Name: ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: למד זיהוי RNA ברזולוציה גבוהה בעוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברת אות טיראמיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפוצה מרחבית של RNA בעלות נמוכה וביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על ידי מענק כדי HMK על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק 133473 סמרטוט).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

לעורכים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול המתואר מספק שיטה לשחזור מאוד, רגישה, וחסכוני עבור הגילוי של RNAs רוב קבוע עוברי דרוזופילה או רקמות. למרות מעט יותר מסובך ממה יותר השתמשו באופן מסורתי phosphatase אלקליין בשיטה של בדיקה לזיהוי, הרזולוציה מתקבל על ידי דג גדול בהרבה, והוא הרגישות דומות או משופרת 7,8. באמצעות לוחות שלמים או חלקיים microtiter, הפרוטוקולים יכול לשמש עבור ניתוחים בקנה מידה גדול או מוגבלת של הגנים של עניין. יצוין כי הגששים שנוצר עשוי לזהות את כל או אחוי התעתיק מספר טפסים אלא אם הגששים נועדו יותר במיוחד (קרי, exons יחיד). למרות בדקנו הגששים קטן כמו נוקלאוטידים 200 עם הצלחה סבירים, הגששים קטנים נוטים להיות פחות יעיל, וייתכן שהוא פחות ספציפי. . בבירור, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור זיהוי אינטרונים קטן, exons, או מעובד מיקרו Rna.
למרות גישה זו משתמשת צעד אנזימטי כדי להגביר את עוצמת האותות, עוצמת אות מופיעה כדי להיות פרופורציונלי היעד גנים במגוון יחסית לינארית ורחב של רמות הביטוי. בהגדלה גבוהה יותר, האות נתפסת puncta או ספאקלס בתוך תאים ורקמות. עבור תעתיקים נדירים יחסית נראים רק כמה puncta זעירים. התעתיק שפע גודלת, אלה גדלים מספר וגודל. כמו עם מולקולה בודדת דגים (smFISH), puncta קטן יחיד יתאימו גם ל- RNAs יחיד, צריך גם להיות ברצון לכמת באמצעות תוכנת הדמיה ואינפורמטיקה. השוואות של תמונות שפורסמו שהושג באמצעות smFISH עם תמונות כי לנו יש מספר פעמים עבור המטרות אותן מציע כי בסך הכל, רגישות ורזולוציה של שתי השיטות דומים יחסית, למרות זה צריך להיבדק על ידי השוואות קפדנית יותר. בהתחשב את חשבון גבוה יותר של smFISH, פעולת השירות שסופק כאן צריך לתת תוצאות דומות בכל חלק של העלות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות תעתיקים קטן, או חלקים ברורים של הפרוטוקולים, מומלץ smFISH.
בשל גודל קטן יותר של הגששים דגים מסוימים, שיטה זו עשויה גם להיות יותר החודר לרקמות גדולים, או מכשולים משמעותיים. עם זאת, השימוש רמות גבוהות דטרגנט וצובטת רקמות קיבוע ו permeabilization מופיעים פתר בעיה זו. בסופו של דבר, למרות שפותח דרוזופילה לרקמות, המאגרים דטרגנט גבוהה המתוארים כאן בשביל לרקמות ביתור צריך גם לעבוד עבור עוברי דרוזופילה וכן רוב אחרים אורגניזמים ורקמות.

שיטות זיהוי RNA של הגנום כולו חדשות כגון ה-RNA-seq הרחיבו מאוד את הידע שלנו של מתי ואיפה באים לידי ביטוי של גנים, ועל איזה רמות1. עם זאת, אלה מספקים טמפורלית הדלה יחסית ופתרון מרחבית. רנ א בהכלאה באתרו מאפשר את התפוצה המרחבית של תעתיקים חזותית שחלים ברקמות קבוע, ובכך לחשוף את הפרטים של לוקליזציה הסלולר, subcellular2. שימוש פלורסנט היברידיזציה (דגים) מאפשר רזולוציה מרחבית יותר שכן היא מאפשרת את השימוש בטכניקות מיקרוסקופ רב עוצמה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי וגיליון אור3. סמני פלורסנט כגון דאפי יכול לשמש גם כדי ליצור קשרים subcellular4. דגים מקלה גם על התצפית של RNAs וחלבונים מרובים בו זמנית עם סימנים ברורים של חפיפה ברמת subcellular. ניתן למצוא ב-3,הפניות הבאות5ריאגנטים ייחודי השלבים הנדרשים עבור תיוג-כפול.
