזו ומקשות על הזרקת מיקרו שכבות מרובות של עוברים. הוסיפו עוד מים מתוקים לביצים המופרות והניחו לביצים להתקשות במשך 10 עד 15 דקות. את הביצים הלא מופרות הנותרות ניתן לכסות במגבת רטובה כדי למנוע ייבוש וניתן להפרות אותן במשך מספר שעות.הפריה יכולה להיעשות בצורה מדורגת. ניתן להפרות אצווה אחת של שתיים עד 300 ביציות כל 30 עד 60 דקות כדי להבטיח אספקה רציפה של עוברים בשלב התא האחד להזרקת המיקרו ולשלוט בעוברים שלא הוזרקו. משיכת מחט וטעינה.משוך נימי זכוכית בורוסיליקט OD מילימטר אחד לשתי מחטים. אחסן את המחטים בקופסת נייר עם פיסת ספוג בה בוצעו מספר חתכים. כדי להימנע משבירת המחט, קוטר הספוג צריך להיות קטן מאורך גזע המחט.לאחר מכן ניתן לפתוח את קצה המחט על ידי שבירת חתיכה קטנה של המחט באזור המשובח ביותר באמצעות חפץ חד. לחלופין, ניתן לפתוח את המחט על ידי צביטה של האזור הדק ביותר של הקצה עם זוג מלקחיים מתחת למיקרוסקופ. הכן את תמיסת ההזרקה על ידי ערבוב RNA מדריך עם חלבון Cas9.ניתן להוסיף אדום פנול כדי לצבוע את תערובת החלבון המנחה RNA Cas9, כאשר אדום פנול מהווה עד שליש מהנפח הכולל. לאחר מכן מדגרים את התערובת במשך 10 דקות על קרח לפני השימוש. בעזרת מעמיס מיקרו, טען 5-10 מיקרוליטר מתערובת RNA Cas9 המנחה למחט ההזרקה.על ידי החדרת מעמיס המיקרו לגזע המחט והוצאת התערובת באיטיות תוך נסיגת קצה מעמיס המיקרו. הימנע מלכידת בועות אוויר בפנים. חבר את המחט למחזיק המיקרו פיפטה והקפד על חיבור הדוק.ואז חבר את המחזיק למניפולטור המיקרו. הקפידו על תנועה חופשית ויציבה. הפעל לחץ להזרקת מיקרו על ידי פתיחת גליל החנקן והתאמת ווסת הלחץ.נפח ההזרקה יכול להיות מושפע מהלחץ, קוטר פתח המחט ומשך ההזרקה. כדי לקבוע את הנפח שברצונך להזריק, הזריק לתוך טיפת שמן מינרלי המונחת על המוציטומטר. במידת הצורך ניתן לכוונן את הלחץ וקוטר המחט כדי להגדיל או להקטין את נפח ההזרקה.הזרקו מספר פעמים לשמן המינרלי כדי להבטיח נפח עקבי. הזרקת מיקרו של עוברי שפמנון. מרחו שכבה דקה מאוד של קיצור ירקות על צלחת פטרי נקייה של 100 מילימטר.מעבירים 50 עד 100 ביצים מתבנית הדישון לצלחת הפטרי ומכסים אותן בתמיסה של הולטפרטר. הביצים צריכות להיות מיושרות זו מול זו בשכבה אחת. יישור זה אמור להחזיק את הביציות במקומן במהלך תהליך הזרקת המיקרו.מניחים את צלחת הפטרי עם הביצים על במת המיקרוסקופ ומחזיקים אותה ביד אחת. מנמיכים את המחט ביד השנייה עד שהיא חודרת את הכוריון והחלמון בתנועה חלקה אחת. קצה המחט צריך להיות קרוב ככל האפשר לבלסטודיסק לפני מסירת חומר ההזרקה.לחץ על הדוושה והעביר את חומר ההזרקה לחלמון. אם הבלסטדיסק אינו נראה בבירור, ניתן לפזר את חומר ההזרקה למקומות שונים לאורך החלמון. לשם כך, המחט מוחדרת לקצה הרחוק של החלמון.לאחר מכן לחץ על הדוושה ומשוך את המחט בו זמנית. זה מפזר את חומר ההזרקה במקומות שונים לאורך החלמון. ניתן להזריק לחלמון 50 ננוליטר המכילים 2.5 ננוגרם RNA מנחה ו-7.5 ננוגרם חלבון Cas9 ללא בעיות.משוך את המחט בצורה חלקה כדי לא לפגוע בביצה. לאחר מכן הזיזו את צלחת הפטרי כדי להזריק ביצה נוספת באותו הליך. הימנע מתנועה של צלחת הפטרי במהלך תהליך ההזרקה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בביצה או לשבור את המחט.הסר את הביציות שנקרעו או ניזוקו עקב הזרקת מיקרו. ניתן להתחיל בהזרקה 15 עד 20 דקות לאחר ההפריה, ולהמשיך כל עוד העוברים עדיין בשלב התא האחד. עוברים מוזרקים מוחזרים לתמיסה של הולטפרטר עם 10 PPM של דוקסיציקלין ואוורור רציף במשך שישה עד שבעה ימים עד לבקיעה.