אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה
2 באוקטובר 2017
פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.
המטרה הכוללת של הליך זה היא אפיון ביוכימי ומבני של חלבון קושר מצע פחמימות מסטרפטוקוקוס פנאומוניה. שיטה זו יכולה לסייע במתן נתוני מפתח כדי לסייע במחקרי הדרכה של חלבון קושר מצע כגון זיהוי פרופילי יציבות החיץ, מצבי אוליגומריזציה ומבנים אטומיים. היתרונות של הליך זה הם בכך שהוא מספק נתונים שיכולים להגדיל את שיעור ההצלחה של התגבשות ובניית פתרון לחלבוני קשירת מצע בצורה חזקה ופשוטה.
ראשית, הכינו 48 תמיסות חיץ עם טווח pH של 4.0 עד 9.5, וריכוזי נתרן כלורי הנעים בין אפס ל-0.5 מולר. מחלקים 40 מיקרוליטר מכל תמיסה לצלחת של 96 בארות. השג תמיסה מטוהרת של חלבון קשירת המצע הנבחר.
הוסף חמישה מיקרוליטר של תמיסת SBP לכל באר לריכוז של מיליגרם עד שניים למיליליטר. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של כתם פלואורסצנטי מרוכז פי 20 לכל באר. מערבבים את התמיסות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
אטום את הצלחת בסרט דבק שקוף. צנטריפוגה את הצלחת ב -112 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הגדר מערכת PCR בזמן אמת להגביר מארבע ל-99 מעלות צלזיוס בקצב של שלוש מעלות לדקה עם זמן המתנה של 10 שניות.
הגדר את המערכת לבצע קריאות פלואורסצנטיות כל חצי מעלות. הגדר את הגדרת מסנן הקרינה. ולהקצות את הדגימות.
הפעל את הניסוי וזהה את מצב החיץ עם טמפרטורת ההיתוך הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הכינו חיץ עם ריכוז ה-pH והנתרן הכלורי הנבחר הכולל 2.5% בנפח גליצרול וריכוז TCEP של 0.5 מילי-מולר. אפיין את ה-SBP המטוהר עם כרומטוגרפיה אנליטית עם פיזור אור רב זוויות.
זהה את המינים היציבים ביותר המתאימים להתגבשות, והשתמש ב-SEC מכין כדי להשיג שברים טהורים של מינים אלה. בצע בדיקות טרום התגבשות כדי לקבוע את ריכוז החלבון האופטימלי להתגבשות. השתמש במערכת רובוטית התגבשות כדי להוציא את פתרונות ההתגבשות המסחריים הרצויים למאגרי התמיסה של צלחת טיפה אופטית עם 96 בארות.
לאחר מכן השתמש במערכת כדי להוציא 100 ננוליטר מתמיסת החלבון לכל טיפת התגבשות היטב. העבר 100 ננוליטר מכל תמיסת התגבשות מבארות המאגר לטיפות הבאר המתאימות. אטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי.
השתמש במיקרוסקופ או במערכת הדמיה אוטומטית כדי להעריך את היווצרות הגביש וצמיחתו כל יום עד יומיים במשך שבועיים, ופעם בשבוע לאחר מכן. כאשר נוצרו גבישים גדולים ומעוצבים מספיק, הכינו אצווה של תמיסת ההתגבשות עם 25% נוספים בנפח גליצרול כדי לשמש כחומר קריאופרוטקט. לאחר מכן, מלאו דיואר קצף בחנקן נוזלי.
טבלו מארז דגימת unipuck בחנקן הנוזלי ואפשרו למארז להתקרר. לאחר מכן גזרו את הסרט על טיפה המכילה גביש מעניין. הפקידו 0.5 מיקרוליטר של חומר ההגנה על מגלשת כיסוי קרוב לטיפה או בתא הטיפה הריק באותו מצב אם זמין.
חבר לשרביט מגנטי קריולופ המותקן על בסיס סטנדרטי SPINE. השתמש ב-cryoloop כדי להעביר את הגביש המעניין לטיפה של cryoprotectant. לאחר מכן השתמש ב-cryoloop כדי להעביר את הגביש מה-cryoprotectant למצב הריק הראשון של מארז הדגימה השקוע.
