Name: אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: חקור את האפיון הביוכימי והמבני של חלבון SP0092 מ-Streptococcus pneumoniae. השיטה משתמשת בבדיקות יציבות פלואורסצנטיות, SEC-MALS וקריסטלוגרפיית קרני X לזיהוי תנאי חיץ אופטימליים להגברת הצלחת ההתגבשות והבנת מבנה החלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו להכיר OPPF-UK לסיוע בשיבוט, ג'מה האריס שניה-קניונים, המדענים של beamlines I03, I04 במקור אור יהלום.

הערה: רצף קידוד אשר נמחק את פפטיד אות שוכפל ב וקטור pOPINF בעקבות פרוטוקול תקני ב- fusion; החלבון יליד מבוטאת פיוז'ן שלו-תג בתאים Escherichia coli BL21 רוזטה 28 , 29. selenomethionine עם התווית variant מתבטא בעקבות בשיטות הרגילות על-פי יצרן 30. רקומביננטי SBP מטוהר כאמור תיאר 31 , 32-
 1. איפיון ביוכימי <ol><li>תרמית להעביר assay <ol><li>48 להכין מאגר פתרונות עם pH החל מ- 4.0 9.5 וריכוז NaCl בין 0 ל- 0.5 M, לוותר על 40 µL בצלחת 96-ובכן כפי שמתואר טבלה 1 33.</li> <li>להוסיף לכל µL 5 טוב של הפתרון SBP-ריכוז 1-2 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>להוסיף לכל µL 5 טוב של 20 x הכתם פלורסנט חלבונים (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לערבב את הפתרונות על ידי pipetting, לאטום את הצלחת באמצעות סרט דביק שקוף וספין למשך 2 דקות ב g x 112 בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפעיל את הניסוי על מכונת אמת: הגדר רמפה בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס/דקה 4 99 ° C עם זמן המתנה s 10 ולאחר לקרוא את קרינה פלואורסצנטית כל 0.5 ° C עם עירור ב 483 nm, פליטה-568 nm.</li>
		<li>לנתח את עקומות פליטת קרינה פלואורסצנטית עבור כל תנאי מאגר, זיהוי את טמפרטורת ההיתוך (T m) המינימום של הנגזרת. 
		הערה: הליך זה נותן סימן טוב של הפתרון מאגר הטוב ביותר כדי לסייע לשיפור היציבות חלבון. בחר את טווח pH ריכוז המלחים המבוסס על תנאי מאגר עם ה-T הגבוהה מ' ולהוסיף 2.5% (v/v) גליצרול ו 0.5 מ מ של tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) כדי להגדיר את בופר עבור השלבים הבאים (שניה-מאגר).</li>
	</ol></li> <li>MALS ושל שניה אנליטית <ol><li>לבצע שטיפה כרך שני טורים של העמודה סינון מראש ארז ג'ל עם מים מסוננים degassed (שימוש מגוון רחב משקל מולקולרי 24 mL עמודה).</li>
		<li>להתחבר העמודה הגלאי פיזור אור, equilibrate את העמודה עם המאגר שניה נחוש מ וזמינותו shift תרמי.</li>
		<li>µL להזריק 100 של SBP מטוהרים-5 מ"ג/מ"ל לתוך equilibrated שניה טור וזרימה עמודה אחת נפח שניה-buffer-</li>
		<li>לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות, לבדוק את נתוני הפיזור באמצעות התוכנה ניתוח, קבלת המסה טוחנת מדד polydispersity עבור כל המינים. 
		הערה: עבור כל שיא המתאימים זן oligomeric, זה מועיל לבדוק את polydispersity אינדקס מחושבת המסה טוחנת משוקלל על מסה מסת/טוחנת משוקלל על מספר מולקולות (Mw/Mn). ערך polydispersity קרוב ל- 1 מציין לשיא monodispersed. 
		הערה: לאחר כל המינים oligomerization מוגדרים, כן הוא שימושי ללמוד תלותם ריכוז חלבון, כמו ריכוז גבוה עשוי להעדיף היווצרות אוליגומר גדול יותר.</li>
		<li>להורג מספר הרצפים שניה אנליטי; להזריק 100 µL של SBP מטוהרים-ריכוז (0.1 - 10 מ"ג/מ"ל) לתוך העמודה סינון ג'ל equilibrated (שימוש עמודה 5 mL מגוון רחב משקל מולקולרי), לזרום אחסון אחד עמודה שניה-מאגר בכל פעם.</li>
		<li>לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות ולנתח את עוצמות ספיגת ב 280 nm של עקומות המתאים ריכוזים שונים של חלבון המוצא. אם עוצמות היחסי של הפסגות שונים נשארת קבועה, ללא המרה בין בין המינים oligomeric קיים. וריאציה של עוצמות היחסי בריכוזים שונים הן סימן interconversion בין מינים שונים oligomeric התלויים ריכוז חלבון. 
