Name: בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: חקור מודל אוסטאוליזיס קלבריאלי בעכברים לחקר התרופפות אספטית בעזרת חשיפה לחלקיקי CoCrMo. שיטה זו מאפשרת הערכת אינטראקציות בין חלקיקי שחיקה לתאים ומסייעת להבנת מנגנוני הפתוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81572111), קליניים מדע טכנולוגיה פרויקט קרן של מחוז ג'יאנגסו (BL2012002), מדעי למחקר פרוייקט של נאנג'ינג (201402007), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20161385), קרן מיוחדת התאגדות רופא סיני (2015COS0810).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת נאנג'ינג.
1. CoCrMo חלקיקים הכנה
<ol><li>לקבל CoCrMo חלקיקים באמצעות זרם ישיר של שלוש-אלקטרודה גבוהה-ואקום מפוברק4. המקום CoCrMo סגסוגת בכלי תחת 10-3 הרשות הפלסטינית ואקום, 0.04 ארגון MPa ו מימן 3:2 (v/v), 650 קטודית A הנוכחי.</li>
	<li>למדוד על הקוטר של חלקיקים CoCrMo.<ol>
<li>להוסיף 1 מ ג של CoCrMo חלקיקים לתוך 1.5 מ"ל אתנול נטול מים.</li>
		<li>Resuspend CoCrMo חלקיקים באתנול נטול מים ע י ניעור אולטראסוניות-28 kHz ו- 600 W עבור 5 דקות.</li>
		<li>החל טיפה אחת (כ- 20 µL) של ההשעיה המתקבלת על השולחן אובייקטיבית של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). לכידת סדרת תמונות TEM ב 200 מתח ההאצה kV והרזולוציה nm 0.24.</li>
		<li>להשתמש בתוכנה המצורפת כדי לחשב את מתכוון קוטר חלקיקים בגודל והפצה ב TEM micrographs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decontaminate endotoxins<ol>
<li>אוטוקלב 50 גרם של חלקיקים למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.</li>
		<li>לאתר endotoxins על ידי Assay כמותית Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0.25% האיחוד האירופי/mL נחשבת לציון אנדוטוקסין היעדרות)5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend החלקיקים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל בתור פתרון מניות6.</li>
</ol>2. בניית דגם Calvarial Osteolysis
<ol><li>עזים ומתנגד C57BL/J6 6 בן שבועיים עכברים (שישה עכברים לכל קבוצה) withpentobarbital (50 מ"ג/ק"ג). השתמש במבחן קמצוץ כדי להעריך את רמת ההרדמה. למנוע ייבוש של העיניים עם תמיסת מלח.</li>
	<li>הצב עכברים במצב שכיבה. הסר את הפרווה על הגולגולת עם מכונת הגילוח, לחטא את העור באמצעות כדורי צמר גפן רפואי המכיל 75% אתנול.</li>
	<li>עבור נקודת לוקליזציה, לזהות שתי נקודות, כולל את האמצע בין שתי העיניים והאוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, לקבוע את הגבול בין השניים מעל נקודות, פצעים וחתכים בעור לאורך הקו לעיל עם מספריים (איור 1 א').</li>
	<li>הסר קרום העצם הגולגולת calvaria עם האזמל (איור 1B)6.</li>
	<li>תפר עור בשני קצותיו בתפר פשוט קטע.</li>
	<li>הפיכת קו תפר דרך האמצע של החתך ללא knotting. החזק את שני הקצוות של קו התפר.</li>
	<li>הטבע µL 50 CoCrMo חלקיקים השעיה (50 mg/mL, ב- PBS) באמצע מכונות (איור 1C)2.</li>
	<li>מקמי תפר האחרון בתוך בתפר פשוט קטע (איור 1D).</li>
	<li>לשמור על עכברים עוד 2 שבועות.</li>
</ol>3. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על-ידי סריקה מיקרו-CT
<ol><li>להקריב העכברים עם פחמן דו-חמצני. לערוף העכברים במישור האופקי. להסיר את רקמת המוח בתוך העור, פרווה בחוץ. לקצור את מכונות לניסויים נוספים.</li>
	<li>לנקות בעדינות את כל הרקמות הרכות על calvaria עם פינצטה. לתקן מכונות שנוקה ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 Immerse את מכונות ב- PBS 24 h לפני סריקת CT-מיקרו.</li>
	<li>לנתח את מכונות עכברים ידי מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה של פתרון איזומטרי של מיקרומטר 18 ו רנטגן הגדרות האנרגיה של 45 kV, 550 mA.</li>
	<li>לבצע שחזור תלת מימדי של מיקרו-CT נתונים עם התוכנה.</li>
	<li>איכותי וניתוח כמותי.<ol>
<li>ראשית, בחר את אזור ריבוע מסביב התפר קו האמצע אזור בעל עניין.</li>
		<li>שנית, למדוד צפיפות המינרלים של העצם (BMD), עצם נפח/סה כ נפח (BV/טלוויזיה), trabecular (Tb.N), עובי trabecular (Tb.Th), ההפרדה/ריווח trabecular (Tb.Sp) ומספר אחוז נקבוביות סה עם התוכנה שסופקה לסי-מיקרו</li>
		<li>שלישית, השווה לשלוש הקבוצות למדידות שונים מאת אנובה בכיוון אחד. עבור הוק לאחר ניתוח השונות, להחיל את שיטת Bonferroni2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על ידי צביעת המטוקסילין
<ol><li>Decalcify calvaria דגימות ב- 15% אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA)-PBS ב 4 º C. לשנות את הפתרון decalcification כל יום במשך 3 שבועות.</li>
	<li>להטביע את הדגימות decalcified פרפין עבור 2 ס"מ על 1 ס"מ x 1 ס מ קוביה, לחתוך אותם למקטעים 2 מיקרומטר באזור של חלקיקים התצהיר.</li>
	<li>כתם הסעיפים עם hematoxylin ותיאר אאוזין כאמור7.</li>
	<li>Micrographs של pathomorphism הכוללת מידיהם של מיקרוסקופ אור.</li>
</ol>

