בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים ולהעריך את מודל האוסטאוליזה של הגולגולת בעכברים (Murine Calvarial Osteolysis Model) באמצעות חשיפה לננו-חלקיקים של קובלט-כרום-מוליבדן. אוסטאוליזה המושרית על ידי חלקיקי שחיקה היא גורם מרכזי לשחרור אספטי בכישלון של החלפות מפרקים, אך המכניקה העומדת בבסיס תהליך זה אינה ברורה. בשל זמן המעקב הממושך וההתרחשות הספורדית, קשה לחקור את הפתוגנזה של שחרור אספטי במקרים קליניים.

לפיכך, יש צורך במודל בעלי שחיקה לצורך מחקר נוסף. במעבדה שלנו, מודל של אוסטאוליזה של גולגולת עכבר (murial calvarial osteolysis), המיוצר באמצעות חלקיקי סגסוגת קובלט, מהווה מודל יעיל לחקר הפתוגנזה של שחרור אספטי. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן בננו-קנה מידה מפרוטזה של סגסוגת קובלט, והשעייתם מחדש ב-phosphate buffer saline בריכוז של 15 milligram per millilitre.

השלב הבא הוא לזהות את מיקום החתך בקו העובר בין שתי נקודות האמצע שבין שתי העיניים לשני האוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, יש להסיר את הפריאוסטיום הגולגולתי מהכיסה (calvarium) באמצעות דיסקציה בשיטת shock dissection. לאחר מכן, קח 50 µL של תמיסת סטוק של ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט והטמע אותם בתפר המרכזי של הכיסה.

לאחר שבועיים של תחזוקה, יש להקריב חלק מהעכברים ולאסוף את הגולגולת (calvaria) לצורך הערכת אוסטאוליזה. אוסטאוליזה ניכרת בעכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט, הן בתמונות micro-CT והן בתמונות צביעת H and E. השג סגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן מפרוטזה של סגסוגת קובלט, והשג חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן מסגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן באמצעות זרם ישר בעל שלוש אלקטרודות בוואקום גבוה.

כדי לכמת את הקוטר הממוצע של חלקיקי הקובלט-כרום-מוליבדן, העבירו 1 mg של חלקיקים לתוך 1.5 mL של אתנול אנहाइडרזי והשעו אותם באמצעות שקישול אולטרסוני. טפטפו טיפה אחת, כ-20 µL, מהסספנסיה על שולחן העדשה של מיקרוסקופ האלקטרונים חודר (TEM) ורכשו סדרה של תמונות. השתמשו בתוכנה המסופקת כדי לחשב את הקוטר הממוצע ואת התפלגות גודל החלקיקים בתמונות ה-TEM.

שמאלה מוצגות תמונות TEM מייצגות, ומימין מוצגת התפלגות גודל הננו-חלקיקים של סגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן שחושבה באמצעות התוכנה המסחרית שלנו. הקוטר הממוצע הוא כ-50 nanometers. יש להעביר את החלקיקים באוטוקלאב למשך 15 דקות כדי להסיר אנדוטוקסינים.

לאחר מכן, השהו אותם שוב בתוך phosphate-buffered saline בריכוז של 15 milligram per milliliter כתמיסת מלאי. השלב הבא הוא בניית מודל של osteolysis של הגולגולת (calvarial osteolysis). בחרו והרדימו עכברים בני שישה שבועות: שישה עכברים לכל קבוצה.

הניחו את בעלי החיים במנח הראשוני. הסירו את הפרווה וחטאו את העור על הגולגולת באמצעות 75% ethanol. לצורך החתך, זהו את שתי נקודות האמצע בין העיניים והאוזניים, בהתאמה, ובצעו חתך בעור לאורך הקו המחבר ביניהן.

הסר בזהירות ובשלמות את הפריוסטום (periosteum) הגולגולתי מהגולגולת (calvarium) באמצעות דיסקציית השוק (shock dissection). דיסקציה נקייה של הפריוסטום מגבירה את האינטראקציות בין החלקיקים בגולגולת. התפרים מבוצעים בזהירות בשני קצות החתך באמצעות תפרים פשוטים בשיטה המקוטעת (simple interrupted suture).

בדרך כלל, נדרשות שלוש תפרים לסגירה מלאה של הפצע. בשלב האחרון, העבירו את חוט התפר דרך החתך ללא קשירה, תוך החזקת שני קצות החוט. קחו 15 µL מתמיסת סטוק של ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט והטמיעו אותם בתפר המרכזי של הגולגולת (calvaria).