ההליכים המתוארים כאן לנצל microtiter 96-ובכן לוחות עבור כל השלבים, כולל ייצור תבנית cDNA (המושבה PCR), ייצור בדיקה RNA (באמצעות שעתוק תלויי-פולימראז הגשמים T7, T3 או SP6) באתרו בתוך הכלאה, ו פיתוח אות ניאון. מספר מספיק של העוברים או רקמות נוספות כל טוב של צלחת 96-ובכן כדי לאפשר הערכה של עקביות ולשינויים. כל אחד מקבל אז בדיקה שונים. לאחר פיתוח אות, העוברים או רקמות מכל קידוח נערכים בשקופיות בודדות מיקרוסקופ לבדיקה מיקרוסקופית.
השימוש tyramide אות הגברה (TSA) לצורך זיהוי המכשיר מייצר אותות חזקים עם רזולוציה יוצאת דופן subcellular 5,6,7,8. לוקליזציה subcellular של RNAs הוא מנגנון רגולטורי חשוב 9 שמופיע אצל כמעט כל RNAs 4,10,11. ניתוחים אלה הראו גם כי העותק רבים לא מזוהים על ידי RNA-seq מאותרים בקלות על ידי דגים 8. העיבוד של RNA בחיי עיר הכלאה ללוחות 96-ובכן מאפשר ניתוח של הגנים עד 96 של עניין בכל פעם (צלחות יותר אם נוספים משמשים), ביצוע ניתוח של אלגוריתמית אפשרי. על ידי חיתוך הלוחות למקטעים קטנים יותר, השיטה מותאם בקלות גם רק כמה דוגמאות. פרוטוקול סיפק מתאימה לניתוח של RNA התפלגויות של רוב סוגי רקמות. אמנם לא מוצג, זה וישימה הלא -דרוזופילה רקמות גם כן.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>ללא DNase ו-RNase</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix עם צבע (אמביוגן)</td> <td>Biomart (קנדה)</td> <td>141106-1K</td><td>ללא DNase ו-RNase</td></tr><tr><td>ללא 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>צלחת סינון 96 בארות ללא DNase ו-RNase (</td></tr><tr><td>1.2 אום, PVDF הידרופילי ממברנה</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>משמש להסרת liguid מתחתית הצלחת עם רקמות ציפה</td></tr><tr><td>צלחת PCR 96 בארות (200 &mu; l)</td> <td>מסנן מזרק Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc (0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק Acrodisc (0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96-well בדיקות צלחות אחסון</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>לאחסון מלאי גליצרול חיידקי</td></tr><tr><td>AXYGEN אלומיניום אטמי צלחות</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>לאיטום צלחות</td></tr><tr><td>AXYGEN קצות רחבים (200 ul)</td> <td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>להעברת דגימות</td></tr><tr><td>ביוטין-SP (מרווח ארוך) IgG Fraction עכבר חד שבטי אנטי-דיגוקסין</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>נוגדן ראשוני ל באתרו (מלאי conc. 1 מ"ג/מ"ל, עובד conc. 2.5 &mu; גרם/מ"ל או דילול של 1/400.</td></tr><tr><td>סעפת 8 ערוצים של מותג (ניתנת לחיטוי)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>להסרת נוזלים מהחלק העליון של לוחות PCR של 96 בארות</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1919</td><td>ריכוז מלאי 34 מ"ג/מ"ל מומס ו-0.2&mu; m מסונן ב-100% EtOH (השתמש כ-1/1000)</td></tr> <tr><td>ציאנין 3 טירמיד (Cy3-TSA)</td> <td>תוצרת</td><td></td> בית <td>ניתן להזמין מ-Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo [2.2.2] אוקטן)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>מגיב אנטי-דהייה באמצעי הרכבה</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridine-5'-triphosphate</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>כלוב איסוף עוברים</td><td>בית מיוצר</td><td>N / A</td><td>גודל: 75 ס"מ X 75 ס"מ X 75 ס"מ עשוי עם פולימתיל