<ol><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+targeting+TNF-alpha+can+suppress+Co-Cr-Mo+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis.</a> J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT1+protects+osteoblasts+against+particle-induced+inflammatory+responses+and+apoptosis+in+aseptic+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening.</a> Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).</li>
<li>Langlois, J., Hamadouche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+of+wear-particle+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">New animal models of wear-particle osteolysis.</a> Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).</li>
<li>Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287666498_Preparation_of_ultrafine_silver_powders_by_DC_arc_plasma">Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method.</a> Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fibroblast+expression+of+RANKL+in+CoCrMo-particle-induced+osteolysis+is+mediated+by+ER+stress+and+XBP1s%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s.</a> Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+CoCrMo+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+osteoblast+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis.</a> Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-induced+osteolysis+mediated+by+endoplasmic+reticulum+stress+in+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening.</a> Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).</li>
<li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+osteoprotegerin+gene+transfer+protects+against+particulate+polyethylene-induced+osteolysis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model.</a> Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+TiAl%286%29V%284%29+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+expression+of+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha.</a> Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+Mediates+TiAl6V4+Particle-Induced+Peri-Implant+Osteolysis+by+Promoting+RANKL+Expression+in+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiAl6V4+particles+promote+osteoclast+formation+via+autophagy-mediated+downregulation+of+interferon-beta+in+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes.</a> Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycorine+suppresses+RANKL-induced+osteoclastogenesis+in+vitro+and+prevents+ovariectomy-induced+osteoporosis+and+titanium+particle-induced+osteolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo.</a> Sci Rep. 5, 12853(2015).</li>
<li>Neuerburg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+receptor+signalling+in+polyethylene+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis.</a> Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).</li>
<li>Catelas, I., Jacobs, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20415362">Biologic activity of wear particles.</a> Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+response+to+nanometre-sized+polymer+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The biological response to nanometre-sized polymer particles.</a> Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנן שתי שיטות עיקריות עבור ללבוש חלקיקים-induced osteolysis בעכברים: המודל אוויר-נרתיק ודגם calvarial osteolysis. במודל כיס אוויר, אוויר-נרתיק subcutaneously שנוצר קודם נוסדה, ואחריו ללבוש חלקיקים מבוא השרשה לתוך רקמת העצם8. הקיר נרתיק מחקה קרום העצם, התרופפות אספטי. עם זאת, עצם ההשתלה הוא nonvascular עם אין פעילות ביולוגית, מה שהופך את זה קשה להעריך ישירה אינטראקציות בין חלקיקים לרקמת העצם. המודל calvarial osteolysis יש כמה יתרונות על פני לכנף אוויר-כיס. ראשית, ללבישה חלקיקים ישירות נחשפים calva...