		הערה: שלב אפיון זה היסוד להגדיר אילו זנים מתאימים יותר עבור התגבשות. אכן, מינים נפרדים monodispersed הם נוטים להתגבש אם הם במצב oligomeric יציב-ריכוז מוגדרים.</li>
	</ol></li></ol> 2. התגבשות והכנה של חלבון <ol><li>מפוח שניה <ol><li>לאחר אמצעי אחסון עמודה אחת לשטוף עם מים מסוננים degassed, equilibrate עם שניה-buffer העמודה סינון ג'ל מראש ארז מפוח (מגוון רחב מולקולרית משקל 120 מ ל עמודה).</li>
		<li>להזריק 1-5 מ של SBP מטוהרים ב 5-50 מ"ג/מ"ל לתוך ג'ל equilibrated סינון העמודה ואת זרימת עמודה אחת נפח שניה-buffer-</li>
		<li>לאסוף את העמודה הזרימה דרך 1 מ"ל שברים.</li>
		<li>מאגר שברים המקביל לשיא monodisperse יחיד; ספין המדגם מסננים צנטריפוגה 15 מ"ל ב 1,500 g ולכמת את הריכוז עד הריכוז הרצויה מושגת (בדרך כלל 50-100 mg/mL עבור SP0092).</li>
	</ol></li> <li>התגבשות <ol><li>לקבוע טווח ריכוז אופטימלי עבור הניסוי התגבשות באמצעות בדיקה טרום התגבשות של כפי שתואר על ידי היצרן: <ol><li>Dispense 0.5 - 1.0 מ"ל של כל אחד של המבחן התגבשות ארבע פתרונות מאגר שונים של 24-ובכן יושב זרוק התגבשות צלחת-</li>
			<li>להכין את הטיפות התגבשות על ידי ערבוב 1 µL של חלבון פתרון עם 1 µL של המאגר פתרון לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לא פחות מ 1 h (תוצאות אמינות יותר מתקבלים לאחר לילה הדגירה).</li>
			<li>לבדוק את האיכות טיפה כל הריכוז באמצעות מיקרוסקופ הגדלה 10 x- 
			הערה: בדיקת ריכוז חלבונים שונים לפחות שלושה: (I) רוב הטיפות שנותרו ברור עולה כי החלבון הוא גם שתדללו על התגבשות; (II) הנוכחות של התמיסה כבד ברוב המכריע של הטיפות מרמז על ריכוז גבוה יתר על המידה; ו- (III) מאוזנת מופע של טיפות ברור והן התמיסה (עדיף אם קל) היא אינדיקציה טובה כי ריכוז שנבדקו היא חיובית על התגבשות.</li>
		</ol></li> <li>להכין המסירה ישיבה 96-ובכן התגבשות צלחות; לוותר על µL 100 של התגבשות מסחרי אחר פתרון כל מאגר טוב 34 , 35 , 36 , 37.</li> <li>100 מדבקות/ברקודים nL חלבון מדגם-ריכוז שהוגדרו בעבר (שלב 1.1.6) בכל התגבשות טיפה הבארות באמצעות מערכת רובוטית התגבשות.</li>
		פתרונות <li>nL 100 מדבקות/ברקודים של המאגר שונה המתאים התגבשויות ירידה בארות לערבב עם חלבון בגליל בשלב 2.2.3. לאטום את הצלחת התגבשות כדי למנוע אידוי ולאפשר את equilibration הירידה התגבשות עם המאגר.</li>
		<li>לבדוק את הטיפות מעת לעת (בתחילה כל 1-2 ימים, לאחר מכן כל שבוע) באמצעות סימן x 10 (לפחות) הגדלה במיקרוסקופ כדי להעריך את קריסטל ההיווצרות והגידול. 
		הערה: מערכת הדמיה אוטומטית התגבשות חלבון יכול לשמש עבור טיפות ויזואליזציה ולכידה.</li>
	</ol></li></ol> 3. איסוף נתונים רנטגן ואפיון קריסטל <ol><li>קריסטל הרכבה <ol><li>להכין את הפתרון cryoprotectant על-ידי הוספת 25% (v/v) גליצרול (ריכוז סופי) לתנאי התגבשות (וכך להחליף 25% מים הראשונית תערובת) 38.</li>
		<li>מלא קצף דיואר עם חנקן נוזלי והמקום החלק מארז מדגם של uni-דיסקוס לתוך דיואר. לאפשר לה להתקרר לטמפרטורת חנקן נוזלי.</li>
		<li>לחתוך ולהסיר אטימה קלטת מהצלחת התגבשות על הירידה שבו נוצרים הקריסטלים.</li>
		<li>מקום ירידה של 1 µL של פתרון cryoprotectant אל coverslide ממוקם בסמיכות הירידה היעד.</li>
		<li>להעביר את הקריסטל שנבחר מהמסירה המקורי לירידה cryoprotectant פתרון באמצעות הקפאה-לולאת ניילון על בסיס סטנדרטית השדרה רכוב על 39 , מטה מגנטי 40.</li>
		<li>העבר במהירות את הקריסטל מהמסירה cryoprotectant חנקן נוזלי, הצבת הלולאה אל המיקום הריק הראשון של בעל מדגם uni-פאק.</li>
		<li>חוזר (מתוך השלב לחתוך סרט איטום) עד כל הקריסטלים הרצויים נמצאים שנקטפו ומאוחסנים בעל מדגם uni-פאק.</li>
		<li>המקום uni-הדיסקוס לבסס על הדיסקית uni באמצעות מטה הדסקית ולקחת את הדיסקית הפרעות לקרן החלקיקים (בתנאים חנקן נוזלי). 