מתקרילט</td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5804</td><td>אפנדורף</td><td>דגם 5804</td><td>צנטריפוגה לצלחות 96 בארות על רוטור A-Z-DWP</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>ביושופ</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ביושופ</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביושופ</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>מלאי: 50 מ"ג/מ"ל. ריכוז עבודה 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת הכלאה</td></tr><tr><td>חרוזי שריון מעבדה</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>מילוי יחידת חימום</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M מיני מיקסר אגוזים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-998-347</td> רשת <td>ערבוב דגימה</td></tr><tr><td>- 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>לאיסוף עוברים</td></tr><tr><td>רשת - 800 מיקרון</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>לתפיסת רקמות רופפות / עשוי לשמש לצינור מיוחד באיור 4.</td></tr><tr><td>משקפי מיקרו כיסוי</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>גודל: 22 X 22 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרו שקופיות, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>גודל: 25 X 75 מ"מ</td></tr><tr><td>סעפת ואקום רב-בארות</td><td>צלחת Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>הסר נוזל מתחתית צלחת סינון 96 בארות</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td> <td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td> מכונת PCR <td>קיבוע</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>דגם: מנוע DNA PTC-200</td><td>צלחת 96 בארות PCR ובדיקה דנטורציה</td></tr><tr><td>תמיסת חומצה פיקרית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>80456</td><td>לקיבוע רקמות I תמיסת</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCL)</td> <td>מכסה ביושופ</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>PP לצלחות 96 בארות, מכסה 100/מארז</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>לאחסון צלחות</td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים חד פעמיים של פרוג'ן (50 מ"ל, סטרילי)</td> <td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>טיפול בנוזלים</td></tr><tr><td>פרוגן רדיד אלומיניום ניתן לפירסינג</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>אטם צלחת 96 בארות, ללא DNase ו-RNase</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>חדירות עובר</td></tr><tr><td>מעכב ריבולוק ריבונוקלאז ריבונוקלאז</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>EO0381</td><td>סט 40 יחידה/ul</td></tr><tr><td>ריבונוקלאוזיד טריפוספט (NTP)</td><td></td><td>סיתזת בדיקת RNA</td> <td>11277057001 רוש</td></tr> מים <tr><td>ללא RNase GIBCO</td><td></td><td>10977015-500 מ"ל</td><td>סיתזת בדיקת RNA</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>הסר זיהום RNase</td></tr><tr><td>DNA חד גדילי מאשכי סלמון</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>לתמיסת הכלאה</td></tr><tr><td>חלב רזה (כוח ללא שומן)</td> <td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>ריכוז העבודה הוא 1% ב-1 X PBT או PBTT כמגיב חוסם</td></tr><tr><td>נתרן אצטט (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (ללא RNase)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>ריכוז