התרופפות aseptic הוא הגורם הנפוץ ביותר של שכיחיםהחלפת היפ הכולל (THA) וכישלון שכיחיםהחלפת (TKA) ברך הכולל, אשר דורש ניתוח תיקון1. עם זאת, המנגנון הבסיסי נותר לא ברור2. מעקב ארוך נדרש לזהות חלקיקים-induced osteolysis, אשר מופע נדיר; לכן, זה מאתגר לחקור שלה פתוגנזה במקרים קליניים. לפיכך, מחקרים נוספים התמקדות מנגנונים מורכבים הסלולר ורקמות דורשים שני ניסויים ויוו ב ללבוש מודלים של חלקיקים-induced osteolysis, מבחני במבחנה בתאים הקשורים עצם הומאוסטזיס3. מודל בעלי חיים חוקי חשוב לחשוף את ההשפעות של חלקיקים ללבוש על איבוד העצם, מתן הוכחות נוספות הסלולר מבחני.
מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא שיטה יעילה וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo לגרום calvarial osteolysis על ידי גרימת ציטוקינים דלקתיים ב מקרופאגים, הפעלת osteoclasts, מעכבות התפשטות אוסטאובלסט קידום אוסטאובלסט אפופטוזיס.
זה לוקח רק שבועיים להקים מודל זה. Osteolysis יכול להיות דמיינו לכמת על ידי hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים, מיקרו שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT)2. בנוסף, מודל זה יש עכבר יחסית בעלות נמוכה, הטרנסגניים ואת נוקאאוט מודלים יכול לשמש למסך מספר רב של תרכובות מינונים שונים3.
הנוהל כדי לבסס והערכה של מודל זה הוא פשוט. ראשית, חלקיקי CoCrMo מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. העכברים הוקרבו אחרי שבועיים ולאחר calvaria דגימות נבצרו; ניתוחים כמותיים בוצעו על ידי H & E מכתים andmicro-טי
מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין חלקיקים CoCrMo תאים שונים, כגון מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

<table><tbody><tr><td>סגסוגת CoCrMo מתותבת</td><td>Waldemar Link GmbH & Co</td><td>GEMINI MK II</td><td>חומר גלם להשגת ננו-חלקיקי CoCrMo</td></tr><tr><td>מיוצר זרם ישר עם שלוש אלקטרודות בוואקום גבוה</td><td>המכללה למדע חומרים & הנדסה, האוניברסיטה הטכנולוגית של נאנג'ינג</td><td>מכונה בעיצוב עצמי</td>זכר בן 6 שבועות C57BL / 6J עכברים מודל מרכז מחקר בעלי חיים של אוניברסיטת נאנג'ינג N000013 100% אתנול נאנג'ינג ריאגנט C0691514023 ממס של ננו-חלקיקי CoCrMo להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה Taizhou Weierkang ציוד רפואי ושות', בע"מ <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>W603</td><td></td></tr><tr><td>איזון מיקרואנליטי</td><td>שנזן Qun ארוך ציוד מכשירים ושות'. בע"מ</td><td>EX125DZH</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אולטרסאונד</td><td>שנחאי Yuhao מכשיר מדעי ושות', בע"מ</td><td>YH-200DH</td><td>להשעות ננו-חלקיקים CoCrMo</td></tr><tr><td>שידור מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>FEI</td><td>Tecnai G20</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI תוכנה</td><td>Compix Inc.</td><td>גרסת 6.6</td><td>לחישוב הקוטר הממוצע והתפלגות גודל החלקיקים.</td></tr><tr><td>מחבת עיקור ביד גבוהה</td><td>QIULONGYIQI</td><td>KYQL-100DS</td><td>לטיהור אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) מבחן</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>R13025</td><td>לאיתור אנדוטוקסין&nbsp;</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Taizhou Suyi Medical</td><td>B122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>בוסטר טכנולוגיה ביולוגית</td><td>AR0030</td><td>ממס של תמיסת מלאי ננו-חלקיקים של CoCrMo</td></tr><tr><td>Pentobarbital נתרן</td><td>סיגמא</td><td>P3761</td><td>להרדמת עכברים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח רגילה</td><td>SACKLER</td><td>SR8572EP-15</td><td>למניעת ייבוש עיני עכברים</td></tr><tr><td>75% אתנול</td><td>נאנג'ינג מגיב</td><td>C0691560275</td><td>חיטוי</td></tr><tr><td>כדור כותנה רפואי</td><td>Shuitao</td><td>1278298933</td><td>חיטוי</td></tr><tr><td>מכונת גילוח</td><td>Kemei</td><td>KM-3018</td><td>לגילוח מספריים פרווה</td></tr><tr><td></td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S12005-10</td><td>לחיתוך עור</td></tr><tr><td>תפר</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F34001-01</td><td>לתפירת</td></tr><tr><td>עור מחזיק מחט</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F33001-01</td><td>לתפירת עור</td></tr><tr><td>מחט</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>R14003-12</td><td>לתפירת</td></tr><tr><td>עור מלקחיים לכלי</td> דם <td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F22003-09</td><td>לתפירת</td></tr><tr><td>עור אזמל</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S31010-01</td><td>לקטיף קלבריה</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F12006-10</td><td>לקטיף קלווריה</td></tr><tr><td>100 ומיקרו; L פיפטות</td><td>Eppendorf</td><td>3120000240</td><td>להטמיע תרחיף חלקיקים בקלווטיות</td></tr><tr><td>100 ומיקרו; קצות פיפטה L</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td>להטמעת השעיית חלקיקים בקלבטיות</td></tr><tr><td>5 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Taizhou Weierkang ציוד רפואי ושות', בע"מ</td><td>W621</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת&nbsp;</td><td>SkyScan</td><td>SkyScan1176</td><td></td></tr><tr><td>אתילן דיאמין חומצה טטראצטית</td><td>Servicebio</td><td>G1105</td><td>הסרת אבנית</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Servicebio</td><td>#0001</td><td></td></tr><tr><td>מכונת חיתוך פרפין</td><td>Leica</td><td>RM2125RTS</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופית</td><td>Servicebio</td><td>G6004</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Servicebio</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעה HE</td><td>Servicebio</td><td>#1-5</td><td>HE מכתים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr></tbody></table>