		התראה: מאוד נמוכה טמפרטורת!</li>
		<li>המלקחיים הקפאה ולהשתמש הדיסקית דיואר כלי הטעינה לטעון והאיגוד-puck(s) לתוך הרובוט מחלף מדגם הפרעות לקרן החלקיקים דיואר. בעל מדגם uni-פאק הם ינותקו מן המכסה הבסיס עוזב את בעלי לולאה דגימה זקוף ב הרובוט מדגם דיואר, ולכן חשופים החנקן הנוזלי ונגיש לרובוט מחלף דגימת.</li>
	</ol></li> <li>קריסטל אפיון הערה: אז יכול להיות מוקרן הקריסטלים שנקטפו לאיכות עקיפה באמצעות גם מקור רנטגן מעבדה או מקור רנטגן סינכרוטרון קרינה (SR). Beamlines macromolecular קריסטלוגרפיה (MX) מספקים מקור אנרגיה tunable לנצל עקיפה חריגה מבנה הפתרון. בסעיף הבא, סדרת הוראות עבודה בקו אחד עם היכולות ניסיוני של יהלום אור מקור MX beamlines מוצע, אבל קווים מנחים אלה ניתן גם להתאים beamlines MX-synchrotrons אחרים ברחבי העולם.
	<ol><li>כשלב ראשון, זה שימושי לאשר או לזהות חריגות scatterers בגביש. זה תושג בנוחות על ידי מדידת ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן של הגביש. תחילה ודא אנרגית הרנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שוכן גבוה מספיק כדי לעורר כל האלמנטים בדרך כלל צפוי עבור גבישים macromolecular (14 קוו ומעלה).</li>
		<li>להשתמש בתוכנה שליטה הפרעות לקרן החלקיקים כדי לבחור את הדגימה כדי להיות מותקן על ידי הרובוט מחלף מדגם; הלולאה ימורכז אוטומטית בקרן רנטגן, מרכוז קריסטל יכול להיות מאושרות באופן ידני באמצעות תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים.</li>
		<li>שיא של ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שליטה בתוכנות: המשתמש בוחר את זמן החשיפה של ויוזמת המדידה (הגדרה ספקטרום קרינה פלואורסצנטית/פלורסצנטיות, &#8594; לרוץ, איור 2A). תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים עמדות באופן אוטומטי את תצלום הרנטגן גלאי קרינה פלואורסצנטית ב מקום וקובע את האירוע המינימלי רנטגן השטף כדי לקבל אות הניתן לקריאה על גלאי קרינה פלואורסצנטית. הקשת רכשה ואז ניתוח באופן אוטומטי עם פסגות פליטה מותאם באופן טבעי רכיבים ביולוגיים. רוטינות אלה הינם זמינים במרחק הפרעות לקרן החלקיקים שליטה תוכנה ממשק משתמש גרפי (GUI) - GDA (www.opengda.org) על החברה שלנו ועל synchrotrons ברחבי אירופה 41 , 42.</li>
		<li>אם אלמנטים מתאימים מזוהים זה אפשר לנצל בשביל ניסוי עקיפה חריגה, לבצע בסריקה אנרגיה קצה של ספיגת רנטגן כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי עבור איסוף נתונים עקיפה חריגה מן הגביש: על הפרעות לקרן החלקיקים לשלוט תוכנה, בחר את הרכיב, ליזום את הסריקה (זריחה/זריחה לסרוק הגדרה, &#8594; שם אטום, &#8594; לרוץ, איור 2B). 
		הערה: עבור ניסוי עקיפה חריג יחיד, הפסגה של הקצה הקליטה משמש כדי להגדיל את הפיזור חריגה. ניסיוני שיקולים לביצוע ניסוי עקיפה חריגה גל רב היה בעבר מפורט 43.</li>
		<li>כדי לקבוע את קריסטל יחידת התא בפרמטרים, סימטריה, מגבלת עקיפה, למדוד שלושה דפוסי קרני רנטגן במרווחי 45° בשיטת תנודה (אוסף נתונים/הקרנה &#8594; לרוץ הנוכחי, איור 2C). הפרעות לקרן החלקיקים בקרת התוכנה מספקת למשתמש בחירה של זווית תנודה זמן החשיפה, ואת היכולת להגדיר את השידור אחוז של קרן רנטגן. עבור הקרנה רגיל קריסטל, זווית תנודה של 0.5°, מועד החשיפה של 0.5 s, ו- 5% רנטגן קרן שידור מומלצים. תמונות דיפרקציה נמדד מנותחים באופן אוטומטי על-ידי הצבר עדנה ולחזור ערכה של אסטרטגיות עבור אוסף של נתונים מקיפה 22.</li>
	</ol></li> <li>רנטגן איסוף נתונים הערה: המשתמש יכול לבחור כדי לאסוף נתונים במצב תנודה רגיל או במצב קרן הפוך, המאפשרת פרידל החברים שיירשמו קרוב פעם והמנה רנטגן, ועם כ ההתנהגות הקליטה זהה המאפשר מדידה מדויקת יותר של הבדלים חריגה. האחרון הוא שימושי במיוחד אם צפויים הבדלים קטנים חריגה ו/או הדוגמאות הן קרינה רגיש בעת ביצוע ניסוי עקיפה חריגה. שיקולים על האסטרטגיות אוסף הנתונים הטוב ביותר לשימוש כבר באופן מקיף שנסקרה 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. <ol><li>באמצעות תוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים, לייבא את הפרמטרים אוסף נתונים כפי שהוצע על-ידי התוכנית אסטרטגיה אשר תספק: א מיקום התחלתי של הציר ω-סיבוב ii. רוחב תנודה ω-ציר הסיבוב זווית עבור כל תמונה עקיפה iii. זמן החשיפה עבור כל תמונה עקיפה