חזור על תהליך זה כדי לקצור גבישים נוספים. לאחר שכל הגבישים המעניינים הועמסו לתוך מארז הדגימה, השתמש בשרביט הדיסקית כדי להניח את לוחית הבסיס של החד-פאק על המארז. העבר את היוניפאק בחנקן נוזלי לקו האלומה.
השתמש במלקחיים קריו ובכלי טעינת דיסקית כדי לטעון את היוניפאק לתוך מחליף הדגימה של קו האלומה ולנתק את מארז הדגימה. לאחר מכן בחר את הדגימה בתוכנת קו האלומה כדי לטעון ולמרכז אוטומטית את הדגימה בקרן הרנטגן. רכוש ספקטרום פלואורסצנטי של קרני רנטגן וזהה את כל האלמנטים שניתן להשתמש בהם בניסוי עקיפה חריגה.
קבע את אורך הגל האופטימלי לאיסוף נתוני עקיפה חריגים על ידי ביצוע סריקת אנרגיית קצה ספיגת קרני רנטגן. לאחר מכן רכוש שלוש דפוסי עקיפה של קרני רנטגן במרווחים של 45 מעלות במצב תנודה סטנדרטי כדי לקבוע אוטומטית את הפרמטרים של תא יחידת הגביש, הסימטריה וגבול העקיפה. ייבא את פרמטרי איסוף הנתונים המומלצים לתוכנת קו האלומה והפעל ניסוי עקיפה חריגה באורך גל יחיד או רב אורכי גל לפי הצורך.
היציבות של חלבון קושר המצע SP0092 במאגרי מלח שונים הוערכה כדי לזהות את תמיסת החיץ האופטימלית. טמפרטורות ההיתוך הגבוהות ביותר נמצאו עבור חוצצים עם pH של 6.5 וריכוזי נתרן כלורי הנעים בין אפס ל-0.2 מולר. להליך נבחר בופר עם pH של 6.5 וריכוז נתרן כלורי של 0.2 מולארי.
מצבי האוליגומריזציה השונים של SP0092 זוהו והופרדו עם SEC-MALS. ניתוח של פרופיל ה-SEC בריכוזי חלבון שונים הצביע על כך שריכוז חלבון מוגבר מעורר אוליגומריזציה, מה שמצביע על כך שאוליגומרים גדולים יותר יציבים יותר בריכוזים גבוהים. בהתאם לכך, האוליגומרים הגדולים ייצרו גבישים בניסויי התגבשות, בעוד שהמונומר לא.
פלואורסצנציה של קרני רנטגן של גבישי SP0092 מקוריים וסלנומתיונין הצביעה על אבץ הקשור לחלבון בשתי הצורות. האות החריג הוגבר על ידי כוונון אורך הגל של קרני הרנטגן לקצוות ספיגת קרני הרנטגן של אבץ או סלניום. לאחר מכן הושג מערך נתונים חריג שלם, וניתוח אוטומטי המופעל על ידי נוכחות של אות חריג יצר מפות ראשוניות של מבני החלבון.
מודלים שנבנו במפות הראשוניות הללו שוכללו ואומתו כדי לייצר את המודלים הסופיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשלים אפיון מבני מקיף של חלבון קושר סובסטרט או של כל יעד חלבון פוטנציאלי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח טיפולים חדשים למחלות מירוקוקליות, מכיוון שהיא מספקת תובנות בסיסיות לתכנון מבוסס מבנה של מעכבים לסוג זה של חלבונים.
ניתן ליישם שיטות אלה גם על חלבונים קושרי מצע מאורגניזמים אחרים, וניתן להשתמש בהן עבור כל סוג חלבון.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול פשוט לקביעת מאפיינים ביוכימיים ומבניים של חלבון קישור מצע פחמימתי מ-Streptococcus pneumoniae. השיטה נועדה לספק נתונים מרכזיים למחקרים על חלבוני קישור מצע, ולהגדיל את הצלחת הגבישה ופתרון המבנה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
- אפיון חלבונים
רקע
- חלבוני קישור מצע פחמימתי ממלאים תפקידים קריטיים במטבוליזם של חיידקים.
- הבנת המבנה שלהם יכולה לסייע בתכנון תרופות והתערבויות טיפוליות.
- שיטות אפיון חיוניות לקביעת תנאי היציבות והגבישה.