בנייה והערכה של מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים cocrmo ב התרופפות אספטי

Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening

ללבוש חלקיקים-induced osteolysis הוא הגורם העיקרי התרופפות aseptic בכישלון שכיחיםהחלפת, אבל המנגנון הבסיסי נותר לא ברור. בשל זמן מעקב לצורך זיהוי, מופע ספורדי, זה מאתגר כדי להעריך את osteolysis של ofparticle-induced פתוגנזה במקרים קליניים. ומכאן, מודלים בעלי חיים אופטימלי יש צורך בלימודים. המודל מאתר של osteolysis calvarial נוסדה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי יעיל וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo קודם מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. אחרי שבועיים, העכברים הוקרבו, דגימות calvaria נבצרו; הערכות כמותיים בוצעו על ידי hematoxylin אאוזין מכתים ו טומוגרפיה מיקרו. נקודות החוזק של מודל זה כוללים פשטות ההליך, הערכה כמותית של איבוד מסת העצם, רגע, osteolysis, להשתמש הפוטנציאל הטרנסגניים או נוקאאוט מודלים ופיתוח בעלות נמוכה יחסית. עם זאת, מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את כוח מכני ואת ההשפעות כרונית של חלקיקי התרופפות אספטי. המודל מאתר osteolysis calvarial שנוצר על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין ללבוש חלקיקים שונים תאים, למשל, מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם ובין osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

חלקיקי ננו המיוצר ללא צורך במיקור חוץ CoCrMo היו בסביבות 50 ננומטר (שגיאת תקן של 3.56) בקוטר, כפי לכמת על ידי TEM (איור 2). לאחר חשיפה של העכבר מכונות CoCrMo חלקיקים, החיות (n = 6 לכל קבוצה) היו נשמרות רק בעוד שבועיים. בתוך השבועיים, החתך calvarial נרפא לחלוטין, התפר עלול ליפול. כל זיהום מקומי או מאי יתאחה משפיעים על הערכת אובדן עצם. אחרי העכבר הקרבה, נבצרו calvaria דגימות. לאחר מכן, כל הרקמות הרכות נוקה בעדינות, מיקרו-CT נעשה שימוש כדי לכמת את איבוד מסת העצם...