הרביעי. מספר תמונות עבור dataset מלאה (הגדרת בעקיפין את זווית הסיבוב של ציר ω הכולל עבור אוסף הנתונים כולה) נ' אחוז הנחתה של קרן רנטגן כדי למנוע נזק חשיפת יתר וקרינה הערה: במוסד שלנו, עבור פועל על איסוף המידע, הצינורות תוכנה לעיבוד אוטומטי של הנתונים שנאספו מבוססים היטב: (i) עקיפה נתונים מופחתים (אינדקס משולב, שקנה המידה שלה השתנה) על-ידי הצבר xia2, אשר יוצרת קבצים mtz השתקפות של המשתמש כקלט עבור פתרון/עידון בהדרגה ומבנה 48. (ii) כאשר אות חריגה משמעותית ומתגלה במהלך ניתוח נתונים, הראשון מבנה אוטומטית מהירה פתרון צינור (fast_ep) באמצעות SHELX מנסה לפתור את המבנה התחתי אטום כבד על ידי ניסיוני בהדרגה, מתן מפת צפיפות אלקטרונים מדורג איפה ריאלי. צינור השני מבנה מקיף יותר פתרון מתחייב באופן אוטומטי ניסיונות לפתור ולבנות את structure באמצעות תוכנה עצמאיים סוויטות 49 , 50 , 51 , 52; במקרים בהם זה מוצלח, המשתמש תסופק עם מפת צפיפות הראשונית של מודל, אלקטרונים. זה מספק את הבסיס עבור המשתמש להשלים עידון ולאימות הדגם עם הסוויטות התוכנה לחקר הגבישים של בחירה-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בנייר זה, אנו מתארים ולאמת פרוטוקול משולב פלואורסנציה פחמימות SBPs עם דגש ספציפי על חלבונים מ ס pneumoniaeהביוכימי ומבניים. עם זאת, ניתן להשתמש בתור תהליך סטנדרטי לניתוח של אחרים SBPs של אורגניזמים שונים, אפילו חלבונים מסיסים שאינם קשורים אחרים.
החלק הראשון של הפרוטוקול מתמקדת המספקים מידע ביוכימי על מבנה רבעוני, אשר אפשר לנצל כהכנה החלבון דוגמאות של התגבשות והיציבות של חלבון. במקטע מבחני shift תרמי, נתאר רק את ה-pH ווריאציות NaCl ריכוז כדי לשמור על האופי הכללי של הליך זה. למרות זאת, תנאים מאגר רבים אחרים יכול להיבדק באופן דומה, לדוגמה, כולל כל תרכובת כימית משמשים תוסף המייצב: בפרט ligand(s) בפועל זה לאגד SBP ספציפי עובדים בצורה ניכרת להגדיל את ה-Tm על ידי מעלות צלזיוס מספר31. במקרים מסוימים, עקומות denaturing ניתן להגדיר בצורה גרועה עקב אות נמוכה או רקע זריחה גבוהה, אשר נגרמת על ידי צבירת חלבון או התגלגלות חלקית. כדי למנוע זאת, ניתן לבצע טיטור חלבון: צבע כדי למטב את עקומות denaturing לא ברור. אם אין שיפור מתקבל, הקרנת תוספים שונים יכולים לשפר את היציבות של החלבון מומלץ, מסכי מתאים היה שתואר לעיל54.
בדרך כלל, רוב SBPs monomeric בסביבתם הטבעית, אך כפי שמוצג כאן multimerization יכול להתרחש בריכוזים גבוהים המשמשים התגבשות ניסויים, ובכך אפיון התנהגות oligomerization שסופקו על-ידי MALS ושל שניה זה חיוני כדי להעריך את המדינה oligomerization monodisperse יציב מאהדה ביותר עבור התגבשות עם זאת, קשה לחזות את השפעת כימיקלים שונים הכלולים במצב של התגבשות ההתנהגות oligomerization של החלבונים. אם בבדיקה שניה ו- MALS מציגה את מצבור נרחב של המדגם חלבון, היינו ממליצים הבאות כדי להפחית את הסבירות של התרחשות מעין זו: להשתמש במדגם חלבון טרי (לא להקפיא-הקרת) ולהרחיב את הניתוח מייצב לבצע תרמית מבחני shift, בדיקות תוספי אפשרי, דטרגנטים קלים כמוצא אחרון, כדי למזער את מצבור. בנייר זה, אנו מציגים הנחיות בסיסיות התגבשות באמצעות הקרנה מסחרית התגבשות מטריצה דלילה תפוקה גבוהה כדי לשמור על האופי הכללי של פרוטוקול זה. עם זאת, קבלת גבישי חלבונים ברזולוציה גבוהה רנטגן עקיפה ייתכן שיהיה עליך כוונון עדין האיטראטיבי לייעל את התנאים התגבשות ביחס ריכוז precipitant, pH, תוספת של תוספים כימיים, טמפרטורות שונות, ו גורמים אחרים המשתנים dynamics שיווי משקל בין קריסטל טיפה, מאגר16,17.
החלק השני של הפרוטוקול מתאר את האפיון של הקריסטלים חלבון על מנת להגדיר את האסטרטגיה האופטימלית עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן עם דגש ספציפי על רכישת נתונים חריגה עבור בהדרגה עצוב. גם אם SBPs לשמור על ארכיטקטורת כללי דומה (ישנם מבנים תלת-ממד הופקדו רבות שעשויות להיות שימושיות כמתחילה מודלים), בהדרגה החלבונים האלה בשיטת החלפת מולקולרית אינה תמיד פשוטה בגלל ההשתנות של רכיבי מבנה שניוני, הגמישות מהותי של חלבונים אלו. לפיכך, אנו מציעה שיטת עצוב, להדגיש כי חלבונים אלה עשויים כבר ממהותם אוחזים מתכות או איגוד אכן לא ספציפית של מתכות מן התנאים מאגר התגבשות, אשר יכול לספק מגוון רחב של רכיבים diffracting חריגה שלב רגיל בפרוטוקול הכללית שלנו.