קשרו את התפר האחרון בתפר פשוט רצוף. השאירו את העכברים למשך שבועיים נוספים. לאחר שבועיים, הקריבו את בעל החיים וגבעו את עצמות הגולגולת (calvaria).

הסר בעדינות את כל הרקמה הרכה מדגימות גולגולת (calvaria) באמצעות פינצטה, וקבע את הרקמה ב-4% פאראפורמאלדהיד בטמפרטורה של 4°C. להערכת אוסטאוליזה במודל שהושרה על ידי ננו-חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן, בצע micro-CT ברזולוציה גבוהה 24 שעות לפני סריקת ה-micro-CT. העבר את דגימות הגולגולת מפאראפורמאלדהיד לתוך phosphate-buffered saline.

ביום סריקת ה-micro-CT, הוציאו את דגימות הלתחם (calvaria) מתמיסת phosphate-buffered saline, וקבעו אותן על מתאם המחובר למכשיר. סרקו את הלתחם במכשיר ה-micro-CT. בצעו שחזור תלת-ממדי באמצעות תוכנות מתאימות.

צביעת H and E היא כלי נוסף להערכת אוסטאוליזה במודל המושרה על ידי ננו-חלקיקים. דקלצף דגימות של calvaria בתוך phosphate-buffered saline, המכיל 15% של ehylenediaminetetraacetic, למשך שלושה שבועות בטמפרטורה של 4°C. הטמע את ה-calvaria המדוקלצפות בפראפין וחתוך אותן לפרוסות בעובי של 2 µm באזור השקיעת החלקיקים.

צבע את החיתוכים בהמטוקסילין ואאוזין. בחן את המורפולוגיה הכללית באמצעות מיקרוסקופ אור ודגום מיקרוגרפים. להלן תמונות micro-CT מייצגות.

בפאנל השמאלי מוצגות תמונות שחזור תלת-ממדי של נתוני micro-CT. בפאנל הימני מוצגות תמונות חתך של עכברים מקבוצת הביקורת, קבוצת הניתוח המדומה (sham) ועכברים שטופלו בננו-חלקיקים. האוסטאוליזה ניכרת באופן ברור בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים.

להלן ניתוח כמותי של תצלומי micro-CT שבוצע באמצעות התוכנה הנלווית למכשירים. המדידות כוללות צפיפות מינרלית של העצם, נפח עצם, או יחס נפח כולל, אחוז נקביות כולל, מספר טרבקלות, עובי טרבקלות, והפרדה או מרווח בין טרבקלות. עכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מראים צפיפות מינרלית של העצם ונפח עצם נמוכים משמעותית, עם אחוז נקביות כולל גבוה יותר בהשוואה לבעלי החיים בקבוצת הביקורת.

להלן תמונות מייצגות של צביעת H and E עבור דגימות קלבאריה (גולגולת) מעכברים מקבוצת הביקורת, מקבוצת ניתוח דמה ומעכברים שטופלו בננו-חלקיקים. אוסטאוליזה ניכרת גם בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים. מודל אוסטאוליזה קלווריאלי עכברי שהוקם באמצעות ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מציג שיעור הצלחה גבוה במידול אוסטאוליזה המושרית על ידי חלקיקי שחיקה.

להלן מספר גורמים מרכזיים. ראשית, ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מגבירים את האינטראקציה בין חלקיקי השחיקה לבין הגולגולת (calvaria). שנית, חשיפה נאותה של הגולגולת ודיסקסיה ברורה של הפריאוסטום (periosteum) הופכות את האינטראקציה בין החלקיקים לבין הגולגולת לאנטנסיבית יותר.

שלישית, מדידות כמותיות של אובדן עצם באמצעות micro-CT מקלות על זיהוי הבדלים באובדן עצם בין טיפולים שונים, ומספקות לנו ראיות מוצקות לאוסטאוליזה בהשוואה להיסטומורפומטריית עצם מסורתית. מודל אוסטאוליזה של גולגולת (calvaria) המושרה על ידי חלקיקי סגסוגת קובלט הוא מודל אידיאלי לחקר האינטראקציה בין חלקיקי שחיקה לתאים שונים בתהליך של שחרור אספטי (aseptic loosening), כגון מקרופאגים, פיברובלסטים, אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים.

אנו מקווים שהמודל שלנו יהיה מועיל למחקרי שחרור אספטי בעתיד.