כתב יד זה מתאר מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo, המהווה מודל חיה אידיאלית להערכת הגומלין שבין חלקיקי ללבישה, תאים שונים התרופפות אספטי.

בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

Wear particle-induced osteolysis is a major cause of aseptic loosening in arthroplasty failure, but the underlying mechanism remains unclear. Due to long ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים ולהעריך את מודל האוסטאוליזה של הגולגולת בעכברים (Murine Calvarial Osteolysis Model) באמצעות חשיפה לננו-חלקיקים של קובלט-כרום-מוליבדן. אוסטאוליזה המושרית על ידי חלקיקי שחיקה היא גורם מרכזי לשחרור אספטי בכישלון של החלפות מפרקים, אך המכניקה העומדת בבסיס תהליך זה אינה ברורה. בשל זמן המעקב הממושך וההתרחשות הספורדית, קשה לחקור את הפתוגנזה של שחרור אספטי במקרים קליניים.לפיכך, יש צורך במודל בעלי שחיקה לצורך מחקר נוסף. במעבדה שלנו, מודל של אוסטאוליזה של גולגולת עכבר (murial calvarial osteolysis), המיוצר באמצעות חלקיקי סגסוגת קובלט, מהווה מודל יעיל לחקר הפתוגנזה של שחרור אספטי. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן בננו-קנה מידה מפרוטזה של סגסוגת קובלט, והשעייתם מחדש ב-phosphate buffer saline בריכוז של 15 milligram per millilitre.השלב הבא הוא לזהות את מיקום החתך בקו העובר בין שתי נקודות האמצע שבין שתי העיניים לשני האוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, יש להסיר את הפריאוסטיום הגולגולתי מהכיסה (calvarium) באמצעות דיסקציה בשיטת shock dissection. לאחר מכן, קח 50 µL של תמיסת סטוק של ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט והטמע אותם בתפר המרכזי של הכיסה.לאחר שבועיים של תחזוקה, יש להקריב חלק מהעכברים ולאסוף את הגולגולת (calvaria) לצורך הערכת אוסטאוליזה. אוסטאוליזה ניכרת בעכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט, הן בתמונות micro-CT והן בתמונות צביעת H and E. השג סגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן מפרוטזה של סגסוגת קובלט, והשג חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן מסגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן באמצעות זרם ישר בעל שלוש אלקטרודות בוואקום גבוה.כדי לכמת את הקוטר הממוצע של חלקיקי הקובלט-כרום-מוליבדן, העבירו 1 mg של חלקיקים לתוך 1.5 mL של אתנול אנहाइडרזי והשעו אותם באמצעות שקישול אולטרסוני. טפטפו טיפה אחת, כ-20 µL, מהסספנסיה על שולחן העדשה של מיקרוסקופ האלקטרונים חודר (TEM) ורכשו סדרה של תמונות. השתמשו בתוכנה המסופקת כדי לחשב את הקוטר הממוצע ואת התפלגות גודל החלקיקים בתמונות ה-TEM.שמאלה מוצגות תמונות TEM מייצגות, ומימין מוצגת התפלגות גודל הננו-חלקיקים של סגסוגת קובלט-כרום-מוליבדן שחושבה באמצעות התוכנה המסחרית שלנו. הקוטר הממוצע הוא כ-50 nanometers. יש להעביר את החלקיקים באוטוקלאב למשך 15 דקות כדי להסיר אנדוטוקסינים.לאחר מכן, השהו אותם שוב בתוך phosphate-buffered saline בריכוז של 15 milligram per milliliter כתמיסת מלאי. השלב הבא הוא בניית מודל של osteolysis של הגולגולת (calvarial osteolysis). בחרו והרדימו עכברים בני שישה שבועות: שישה עכברים לכל קבוצה.הניחו את בעלי החיים במנח הראשוני. הסירו את הפרווה וחטאו את העור על הגולגולת באמצעות 75% ethanol. לצורך החתך, זהו את שתי נקודות האמצע בין העיניים והאוזניים, בהתאמה, ובצעו חתך בעור לאורך הקו המחבר ביניהן.הסר בזהירות ובשלמות את הפריוסטום (periosteum) הגולגולתי מהגולגולת (calvarium) באמצעות דיסקציית השוק (shock dissection). דיסקציה נקייה של הפריוסטום מגבירה את האינטראקציות בין החלקיקים בגולגולת. התפרים מבוצעים בזהירות בשני קצות החתך באמצעות תפרים פשוטים בשיטה המקוטעת (simple interrupted suture).