לסיכום, פרוטוקול זה מגדיר זרימת עבודה מודרכת סטנדרטי של נהלים המאפשרים את תיאור מפורט של התכונות הביוכימי ומבניים של SBPs שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של נחישות המבנה, כמו גם להאיץ אפיון מבניים של SBPs באופן כללי.

ס pneumoniae (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיוביים המתגוררים asymptomatically את דרכי הנשימה העליונות של מערכת הנשימה האנושית עם היכולת להגר נישות סטרילי בדרך כלל גורם ספטיסמיה אלח-דם, דלקת ריאות, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח1,2. יתר על כן, זיהום pneumococcal הוא הגורם המוביל של דלקת ריאות שנרכשה בקהילה, אשר תורמת נטל קלינית וכלכלית ברחבי העולם3,4. זנים עמידים לאנטיביוטיקה של ס' pneumoniae התפשטו ברחבי העולם, למרות של שבע-עמודים ולנטיין ו 13-האהבה, בדיקת החלבון המצומד pneumococcal תרכיב חיסון סייעו להקטין את הקצב של עמידות מיקרוביאלית, החלפת זנים של השימוש בחיסון הופיעו, הובילו מוגברת למחקר לתוך לפיתוח טיפולים חדשים עבור המחלה pneumococcal5,6,7,8.
Pneumococcus תלוי סוכרים מיובאים מהמחשב המארח פחמן מקור9,10; אכן זה מקדיש שלושים אחוז שלה מכונות ייבוא להעברה של 32 פחמימות שונים11,12,13. יבואנים אלה כוללים ABC-מובילי לפחות שמונה13. ב- ABC מובילים, SBPs חוץ-תאית לשחק תפקיד מהותי בקביעת יחודיות עבור ליגנד והצגתו המשגר ממברנלי אינטגרלי עבור ספיגת בתא. SBPs מייצגים תקף מטרות על עיצוב האתר של חיסונים חדשים, antimicrobials כי הם פני שטח חלבונים ותפקידם חיוני תהליכים תאיים.
תיאור מפורט של תכונות מבניות, כמו כיסים ליגנד וגמישות עיבד, ואפיון של חלבונים היעד לספק כלי שימושי עבור תרופה המבוססת על מבנה עיצוב14,15. קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היא שיטת הבחירה אפיון מבניים של חלבונים-קרוב ברזולוציה אטומית, אך תהליך התגבשות הוא בלתי צפוי, גוזלת זמן, לא תמיד מוצלח. שיטות שיטתית השתפרו שיעור ההצלחה והם גורמים חשובים הדגימה איכות ויציבות. שיעור ההצלחה של התגבשות מושפעת חלבון הכימיות ומתודולוגיה הכנת המדגם. ההשפעה של אלה יכול להיות מוערך, הודיע על ידי איפיון ביוכימי16,17.
סיבוך נוסף לעיצוב מבוסס על מבנה הבעיה שלב לחקר הגבישים, אשר יש להתייחס. כמו מבנים חלבונים נוספים הפכו זמינים, מבנים רבים יכולים להיפתר על ידי שיטת החלפת מולקולרית, המחייב של מבנה הומולוגי18. כפי SBPs להציג מבנה תחום גמיש, החלפת מולקולרית יוכיח גם מאתגר19. אם מודל מבנית דומה מספיק חלבון המטרה אינה זמינה, מספר טכניקות ניתן להשיג את phasing ניסיוני20. בין אלה, שיטת הפיזור חריג יחיד באורך הגל (SAD) התפתחה הטכניקה העיקרית, נעשה שימוש נרחב כדי לפתור את הבעיה של שלב21. השימוש בשיטת עצוב כבר מתקדמים עוד יותר עם שיפורים בחומרה, תוכנה, כמו גם אסטרטגיות אוסף נתונים כדי לאפשר את איתור ושימוש של אותות כמשוגעת חלש עבור בהדרגה22,23, 24. יתר על כן, מקדמות שיטות ישירות עבור פתרון מבנים של מקרומולקולות, שבעבר נדרש עקיפה נתונים ברזולוציה אטומית, יכול עכשיו להיות מנוצל על ידי שילוב הידע סטריאוכימיים לדוגמה, כפי ליישם את התוכנית ARCIMOLDO25. סקירה שימושית של שיטות לפתרון בעיית הפאזה ב קריסטלוגרפיה ניתנת על ידי טיילור26.
כאן אנו מציגים פרוטוקול rationalized עבור אפיון התעבורה פחמימות SBP, SP0092 של ס' pneumoniae, שילוב טכניקות הביוכימי ומבניים (איור 1). פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק מקרה מבחן דוגמא שימושית של אסטרטגיות כדי לשפר את שיעור ההצלחה של מחקרים מבניים על SBPs באופן כללי, אשר נמצאות כל הממלכות של החיים. בפרט, הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של אפיון המדינה היציבה ביותר oligomeric של החלבון בתמיסה בשיטת מהיר ויעיל, ומאפשרת זיהוי המין הטוב ביותר לעקוב אחר לניסויים התגבשות. למרות שיש מעל 500 מבנים SBP דיווח של בנק מידע החלבונים27, החלפת מולקולרית עשויה להיות מאתגרת בשל אופיו גמיש הטבועה של שתי α/β קבוצות המחשבים, אשר מחוברים באמצעות אזור ציר19. לפיכך, החלק השני של הפרוטוקול מתאר שימוש בשיטת עצוב עבור בהדרגה ממאוגד יונים מתכתיים, אשר נפוץ ב SBPs, כמו גם שילוב של selenomethionine ושימוש של סלניום (Se) בהדרגה עצוב.

