בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות ולהעריך את מודל האוסטאוליזיס הגולגולתי של העכברים על ידי חשיפה לננו-חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן. אוסטאוליזה הנגרמת על ידי חלקיקי שחיקה היא גורם עיקרי להתרופפות אספטית בכשל בניתוח מפרקים, אך המכניקה הבסיסית של זה אינה ברורה. בשל זמן המעקב הארוך וההתרחשות הספורדית, קשה לחקור את הפרתוגנזה של התרופפות אספטית במקרים קליניים.

לפיכך, מודל של חיות לבוש נחוץ למחקר נוסף. במעבדה שלנו, מודל אוסטאוליזה קלוריאלית נבנה על ידי חלקיק סגסוגת קובלט הוא מודל יעיל לחקר הפרתוגנזה של התרופפות אספטית. זה מושג על ידי יצירת חלקיקי כרום מוליבדן קובלט בקנה מידה ננומטרי מתותבת סגסוגת קובלט והשעייתם מחדש במי מלח פוספט בריכוז של 15 מיליגרם למיליליטר.

השלב הבא הוא לזהות את מיקום החתך בקו בין שתי נקודות האמצע בין שתי עיניים ואוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, הסר את הגולגולת periosteum מהגולגולת על ידי דיסקציה של הלם. לאחר מכן, קחו 50 מיקרוליטר של ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט והטמיעו אותם בתפר האמצעי של הקלבריה.

לאחר שבועיים של תחזוקה, הקריבו כמה עכברים ואספו את הקלווריה להערכת אוסטאוליזה. אוסטאוליזה ניכרת בעכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט, הן בתמונות מיקרו-CT והן בתמונות צביעה H ו-E. השג סגסוגת מוליבדן כרום קובלט מתותבת סגסוגת קובלט, השגת חלקיקי מוליבדן כרום קובלט מסגסוגת מוליבדן כרום קובלט על ידי זרם ישר בעל שלוש אלקטרודות בוואקום גבוה.

על מנת לכמת את הקוטר הממוצע של חלקיקי מוליבדן כרום קובלט, קח מיליגרם אחד של חלקיקים לתוך אתנול נטול מים של 1.5 מיליליטר והשהה אותם על ידי ניעור קולי. מרחו טיפה אחת, כ-20 מיקרוליטר, של התרחיף על טבלת המטרה של מיקרוסקופ אלקטרוני ההולכה ורכשו סדרה של תמונות. השתמש בתוכנה המצורפת כדי לחשב את הקוטר הממוצע והתפלגות גודל החלקיקים בתמונות TEM.

להלן תמונות TEM מייצגות בפאנל השמאלי, הימני מציג את התפלגות גודל הננו-חלקיקים של סגסוגת קובלט כרום, מוליבדן, המחושבת על ידי התוכנה המסחרית שלנו. הקוטר הממוצע הוא בסביבות 50 ננומטר. חיטוי החלקיקים למשך 15 דקות להסרת אנדוטוקסינים.

לאחר מכן, השעו אותם מחדש בתמיסת מלח חוצצת פוספט בריכוז של 15 מיליגרם למיליליטר כתמיסת מלאי. הבא הוא בניית מודל האוסטאוליזה הקלוריאלית. בחר והרדים עכברים בני שישה שבועות: שישה עכברים בקבוצה.

מקם את החיות במיקום הראשון. הסר את הפרווה וחטא את העור על הגולגולת עם 75 אחוז אתנול. עבור חתך, זהה את שתי נקודות האמצע בין שתי העיניים והאוזניים, בהתאמה, וחתך את העור לאורך הקו המחבר ביניהן.

הסר בזהירות ובשלמות את הגולגולת מהקלווריום על ידי דיסקציה של הלם. דיסקציה ברורה של הפריאוסטאום מעצימה את האינטראקציות בין חלקיקים בקלבריה. התפר מבוצע בזהירות בשני קצוות החתך בתפר קטוע פשוט.

בדרך כלל, יש צורך בשלושה תפרים לתפר מלא. בשלב האחרון, העבירו את קו התפר דרך החתך מבלי לקשר, תוך החזקת שני קצוות קו התפר. קח 15 מיקרוליטר ננו-חלקיקי תמיסת סגסוגת קובלט והטמיע אותם בתפר האמצעי של הקלבריה.