בדרך כלל, נדרשות שלוש תפרים לסגירה מלאה של הפצע. בשלב האחרון, העבירו את חוט התפר דרך החתך ללא קשירה, תוך החזקת שני קצות החוט. קחו 15 µL מתמיסת סטוק של ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט והטמיעו אותם בתפר המרכזי של הגולגולת (calvaria).קשרו את התפר האחרון בתפר פשוט רצוף. השאירו את העכברים למשך שבועיים נוספים. לאחר שבועיים, הקריבו את בעל החיים וגבעו את עצמות הגולגולת (calvaria).הסר בעדינות את כל הרקמה הרכה מדגימות גולגולת (calvaria) באמצעות פינצטה, וקבע את הרקמה ב-4% פאראפורמאלדהיד בטמפרטורה של 4°C. להערכת אוסטאוליזה במודל שהושרה על ידי ננו-חלקיקי קובלט-כרום-מוליבדן, בצע micro-CT ברזולוציה גבוהה 24 שעות לפני סריקת ה-micro-CT. העבר את דגימות הגולגולת מפאראפורמאלדהיד לתוך phosphate-buffered saline.ביום סריקת ה-micro-CT, הוציאו את דגימות הלתחם (calvaria) מתמיסת phosphate-buffered saline, וקבעו אותן על מתאם המחובר למכשיר. סרקו את הלתחם במכשיר ה-micro-CT. בצעו שחזור תלת-ממדי באמצעות תוכנות מתאימות.צביעת H and E היא כלי נוסף להערכת אוסטאוליזה במודל המושרה על ידי ננו-חלקיקים. דקלצף דגימות של calvaria בתוך phosphate-buffered saline, המכיל 15% של ehylenediaminetetraacetic, למשך שלושה שבועות בטמפרטורה של 4°C. הטמע את ה-calvaria המדוקלצפות בפראפין וחתוך אותן לפרוסות בעובי של 2 µm באזור השקיעת החלקיקים.צבע את החיתוכים בהמטוקסילין ואאוזין. בחן את המורפולוגיה הכללית באמצעות מיקרוסקופ אור ודגום מיקרוגרפים. להלן תמונות micro-CT מייצגות.בפאנל השמאלי מוצגות תמונות שחזור תלת-ממדי של נתוני micro-CT. בפאנל הימני מוצגות תמונות חתך של עכברים מקבוצת הביקורת, קבוצת הניתוח המדומה (sham) ועכברים שטופלו בננו-חלקיקים. האוסטאוליזה ניכרת באופן ברור בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים.להלן ניתוח כמותי של תצלומי micro-CT שבוצע באמצעות התוכנה הנלווית למכשירים. המדידות כוללות צפיפות מינרלית של העצם, נפח עצם, או יחס נפח כולל, אחוז נקביות כולל, מספר טרבקלות, עובי טרבקלות, והפרדה או מרווח בין טרבקלות. עכברים שטופלו בננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מראים צפיפות מינרלית של העצם ונפח עצם נמוכים משמעותית, עם אחוז נקביות כולל גבוה יותר בהשוואה לבעלי החיים בקבוצת הביקורת.להלן תמונות מייצגות של צביעת H and E עבור דגימות קלבאריה (גולגולת) מעכברים מקבוצת הביקורת, מקבוצת ניתוח דמה ומעכברים שטופלו בננו-חלקיקים. אוסטאוליזה ניכרת גם בקבוצת הטיפול בננו-חלקיקים. מודל אוסטאוליזה קלווריאלי עכברי שהוקם באמצעות ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מציג שיעור הצלחה גבוה במידול אוסטאוליזה המושרית על ידי חלקיקי שחיקה.להלן מספר גורמים מרכזיים. ראשית, ננו-חלקיקי סגסוגת קובלט מגבירים את האינטראקציה בין חלקיקי השחיקה לבין הגולגולת (calvaria). שנית, חשיפה נאותה של הגולגולת ודיסקסיה ברורה של הפריאוסטום (periosteum) הופכות את האינטראקציה בין החלקיקים לבין הגולגולת לאנטנסיבית יותר.שלישית, מדידות כמותיות של אובדן עצם באמצעות micro-CT מקלות על זיהוי הבדלים באובדן עצם בין טיפולים שונים, ומספקות לנו ראיות מוצקות לאוסטאוליזה בהשוואה להיסטומורפומטריית עצם מסורתית. מודל אוסטאוליזה של גולגולת (calvaria) המושרה על ידי חלקיקי סגסוגת קובלט הוא מודל אידיאלי לחקר האינטראקציה בין חלקיקי שחיקה לתאים שונים בתהליך של שחרור אספטי (aseptic loosening), כגון מקרופאגים, פיברובלסטים, אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים.אנו מקווים שהמודל שלנו יהיה מועיל למחקרי שחרור אספטי בעתיד.