<table><tbody><tr><td>SelenoMethionine בינוני</td><td>מידות מולקולריות מלאות</td><td>MD12-500</td><td>מבוסס על מצע מינימלי M9 סינתטי בתוספת גלוקוז, ויטמינים וחומצות אמינו למעט L-מתיונין. מוצרים מקבילים אחרים זמינים מסחרית על ידי חברות אחרות.</td></tr><tr><td>MicroAmp אופטי 96 בארות צלחת</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>4306737</td><td>צלחת התגובה האופטית של Applied Biosystems MicroAmp 96 בארות עם ברקוד מותאמת כדי לספק דיוק טמפרטורה ואחידות ללא תחרות להגברת PCR מהירה ויעילה. צלחת זו, הבנויה מחתיכה קשיחה אחת של פוליפרופילן בפורמט של 96 בארות, תואמת ל-Applied Biosystems&reg; מערכות PCR בזמן אמת 96 בארות ומחזורים תרמיים.</td></tr><tr><td>בדיקות מולקולריות</td> <td>כתומות של SYPRO</td><td>S6651</td><td>SYPRO כתם ג'ל חלבון כתום הוא כתם פלורסנט רגיש ומוכן לשימוש לחלבונים בג'לים חד ממדיים. צבע חלבון אוניברסלי ומבוסס למדי לאזורים הידרופוביים.</td></tr><tr><td>סרט דבק אופטי MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>סרט הדבק האופטי MicroAmp של Applied Biosystems מפחית את הסיכוי לזיהום באר לבאר ואידוי דגימה כאשר הוא מוחל על מיקרו-פלטה. זה אידיאלי למדידה אופטית, מכיוון שהוא נותן רקע נמוך.</td></tr><tr><td>7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>מערכת ה-PCR המהירה בזמן אמת של Applied Biosystems 7500 מאפשרת רכיבה תרמית במהירות גבוהה בפורמט 96 בארות, ומפחיתה משמעותית את זמן הריצה שלך עבור יישומי PCR כמותיים בזמן אמת, ומספקת תוצאות תוך כ-30 דקות. ערכת השדרוג זמינה לשדרוג מערכת PCR סטנדרטית 7500 בזמן אמת לתצורה המהירה באמצעות התקנת שירות בשטח. ניתן להשתמש במכונת RT-PCR אחרת. ייצוא נתונים לא קל עבור תוכנת ניתוח הנתונים הישנה.</td></tr><tr><td>Superdex 200 להגדיל 10/300 GL עמודה</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL היא עמודה רב-תכליתית ארוזה מראש לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל בטיהור הכנה בקנה מידה קטן (מ"ג) וכן לאפיון וניתוח של חלבונים בעלי משקל מולקולרי בין 10,000 ל-600,000, כגון נוגדנים. הפרדה אופטימלית אידיאלית לטכניקות ביופיזיקליות ברזולוציה גבוהה.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>WYATT</td><td></td><td>DAWN HELEOS II הוא גלאי פיזור אור סטטי רב-זוויתי (MALS) המוביל לאפיון מוחלט של המסה המולרית והגודל של מקרומולקולות וננו-חלקיקים בתמיסה. ה-DAWN מציע את הרגישות הגבוהה ביותר, את הטווח הרחב ביותר של משקל מולקולרי, גודל וריכוז, ואת המבחר הגדול ביותר של תצורות ומודולים אופציונליים ליכולות משופרות. מערכות זיהוי MALS אחרות של חברות אחרות מלבד וויאט לא נבדקו, כך שלא ניתן לספק משוב נוסף.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td> 28906561-Superdex <td>200 הם עמודות כרומטוגרפיה בגודל ארוז מראש עבור הפרדות הכנה ואנליטיות ברזולוציה גבוהה בקנה מידה קטן של ביומולקולות. ל-Superdex 200 יש טווח הפרדה למולקולות בעלות משקל מולקולרי בין 10,000 ל-600,000. הפרדת השיא אינה אופטימלית כמו בגרסת ה"עלייה ", אך דגם זה אידיאלי לשימוש יומיומי סטנדרטי.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 דרגת הכנה הם עמודות XK ארוזות מראש המיועדות לכרומטוגרפיה של סינון ג'ל ברזולוציה גבוהה.</td></tr><tr><td>צלחת התגבשות טיפת ישיבה "גדולה" 24 באר</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>צלחת ההתגבשות "הגדולה" 24 באר משמשת בעיקר להקרנת גבישי חלבון על ידי טכניקות דיפוזיה של אדי טיפה בישיבה, ולאופטימיזציה של תנאי התגבשות. יש לו באר מאגר גדולה למדי ומיכל דגימה, המעדיפים טיפול ידני וגידול גבישי חלבון בגודל גדול. בנוסף, ניתן לאטום בקלות את המשטחים השטוחים שלו על ידי סרט שקוף או החלקות כיסוי.</td></tr><tr><td>מבחן טרום התגבשות PCT</td><td>המפטון</td><td>HR2-140</td><td>בדיקת טרום התגבשות PCT משמשת לקביעת ריכוז החלבון המתאים לבדיקת התגבשות.