העבודה הוא 10% (v/v) עבור משקעי DNA או RNA</td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 יחידה/ul</td></tr><tr><td>זריקת נירוסטה לאמבט חול</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>למילוי יחידת החימום</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ ומקור אור צוואר אווז</td><td>Leica</td><td>דגם: MZ6</td><td>דיסקציה של רקמות והרכבה</td></tr><tr><td>סטרפטווידין, חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S911</td><td>מלאי נוגדנים משני: 1 מ"ג/מ"ל, השתמש בדילול 1/1000 (1 &mu; g/ml) עבור באתר.</td></tr><tr><td>T3 RNA פולימראז</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 יחידות/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 יחידות/תחנת</td></tr><tr><td>קצה ul (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>מוסמך DNase ותחנת קצה ללא RNase</td></tr><tr><td>(200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>מוסמך DNase ו-RNase</td></tr><tr><td>ללא טיפים (1 מ"ל)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>מוסמך ללא DNase ו-RNase TRITON</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>ריכוז העבודה הוא 0.3% ב-1 X PBT לרקמה באתרה</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>ריכוז העבודה הוא 0.1% ב-1 X PBT לעובר באתרו</td></tr><tr><td>נייר סינון איכותי Whatman, דרגה 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane), גליצרול, חומר</td><td></td><td></td> הרכבה נגד דהייה, <td>DABCO (1.25 גרם), גליצרול (35 מ"ל או v/v, 70%) ו-1 X PBS (15 מ"ל, או v/v, 30%). שמור על חושך ורוק בחדר קר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS עם 1 מ"ל Tween 20 (0.1%)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS עם 1 מ"ל Tween 20 (0.1%) ו-3 מ"ל Triton-X-100 (0.3%)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1% חלב דל שומן ב-1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1% חלב רזה ב-1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה tyramide אות

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

המאמצים שלנו כדי לקבוע דפוסי ביטוי ולוקליזציה subcellular של דרוזופילה RNAs על בסיס הגנום כולו, ו במגוון של רקמות, פיתחנו שינויים ושיפורים רבים כדי שלנו המקורי פלורסנט סיטו פרוטוקול הכלאה (דגים). כדי להקל על התפוקה ויחס עלות-תועלת, כל השלבים, מדור בדיקה לאיתור אות, מבוצעות באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter אקסון. Digoxygenin (מחדירים)-הגששים שכותרתה antisense RNA מיוצרים באמצעות שיבוטים cDNA או דנ א גנומי כתבניות. לאחר קיבוע הרקמה, permeabilization, הגששים הם hybridized כדי תעתיקים של הריבית, אז שזוהו באמצעות רצף של נוגדן אנטי החפירה מצומדת כדי ביוטין, streptavidin מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) ו fluorescently מצומדת . tyramide, המייצרת בנוכחות HRP, בינוני מאוד תגובתי המאגד לאזורים צפופים אלקטרונים של חלבונים סמוכים מיידית. השלבים הגברה ולוקליזציה לייצר אות מקומי מאוד ועמיד המקל על שני לוקליזציה התעתיק סלולרית ו- subcellular. הפרוטוקולים סיפק מוטבו להפקת אותות ספציפי מאוד במגוון רחב של רקמות, שלבים התפתחותיים. הפניות ניתנים גם וריאציות נוספות המאפשרות זיהוי בו זמנית מספר תעתיקים, או תעתיקים, חלבונים, באותו זמן.