התמיסה מוחלפת מדי יום ועוברים מתים מוסרים. תוצאות. איור זה מציג את המוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 בגן TICAM1 של שפמנון התעלה. הרצף הכחול מייצג את המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר או PAM, בעוד שהרצף הירוק מייצג את המטרה עבור ה-RNA המודרך.שבירת גדיל כפול המושרה על ידי חלבון Cas9 הייתה צפויה להתרחש באתר של שני המשולשים האדומים. מוטציות מחיקה מיוצגות על ידי קו מקף, שבו כל מקף מתאים לנוקלאוטיד שנמחק. רצפים אדומים הם הוספות ואילו סגול מייצג מוטציית החלפה.שברים של 78 מייצגים את מספר האללים המוטנטיים ב-78 תגובות ריצוף. לדוגמה, 3/78 פירושו שאלל זוהה בשלוש תגובות ריצוף מתוך 78 תגובות בסך הכל. שיעור המוטציות היה 79.2% ב-24 אנשים שנותחו.מוטציות הביאו להסרה של כמה יותר מדי חומצות אמינו מהחלבון, שינוי מסגרת הקריאה במורד הזרם וסיום מוקדם של התרגום. ברוב המוטציות, יותר מ-80% מרצף החלבון החזוי של TICAM1 נחתך עקב קודון עצירה מוקדם. איור זה מציג מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 בגן RBL של שפמנון התעלה.רצפים אקסוניים הם אותיות גדולות ואילו רצפים אינטרוניים הם אותיות קטנות. רצפים כחולים מייצגים את המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר ואילו הרצף הירוק מייצג את היעד ל-RNA מודרך. שבירת גדיל כפול המושרה על ידי חלבון Cas9 הייתה צפויה להתרחש באתר של שני המשולשים האדומים.מוטציות מחיקה מיוצגות על ידי קו מקף שבו כל מקף מתאים לנוקלאוטיד שנמחק. רצפים אדומים הם הוספות. שברים של 40 מייצגים את מספר האללים המוטנטיים ב-40 תגובות ריצוף.לדוגמה, 2/40 פירושו שאלל זוהה בשתי תגובות ריצוף מתוך סך של 40 תגובות. שיעור המוטציות היה 87.5% ב-40 אנשים שנותחו. המחיקות נעות בין חמישה זוגות בסיסים ל-183 זוגות בסיסים, בעוד שעד 20 זוגות בסיסים הוכנסו ל-20 זוגות בסיסים.יותר מ-70% מהאינדלים גרמו לחלבון קטום שהיה 10% או פחות מאורך החלבון מסוג הבר. בסרטון זה, הדגמנו כיצד להזריק מיקרו חלבון CRISPR/Cas9 לעוברי שפמנון תעלת תא אחת. ההליכים המתוארים הם פשוטים, מהירים ויעילים.והשיג בהצלחה נוקאאוט גנטי בשני גנים של שפמנון ערוצים. TICAM1 ו-RBL. בהתאם למה שמוזרק, ניתן לשנות את הפרוטוקול כך שיכלול חומרים פעילים ביולוגיים אחרים.ניתן גם לשנות אותו כדי להזריק מיקרו מיני שפמנון אחרים או מיני דגים אחרים בעלי מבנה והרכב ביצים דומים.

microinjection-crisprcas9-protein-into-channel-catfish-ictalurus

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

פרוטוקול זה מציג גישה אופטימלית לייצור מודלים של חולדות מהונדסות-גנטית. וירוס הקשור לאדנו (AAV) משמש להעברת תבנית תיקון DNA, ואלקטרופורציה משמשת להעברת ריאגנטים CRISPR-Cas9 כדי להשלים את תהליך עריכת הגנום בעובר בן 2 תאים.

עריכת גנום CRISPR-Cas9 של עוברי חולדות באמצעות Adeno-Associated Virus (AAV) ואלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים

למדו פרוטוקול מיקרו-הזרקה של CRISPR/Cas9 לעוברי שפמנון Ictalurus punctatus לעריכת גנים. השיטה אומתה בנוקאאוט של הגנים TICAM1 ו-RBL הקשורים במערכת החיסון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

גלה סרטונים נוספים