</td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>ללוחות באר מרובעים יש שלוש בארות התגבשות לכל מאגר, מה שמאפשר לבדוק 288 דגימות לכל צלחת. משמש בדרך כלל רק להקרנה הראשונית מכיוון שהקצה המרובע שלהם מקשה על דיג גבישים.</td></tr><tr><td>מידות מולקולריות</td> <td>של Uni-Puck</td><td>MD7-601</td><td>ה-V1-Puck האוניברסלי (Uni-puck) הוא מיכל אחסון ומשלוח סיכות לדוגמה לשימוש עם רוב מערכות הרכבת הדגימה האוטומטיות ברחבי העולם - כולל בין היתר את מערכות ACTOR, SAM ו-CATS (יהלום, סוליי, SPring-8, מפעל פוטון, CLSI וברחבי ארה"ב)</td></tr> <tr><td>מידות מולקולריות</td> <td>של קצף דיואר סטנדרטי</td><td>MD7-35</td><td>קוטר 5.7 אינץ' על עומק 2.8 אינץ'. קיבולת 800 מ"ל.</td></tr><tr><td>CryoLoop רכוב - 20 מיקרון</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>CryoLoops רכוב עם ניילון בקוטר 20 מיקרון. לולאות ניילון אלה מחוברות לצינורות חלולים, נירוסטה ומסחר; המשמשים להרכבה, הקפאה ואבטחת הגביש במהלך הליכים קריו-קריסטלוגרפיים ואיסוף נתוני רנטגן. קיימים גדלים שונים וניתן להתאים אותם לאורך. הם כלים מגוונים למדי.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>כלי טעינת פאק דיואר</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD7-607</td><td>כלי זה משמש להפרדת חד-פאקים כדי לטעון אותם לתוך הרובוט. הוא מורכב משני חלקים: חלק צינור טפלון וחלק מוט מתכת.</td></tr></tbody></table>

אפיון הביוכימי ומבניים של sp0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

פיתוח חדש antimicrobials חיסונים עבור pneumoniae סטרפטוקוקוס (pneumococcus) נחוצים לעצור את העלייה המהירה של זנים עמידים בפני מרובות. פחמימות המצע מחייב חלבונים (SBPs) מייצגים קיימא מטרות פיתוח חיסונים מבוססי חלבונים ו- antimicrobials חדש בגלל לוקליזציה חוץ-תאית שלהם ואת מרכזיותה של פחמימות ייבוא לחילוף החומרים pneumococcal, בהתאמה. המתוארים כאן הוא פרוטוקול משולב rationalized לבצע אפיון מקיף של SP0092, אשר ניתן להרחיב פחמימות אחרות, SBPs את pneumococcus, חיידקים אחרים. הליך זה יכול לסייע העיצוב מבוסס על מבנה של מעכבי עבור מחלקה זו של חלבונים. שהוצגו בחלק הראשון של כתב יד זה הפרוטוקולים עבור ניתוח הביוכימי לפי משמרת תרמי assay, ריבוי זווית פיזור אור (MALS), גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות), אשר למטב את היציבות, למזהים ייחודיים של הומוגניות של המדגם התגבשות ניסויים, וכך לשפר את ההסתברות להצלחה. החלק השני של הליך זה מתאר את האפיון של הקריסטלים SBP באמצעות של אורך גל tunable עקיפה חריגה סינכרוטרון הפרעות לקרן החלקיקים ופרוטוקולי אוסף נתונים עבור נתוני מדידה יכול לשמש כדי לפתור את החלבון מגובשת מבנה.

פרוטוקול משולב זה הוכח להיות מוצלח עם ארבעה (שניים לאור, שניים שלא פורסמו מבנים) של פחמימות 6 מחייב חלבון מטרות מן pneumococcus נותחו עד היום32,53. בחלק זה, אנו מציגים את אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 כתוצאה מכך נציג להנחות מחקרים מבנית של SBPs באופן כללי.
לאחר כבר הביע SP0092 SBP, מטוהרים כפי שהוגדר בעבר32, חלבון מטוהרים נותחו ליציבות מאגר שימוש assay shift תרמי: SP0092 תערוכות של מוגברת Tm ב- pH 6.5 ובפני NaCl 0 - 0.2 מ' טווח ריכוז (איור 3 א). לאור זאת, הפתרון מאגר עבור השלבים הבאים מוגדר כ: ז 0.02 נקודות MES pH 6.5, 0.2 מ' NaCl, 2.5% (v/v) גליצרול, 0.5 מ מ TCEP. המסה טוחנת מוחלטת של ארצות oligomerization שונים של SP0092 נמדדה על ידי MALS מצמידים שניה מדידת משקל מולקולרי של 187.2, 140.8, 97.0 49.4 kDa, המתאים tetrameric, trimeric, dimeric ו monomeric מינים, בהתאמה ( איור 3B). ניתוח הנתונים של הפרופיל שניה-חלבונים שונים דילולים גילה כי oligomerization המופעלת על-ידי ריכוז חלבון מוגברת, רומז כי oligomers גדולים יותר הם יציבים יותר בריכוזים גבוהים מאשר המשמש בדרך כלל התגבשות. אכן, המין oligomeric גדול מטוהרים למזהים ייחודיים של התגבשות ניסויים, חלבון המיוצר בהצלחה קריסטלים תוך מונומר של מינים לא.