- מחקר זה מתמקד בחלבון מסוים, SP0092, מ-Streptococcus pneumoniae.
מטרת המחקר
- לתאר את התכונות הביוכימיות של SP0092.
- לזהות תנאי מאגר אופטימליים ליציבות והגבישה.
- להעריך מצבי אוליגומריזציה ואת השפעתם על הגבישה.
שיטות ששימשו
- הכנת פתרונות מאגר עם pH ורכזות מלח משתנות.
- מבחני יציבות מבוססי פלואורסצנציה לקביעת טמפרטורות התכה.
- כרומטוגרפיה בדרך הדרת גודל עם פיזור אור מרובה זוויות (SEC-MALS) לניתוח אוליגומריזציה.
- קריסטלוגרפיה באמצעות קרני X לקביעת המבנה של גבישי החלבון.
תוצאות עיקריות
- זוהו תנאי מאגר אופטימליים עם pH של 6.5 ורכזות נתרן כלוריד של 0.2 מולר.
- ריכוז חלבון מוגבר הוביל לאוליגומריזציה, והגדיל את הצלחת הגבישה.
- פלואורסצנציה בקרני X הצביעה על קישור אבץ בגבישי SP0092 טבעיים ובגבישים המסומנים בסלנומתיונין.
- ניתוח אוטומטי של נתוני עקיפה סיפק מפות מבנה חלבון ראשוניות.
מסקנות
- המחקר מתאר בהצלחה פרוטוקול לתיאור SP0092.
- זיהוי תנאים אופטימליים יכול לשפר משמעותית את תוצאות הגבישה.
- הממצאים תורמים להבנה טובה יותר של חלבוני קישור מצע בחיידקים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables structure-based design of inhibitors targeting carbohydrate substrate binding proteins in Streptococcus pneumoniae, a priority for antimicrobial and vaccine development against resistant strains. By establishing optimal buffer conditions and characterizing oligomerization states, the method de-risks early-stage target validation and supports predictive confidence in downstream inhibitor screening. The approach provides a reusable framework for evaluating extracellular proteins central to pathogen metabolism, informing portfolio prioritization in antibacterial discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining buffer stability profiles and oligomerization states critical for target engagement.
- Operational Value: Provides quantitative thermal shift and SEC-MALS data to assess target homogeneity and reduce false positives in assay development.
- Predictive Value: Identifies conditions favoring crystallization-competent oligomers, increasing success rates for structure-guided inhibitor design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, homogeneous protein preparations suitable for biochemical and biophysical assay formats.
- Operational Value: Establishes standardized buffer conditions (pH 6.5, 0.2 M NaCl) ensuring reproducibility across screening campaigns.
- Scalability Value: Uses robotic crystallization and SEC-MALS platforms adaptable to medium-throughput target characterization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links structural insights to pneumococcal carbohydrate import pathways, supporting mechanism-based inhibitor design.
- Preclinical Value: Enables evaluation of inhibitor binding to zinc-bound SP0092 structures, informing selectivity and resistance profiling.
- Continuity Value: Provides a transferable method for characterizing homologous SBPs across bacterial strains, supporting broad-spectrum target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, progressing from target validation through structural characterization to enable lead identification efforts for antimicrobial programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via biochemical profiling of substrate binding and oligomerization states under physiologically relevant conditions.
- Screening: Delivers assay-ready protein samples with defined stability and monodispersity for reliable compound screening.
- Analytics: Provides SEC-MALS oligomerization data and thermal shift metrics to compare protein states and buffer effects.
- Translational Research: Connects structural data to carbohydrate transport mechanisms, informing target validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for SBP characterization applicable to multiple targets and pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validity by resolving atomic structures and ligand-binding sites.
- Operational Value: Enhances reproducibility through defined buffer conditions and automated crystallization tracking.
- Strategic Value: Reduces attrition risk by enabling early go/no-go decisions based on structural druggability assessments.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with validated structural tractability and metabolic relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, thermal shift assays, and SEC-MALS operation.
- Dependent on access to size-exclusion chromatography, multi-angle light scattering, and synchrotron beamline facilities.
- Necessitates cross-team standardization of buffer formulations and protein concentration ranges.
- Involves adaptation considerations for different SBP subclasses and oligomerization tendencies.
- Limited by the need for crystallization-competent protein states, which may require extensive condition screening.