איור 6 מציג דוגמאות של התוצאות המתקבלות באמצעות הליך זה. הלוחות 3 העליון להראות דוגמאות של עוברי דרוזופילה מוקדם (איור 6, לוחות A-C), 3 הבא מראות דוגמאות של המנוח עוברי דרוזופילה עם אותות ברקמות שונות (amnioserosa, השרירים, מערכת העצבים המרכזית, בהתאמה (איור 6, לוחות D-F). הבא דוגמאות מ-3 לחלל זחל רקמות (איור 6, לוחות G-J). K ו- L מראות להחליפן בתמונות של בלוטות המין למבוגרים (השחלה ואת testis, בהתאמה). יש מאות תמונות שהועלו, מבואר ב שלנו ניתן לחיפוש 'פלורסנט בחיי עיר זבוב הפירות מסד' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
איור 1. קווי המתאר של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) פרוטוקול ומפתח מכשור. (א) PCR הגברה של cDNA. (B) במבחנה שעתוק כדי ליצור גנים ספציפיים antisense החפירה - תוויות RNA הגששים בצלחת 96-ובכן (צילום של צלחת שמוצג b). (ג) ו- (D): מבוגרים (נקבה: יחס זכר 2:1. 300-400 זבובים/בקבוק) זבובים מותר להזדווג במשך 3-4 ימים. העוברים של אוסף לילה על תקן קמח תירס מזון 25 ° c מועברים קופסת פלסטיק מאוורר היטב (1 ליטר של קמח תירס מזון במיכל בגודל: 8 "X 8" 3" LWH) או בקבוקים חדשים, שמירה על צפיפות זחל נאותה. אוסף רקמה, אבקת שמרים פעילים צריך להיות התיז על האוכל-24, 48 שעות לאחר הנחת (AEL) ביצה. (E עד H): פלורסנט בחיי עיר הכלאה ניסויים שבוצעו על פני 3 ימים רצופים. עבור עוברי או רקמות שצפים לא, השתמש צלחת PCR 96-ובכן כפי שמוצג ב' תצלום עם העצמות ערוץ 8 (תצלום c). בשביל לרקמות שצפים, כמו רוב רקמות זחל, להשתמש צלחת עם תחתית מסנן (צילום ברה) והסר נוזל מלמטה עם העצמות סעפת באמצעות לחץ נמוך (צילום ב- e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
באיור 2. קביעת התשואה בדיקה RNA. לאחרונה מסונתז הגששים antisense RNA מובחנים ג'ל agarose 1% (5 µL lane). התשואה יכולים להיות מסווגים (מבוסס על האינטנסיביות של הלהקה) 'תשואה נמוכה' הנמצאים בסמטאות 3 ו-10, 'תשואה טיפוסי' הנמצאים בסמטאות 1, 4, 5, 6 ו 8 או 'תשואה גבוהה' הנמצאים בסמטאות 2, 7, 9, 11 ו- 12. לשימוש דגימות עם 'טיפוסי תשואות', 10-15 µL של בדיקה מעורבבת עם µL 100 של הכלאה פתרון עבור ניסוי ב באתרו . לדלל דגימות עם 'תפוקה גבוהה' של המכשיר עם פתרון הכלאה נוספים עם הלהקה כמות יחסית עוצמת 'אופייני בדיקה'. שואפים יש ריכוזים שווים בדיקה סופית מכל קידוח. החץ מצביע על אחד "הגששים RNA,' הלהקה גבוה יותר על כל ליין היא תבנית ה-DNA המקורית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
איור 3. רס ן צעדים אוסף העובר בקנה מידה גדול, קיבעון. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
באיור 4. צינור תוצרת בית הסרת נוזל לרקמות זחל או צף. ממחטה זחל ומבוגרים מרחף בתמיסה במהלך קיבעון. כלי פשוט זה מורכב רשת ניילון מוחזק על ידי µL 200 לחתוך עצה, ואחריו טיפ 1 מ"ל בתור מתאם להתחבר העצמות. נוזל ניתן להסיר בבטחה מבלי לאבד את כל רקמות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
איור 5. הגברה של האות Tyramide. (1) לחפור התווית על-ידי בדיקה antisense RNA hybridizes בחוש אנדוגני RNA. (2) כריכת חיסונית-זיקה בין נוגדן ראשוני מצומדת ביוטין החפירה-UTP. (3) HRP מצומדת ביוטין איגודים streptavidin. (4) HRP מזרז את cyanine 3-tyramide, מימן על-חמצני התגובה כדי ליצור רדיקלים 3-tyramide cyanine קצרת ימים. (5) cyanine 3-tyramide רדיקלים לאגד טירוזין שאריות על חלבונים הסמוכים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