construction-evaluation-murine-calvarial-osteolysis-model-exposure-to

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של שומן הנגזר מתאי סטרומה lipoaspirate ויצירת 4 calvarial פגם קריטי בגודל מ"מ להעריך התחדשות שלד.

תיקון של דגם פגם Calvarial הקריטי בגודל תאי שומן באמצעות נגזרת סטרומה נקטפו מן Lipoaspirate

למרות שמודלים של עכברים הם כלים יקרי ערך להנדסת רקמות עצם, מודלים של פגמים בעצמות ארוכות הם דלילים. צורך זה הניע את פיתוח הפרוטוקול הנוכחי המשתמש בלוחית נעילה עם ארבעה ברגים וג'יג ייעודי לביצוע וייצוב פגם בגודל קריטי הניתן לשחזור, עצם הירך עם תחלואה נמוכה.

הקמת דגם פגם קריטי בגודל הירך מגזרית עכברים מיוצב על ידי פלייט Osteosynthesis

תאי סטרומה שמקורם בשומן עשויים להיות שימושיים להנדסת רקמה חדשה מתאי המטופל עצמו. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של תת-אוכלוסייה של תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי (ASCs) עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, ואחריו יישום התאים בבדיקת ריפוי קלוריאלי in vivo.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כירורגי ארנבים עם המטרה להעריך חומרים החלפת עצם במונחים של יכולות התחדשות העצם. על-ידי שימוש בגלילים הצצה הקבועים על גולגלות הארנבים, האוסטאופהלוגיה, אוסטורגנזה, אוסטג'נסיס וביוקולוגנזה הנגרמת על ידי החומרים עשויים להיות מוערכים על בעלי חיים חיים או מורדמים.

מודל calvarial של הגדלת עצם בארנב להערכת צמיחת העצם ונינובאסקולריזציה בחומרים החלפת עצם

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשבר יאטרוגני של פיר עצם הירך של חולדות לבקנים Wistar ומעקב אחר התפתחות היבלת. מודל זה של אוסטאוטומיה של עצם הירך יכול לסייע לחוקרים להעריך את תהליך ריפוי השבר ולחקור כיצד תרופה יכולה להשפיע על ריפוי שברים.

פרוטוקול לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של עצם הירך בחולדות ויסטאר אלבינו

פרוטוקול זה מדגים שלב אחר שלב פרטים כיצד לחלץ את הטוחנת הראשונה המנדיבולרית בעכבר. הוא מספק שיטה חלופית לחוקרים המתמקדים בריפוי והתחדשות עצם הלסת.

הקמת מודל ריפוי שקע מיצוי מולארי מנדיבולרי מורין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פגם בחלל הקופסה ברקמת דיאפיזה של עצם הירך של חולדה. מודל זה יכול להעריך ביצועים ביו-חומריים תחת לחץ ביומכני ולחקור מנגנונים של התחדשות עצם הקשורים לאוסטאוגנזה תוך-ממברנית.

יצירת מודל פגם בחלל הקופסה בעצם קליפת המוח של Femora חולדה

מודל הפגיעה במח העצם של העכברים הוא כלי שימושי לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות התעצמות פנימית. פרוטוקול כירורגי פשוט זה מתאר את הליך אבלציה של מח העצם להערכה במורד הזרם של היווצרות עצם חדשה ותגובות תאיות לאחר פציעה.

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

חקור מודל אוסטאוליזיס קלבריאלי בעכברים לחקר התרופפות אספטית בעזרת חשיפה לחלקיקי CoCrMo. שיטה זו מאפשרת הערכת אינטראקציות בין חלקיקי שחיקה לתאים ומסייעת להבנת מנגנוני הפתוגנזה.

בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

גלה סרטונים נוספים