קשרו את התפר האחרון בתפר קטוע פשוט. שמרו על העכברים למשך שבועיים נוספים. שבועיים לאחר מכן, הקריבו את החיה וקצרו קלבריה.

נקה בעדינות את כל הרקמות הרכות בדגימות קלווריה בעזרת פינצטה, והצמד את הרקמה בארבעה אחוזים פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס. להערכת אוסטאוליזה במודל המושרה על ידי ננו-חלקיקי קובלט כרום מוליבדן, בצע מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה 24 שעות לפני סריקת מיקרו-CT. העבירו דגימות קלבריה במי מלח עם חוצץ פוספט מפרפורמלדהיד.

ביום סריקת המיקרו-CT, אספו דגימות קלבריה מתמיסת מלח עם פוספט, וקבעו אותן על מחזיק המשויך למכשיר. סרוק קלווריה במכשיר מיקרו-CT. בצע שחזור תלת מימדי עם תוכנות מגוונות.

צביעת H ו-E היא כלי נוסף להערכת אוסטאוליזה במודל המושרה על ידי ננו-חלקיקים. הסרת סידן דגימות קלבריה בתמיסת מלח עם פוספט, המכילה 15 אחוז של ehylenediaminetetraacetic למשך שלושה שבועות בארבע מעלות צלזיוס. הטמיעו את הקלווריה נטולת האבדן בפרפין וחתכו אותם לשני חלקי מיקרומטר באזור שקיעת החלקיקים.

מכתימים את החלקים בהמטוקסילין ואאוזין. התבונן במעבר הכללי דרך מורפיזם ועל ידי מיקרוסקופ אור ורכוש מיקרוגרפים. להלן תמונות מיקרו-CT מייצגות.

תמונות שחזור תלת מימדיות של נתוני מיקרו-CT מוצגות בפאנל השמאלי. תמונות חתך מבקרה, פעולת דמה ועכברים שטופלו בננו-חלקיקים מוצגות בחלונית הימנית. אוסטאוליזה ניכרת בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים.

להלן ניתוח כמותי של צילומי מיקרו-CT על ידי התוכנה המשויכת למכשירים. המדידות כוללות צפיפות מינרלים בעצם, נפח עצם או יחס נפח כולל, אחוז הנקבוביות הכוללת, מספר טרבקולר, עובי טרבקולרי והפרדה או מרווח טרבקולריים. עכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מראים צפיפות מינרלים ונפח עצם נמוכים משמעותית, עם אחוז גבוה יותר של נקבוביות כוללת בהשוואה לחיות ביקורת.

להלן תמונות צביעה מייצגות של H ו-E עבור דגימות קלבריה מבקרה, פעולת דמה ועכברים שטופלו בננו-חלקיקים. אוסטאוליזה ניכרת גם בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים. מודל אוסטאוליזה קלוריאלי של עכברים שנבנה על ידי ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט הם בעלי אחוזי הצלחה גבוהים במידול אוסטאוליזה המושרה על ידי חלקיקי בלאי.

להלן מספר גורמים מרכזיים. ראשית, ננו-חלקיקי סגסוגת הקובלט משפרים את האינטראקציה בין חלקיקי בלאי לקלבריה. שנית, חשיפה נאותה של קלווריה ודיסקציה ברורה של periosteum הופכת את האינטראקציה בין חלקיקים לקלווריה לאינטנסיבית יותר.

שלישית, מדידות כמותיות של אובדן עצם על ידי מיקרו-CT מקלות על הגישה להבדלים באובדן עצם בין טיפולים שונים, ומספקות לנו ראיות מוצקות לאוסטאוליזה בהשוואה להיסטומורפומטריית העצם המסורתית. מודל אוסטאוליזה של קלבריה שנבנה על ידי חלקיק סגסוגת קובלט הוא מודל אידיאלי לחקירת האינטראקציה בין חלקיק בלאי לתאים שונים בהתרופפות אספטית. כגון מיקרופג'ים, פיברובלסטים, אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים.

אנו מקווים שהמודל שלנו יעזור למחקר על התרופפות אספטית בעתיד.