איור 6. נציג בחיי עיר הכלאה תמונות. כל לוח מראה דוגמה של RNA שונים (מוצג בציאן) ואת הגרעינים צבעונית עם דאפי (מוצג בצבע אדום). (א-ג) דוגמאות עוברי דרוזופילה מוקדם. (D, F) דוגמאות מאוחר עוברי דרוזופילה . (G-J) דוגמאות של 3 instar רקמות זחל דרוזופילה (malphigian בקוריאנית, פיתול, בלוטות ושרירים בהתאמה). (K) השחלה למבוגרים. (יב) למבוגרים testis. כל לוח מציג את השם של הגן זה המכשיר הוא hybridizing ל. גודל ברים = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תמלילי RNA במקומם בתוך תאים ורקמות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית והביולוגיה ההתפתחותית, כגון המיקום של RNA בתוך תא, רקמה או עובר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מזהה התפלגויות מרחביות של RNA הן ברמות גבוהות של רזולוציה ורגישות והן בעלות נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות.פיתחנו בתחילה פרוטוקול זה כדי לחקור את ההתפלגויות התת-תאיות של כמה שיותר RNA של Drosophila. זאת על מנת לקבוע את היקפה ומגוון ההתפלגויות התת-תאיות. התחלנו את הפרויקט בעבודה עם עוברים, אך מאוחר יותר התאימנו ואופטימיזנו את הפרוטוקול כדי שנוכל לעבוד בתפוקה גבוהה (high throughput) עם רקמות שבודדו מזחלים ומזבובים.ההיבט המאתגר ביותר של הפרוצדורה הוא מספר השלבים והפוטנציאל לנסיגה לשגיאות הנובע מכך, כמו גם הצורך להבטיח היעדר RNAs במהלך ייצור הגששים. כדי להגביר את התפוקה ולהבטיח יעילות כלכלית, הפרוצדורות המוצגות בסרטון זה משתמשות בלוחות מיקרוטיטר בעלי 96 בארות עבור כל השלבים. ניתן להתאים שיטה זו בקלות למספר דגימות קטן יותר על ידי חיתוך הלוחות לרצועות של 8 או 12 בארות.התחילו בדילול של 10 µL של תרבית חיידקים שגדלה בן לילה ב-90 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב, בכל באר של פלטת PCR חדשה בעלת 96 בארות. בצעו דנטורציה ל-DNA בטמפרטורה של 95 °C בטרמוסייקלר למשך חמש דקות. מיד לאחר מכן, הניחו את הפלטה על קרח למשך חמש דקות לפחות.הכינו את תגובות ה-PCR בלוח PCR חדש בעל 96 בארות. השתמשו בפרימרים אוניברסליים מתאימים וחלקו 48 µL של תערובת PCR מאסטר לכל בארה. הוסיפו שתי µL של תבנית DNA של פלסמיד דנטורטי לכל בארה.בצע את ההגברה במכשיר PCR בעל 96 בארות. עם סיום ההגברה, שקיע את תוצרי ה-PCR באמצעות תערובת של אתנול וסודיום אצטט. אחסן את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.סובב את פלטת 96 הבארים בצנטריפוגה ב-2,250 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות. באמצעות פפיטה של סומן ואקום בעלת שמונה ערוצים, בעלת מבנה המונע מהטיפים להגיע לתחתית הבארים בעת שאיבת המשקעים, הסר בזהירות את הנוזל העליון. שטוף פעם אחת עם 160 µL של 70% ethanol קר.סובב בצנטריפוגה ב-2,250 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפוך בעדינות את פלטת 96 הבארים על נייר סופג כדי להסיר את טיפות הנוזל האחרונות מכל באר, ויבש את משקעי ה-DNA באוויר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. המס מחדש את ה-DNA שהשקיע ב-25 µL של מים נקיים מ-RNase.בדקו את הגודל והתנובה של תוצרי ה-PCR באמצעותתអេלקטרופורזה בג'ל אגרוז. הכינו את תגובות השעתוק in vitro על ידי הוספת הרכיבים המתאימים לכל באר בלוח PCR חדש בעל 96 בארות. הוסיפו 7.5 µL של תבנית DNA לכל באר תואמת.כסו את הפלטה בסרט איטום. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 3.5 עד 4 שעות. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר תערובת מאסטר (master mix) המורכבת ממים מזוקקים פעמיים שעובדו ב-DEPC, 100% ethanol ו-3M sodium acetate.שמור בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. סבב את הפלטה בצנטריפוגה ושטוף את הבארות כפי שהודגם קודם לכן. השהה מחדש את הגשון השקוע ב-25 microliters של מים מזוקקים פעמיים שעובדו ב-DEPC.גששים של RNA antisense שסונתזו לאחרונה הורצו על ג'ל אגרוז 1% כדי לבדוק את שלמותם ואת התפוקה שלהם. בהתבסס על עוצמת הפס, ניתן לאפיין את התפוקה כתפוקה נמוכה, תפוקה טיפוסית או תפוקה גבוהה. לאחר שימוש בחמישה מיקרוליטרים מכל גשש עבור אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ערבבו את 20 המיקרוליטרים הנותרים עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת היברידיזציה ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.כדי להתחיל את ההליך, העבירו 20 עד 30 פיתאות לצלוחית פטרי המכילה PBS קר בתמיסות קיבוע וקררו על קרח למשך שתי דקות כדי להפחית את ניידות הפיתאות. בצעו ניתוח של הפיתאות תחת מיקרוסקופ דיססקציה. השתמשו בפינצטה חדה כדי לפתוח בזהירות את החלק הקדמי ולסחוט את הרקמות מהחלק האחורי לכיוון הקדמי.לאחר זמן מקסימלי של 15 דקות, העבירו את הרקמות המופרדות לפרועת לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר לצורך קיבוע והניחו על קרח. הסירו את ה-PBS והוסיפו 800 מיקרוליטר של תמיסת fix one. דגרו על מערבל שולחני למשך 30 דקות יחד עם רקמות אחרות שנאספו קודם לכן לקיבוע.שטפו את הרקמות פעם אחת עם 800 µL של PBTT ושמרו את הפחית על קרח בזמן איסוף וקיבוע של רקמות נוספות. רכזו את כל הרקמות שחולקו לפחית פלסטיק אחת בנפח 15 mL המכילה רשת במכסה. שאבו את עודפי הנוזל דרך הרשת שבמכסה.שטפו עם 10 milliliters של PBTT והשקו עם 10 milliliters של PBS. כדי לבטל את הפעילות האנדוגנית של horse radish peroxidase, הוסיפו חמישה milliliters של 0.3% hydrogen peroxide ב-PBS והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שטפו פעמיים עם 10 milliliters של PBTT.בצעו פרמיאביליזציה לרקמות על ידי הוספת 10 milliliters של 80% acetone שקולל מראש ודגירה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך 10 דקות. שטפו פעמיים עם 10 milliliters של PBTT כדי להחזיר את הרקמות למצב הידרטציה. לאחר שטיפת הרקמות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, אחסנו אותן בתמיסת היברידיזציה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.אם לא נעשה בהם שימוש עד למחרת, יש להחליף את מכלול המסנן במכסה רגיל. יש להעביר מנות של כ-20 µL של רקמות לכל באר לתוך פלטת PCR בעלת 96 בארים על קרח. באמצעות פיפט רב-ערוצי בעל שמונה ערוצים, יש להסיר את תמיסת ההיברידיזציה מהרקמות.הוסיפו 100 µL של תמיסת היברידיזציה שדנטורה טריכּה לכל באר וכסו בסרט איטום. בצעו היברידיזציה מקדימה (Pre-hybridization) לרקמות בטמפרטורה של 56 °C באמצעות יחידת חימום Dry bath המכילה חרוזי מתכת למשך מינימום של 2.5 עד 3 שעות. דנטרו 100 µL של הגשוש (probe) שהוכן בלוח PCR בעל 96 בארות בטמפרטורה של 80 °C למשך חמש דקות.קררו מיד על קרח למשך חמש דקות. הסירו את תמיסת קדם-ההכלאה מהרקמות והוסיפו פרובים ספציפיים לגן שדנטורו לכל דגימה. כסו בסרט איטום מאלומיניום ובצעו הכלאה בטמפרטורה של 56 degrees Celsius תחת גלגולים ממתכת ביחידת חימום מסוג dry bath למשך 16 עד 18 שעות במהלך הלילה.לפני תחילת הליך זיהוי הגשש, יש לחמם מראש את כל התמיסות הדרושות ביחידת חימום של 56 °C. העבירו בזהירות רקמות שעברו היברידיזציה לתוך פלטת 96 בארות המתאימה למניפולטור ואקום לפלטות רב-בארות. לבארות של פלטות אלה יש תחתית ממברנה המאפשרת הסרה של התכנים תחת ואקום.הוצא את הגששים מלוחית 96 הבארות ושטוף את הדגימות עם תערובות של תמיסת היברידיזציה ו-PBTT בהתאם לשלבים המצוינים בטבלה זו ביחידת חימום של 56 degree Celsius. לאחר השטיפה השלישית עם PBTT, הוצא את לוחית 96 הבארות מיחידת החימום, הסר את תמיסת ה-PBTT, ובצע חסימה של הרקמות באמצעות PBTTB במערבל שולחני בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הוסף 100 microliters של תמיסת נוגדנים לכל בארה והדגר למשך שעתיים במערבל הדגימות השולחני.לאחר שטיפה ב-PBTTB כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הוסף 100 microliters של תמיסת Streptavidin horse radish peroxidase לכל באר והדגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי. שטוף פעמיים עם PBTTB למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, הדגרה של הרקמות עם תמיסת DAPI כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.התחילו את ההליך על ידי דגירה של הדגימות עם תמיסת Tyramide, ודגרו את הדגימות למשך שעתיים על מערבל שולחני בחושך. הסירו את תמיסת ה-Tyramide מהרקמות עם סיום הדגירה. לאחר שטיפה עם PBT ו-PBS כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 150 µL של תמיסת קיבוע למניעת דהייה (antifade mounting media) לכל באר.שמרו את הדגימות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי לאפשר לרקמות לשקוע לתחתית הבאר או המבחנה. למחרת, העבירו את הדגימות לזכוכית מיקרוסקופ ואטמו באמצעות כיסית. לבסוף, צלמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה.מוצגות דוגמאות לתוצאות שהתקבלו באמצעות פרוצדורה זו עבור עוברים מוקדמים של Drosophila ועוברים מאוחרים של Drosophila, עם אותות ב-amnioserosa, בשרירים ובמערכת העצבים המרכזית. שם הגן שאליו הגיבריד את הגשש מוצג בכל פאנל. בהמשך מוצגות דוגמאות מרקמות של זחלי גיל השלישי, צינוריות מלפיגי, מעיกลาง, בלוטת הרוק ושריר.לבסוף, מוצגות תמונות מייצגות משחלה של בוגר ומאשכים של בוגר. לאחר רכישת מיומנות ובמידה והתהליך מבוצע ביעילות, ניתן לבצע טכניקה זו ביומיים בלבד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד על משטח עבודה נקי מ-RNase, להשתמש בקצות טיפים, מבחנות, פלטות ותמיסות נקיים מ-RNase ולעבוד עם כפפות.אם אתם עובדים עם מספר רב של דגימות או גששים, אל תמהרו בביצוע הפרוצדורה. כמו כן, מומלץ להמציא שיטות עזר כדי שלא תשכחו באיזה שלב אתם נמצאים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לשלב אותה עם שיטות אחרות, כגון זיהוי של מספר גששים, גששים עם חלבונים או סמנים תאיים.בעזרתם תוכלו לענות על שאלות נוספות, כגון דפוסי ביטוי יחסיים, זהויות של תאים ומדורים תת-תאיים, והשפעות ברקעים גנטיים שונים או במחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הביצוע של רוב סוגי ההיברידיזציה in situ בכל סוג של רקמה או עובר. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים כגון formaldehyde, hydrogen peroxide ו-formamide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון טיפול וסילוק נאותים, בעת ביצוע הפרוטוקול.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

Drosophila oogenesis ממשיכה להיות שימושית במיוחד בחקר התפשטות מיטוכונדריאלית ותורשה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט המשמש לתיוג ה-DNA המיטוכונדריאלי המשכפל (mtDNA) בשחלות בוגרות של דרוזופילה עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המאפשר לחשוף מנגנונים הקשורים לתורשה מיטוכונדריאלית שהיו שנויים במחלוקת בעבר.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

למד זיהוי RNA ברזולוציה גבוהה בעוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברת אות טיראמיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפוצה מרחבית של RNA בעלות נמוכה וביעילות גבוהה.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

גלה סרטונים נוספים