הקריסטלים ממוטבת המתקבל הילידים, שכותרתו צורות של SP0092 Se-מתיונין התאפיינו קרני רנטגן. מדידה של פלואורסצנציה רנטגן של גבישים אלו חשף בשני המקרים פליטת פסגות עבור Zn המחויבות החלבון, בעוד Se זוהה רק עבור הקריסטלים Se-מתיונין כצפוי. מאוחר יותר, סריקות של הקליטה רנטגן בקצוות Se ו- Zn בוצעו, אשר סיפק מידע ניסויית ישירה לכוון את אורך הגל רנטגן התקרית לקצוות הקליטה רנטגן בהתאמה של Zn או Se נוכח הקריסטלים כדי למקסם את אות חריג השגה מתוך נתוני מערכת תוצאות (איור 4A–B).
לאחר מדידה שלוש תבניות עקיפה שידור נמוכה, ערכת נתונים חריגה מלאה הושג באמצעות איסוף נתונים האסטרטגיה שהוצעה על ידי עדנה (איור 4C). האות חריגה הנוכחי מעורר את הצינור phasing אוטומטיות-הפרעות לקרן החלקיקים לקבוע את מבנה תת, בהתבסס על שלבי הניסוי הראשוני נגזר, מפיק ראשי תיבות מפות ודגמים, אשר לאחר מכן ניתן מעודן לאמת (איור 4D ).
לסיכום, מוקשים פוטנציאליים של הטכניקה מרוכזים בעיקר על איכות וזמינות של קריסטל. אופטימיזציה של התנאים המאגר כדי לשפר את יציבות חלבון, כמו גם זיהוי של המדינה oligomeric המתאימים ביותר של החלבון לשימוש, כאשר אחד או יותר אוליגומר מזוהה בפתרון, יכולים להפחית את הסיכון של כשל ב התגבשויות שלב. ניצול השימוש מאוגד יונים מתכתיים לזהות בשלב מוקדם יכול להאיץ את מבנה הפתרון ולהימנע ייצור מיותרות של selenomethionine הנקרא חלבון כאשר שיטות מולקולרית החלפת נכשלים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
איור 1. תרשים של זרימת עבודה עבור איפיון ביוכימי ומבניים של פחמימות SBPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
באיור 2. אפיון קריסטל ב- GDA. צילום מסך של הכרטיסיה בקרת קרינה פלואורסצנטית רנטגן של תוכנת שליטה GDA הפרעות לקרן החלקיקים (A). צילום מסך של הכרטיסייה בקרת קצה-סריקה של אנרגיה קרני רנטגן ב- GDA (B). צילום מסך של הכרטיסיה ההקרנה קריסטל של אוסף נתונים ב- GDA (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
איור 3. איפיון ביוכימי של SP009239-491. (א) גרף תלת-ממד-פני התוויית את טמפרטורת ההיתוך של SP009239-491 כ פונקציה של רמת ה-pH וריכוז NaCl של הפתרון מאגר. תוצאות שניה (B) ו- MALS SP009239-491. הקליטה ב- 280 ננומטר מוצג בצבע כחול. ההמונים טוחנת של המדינות oligomerization שונים מוצגים באדום. לוח (B) שונה מ-32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
באיור 4. אפיון מבניים של SP009239-491. (א) (B) רנטגן ספיגת אנרגיה לסרוק בקצה Zn ו- Se עבור גבישים39-491 SP0092. קרינה פלואורסצנטית נמדד Zn, Se המכיל קריסטלים מוצג כחול, תכלת, האותיות המחושבים ' ו- f "פיזור חריגה שברים הם ירוק ואדום, בהתאמה. (ג) דוגמאות של קרני רנטגן דפוסי אסף מקריסטלים39-491 SP0092. (ד) קריקטורה ייצוג של מבנה דיימר39-491 SP0092. Protomer אחד בצבע אחר מגנטה (שאריות 39-366) ואת ויולט (שאריות 367-491), האטומים פיזור חריגה מוצגים כדורים כחולים, ציאן Zn, Se, בהתאמה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M חומצה ציטרית pH 4.0</td>
			<td>0.1 M חומצה ציטרית pH 4.5</td>
			<td>0.1 M פוספט pH 5.0</td>
			<td>0.1 M ציטראט pH 5.5</td>
			<td>0.1 M Bis-טריס pH 6</td>
			<td>0.1 מ' עדה pH 6.5</td>
			<td>0.1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0.1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0.1 M Imidazole pH 8.0</td>
			<td>0.1 M טריס pH 8.5</td>
			<td>0.1 pH צ'ז M 9</td>
			<td>0.1 M צ'ז pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 מ'</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
	

טבלה 1. מאגר הרכב עבור shift תרמי וזמינותו.

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא אפיון ביוכימי ומבני של חלבון קושר מצע פחמימות מסטרפטוקוקוס פנאומוניה. שיטה זו יכולה לסייע במתן נתוני מפתח כדי לסייע במחקרי הדרכה של חלבון קושר מצע כגון זיהוי פרופילי יציבות החיץ, מצבי אוליגומריזציה ומבנים אטומיים. היתרונות של הליך זה הם בכך שהוא מספק נתונים שיכולים להגדיל את שיעור ההצלחה של התגבשות ובניית פתרון לחלבוני קשירת מצע בצורה חזקה ופשוטה.ראשית, הכינו 48 תמיסות חיץ עם טווח pH של 4.0 עד 9.5, וריכוזי נתרן כלורי הנעים בין אפס ל-0.5 מולר. מחלקים 40 מיקרוליטר מכל תמיסה לצלחת של 96 בארות. השג תמיסה מטוהרת של חלבון קשירת המצע הנבחר.הוסף חמישה מיקרוליטר של תמיסת SBP לכל באר לריכוז של מיליגרם עד שניים למיליליטר. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של כתם פלואורסצנטי מרוכז פי 20 לכל באר. מערבבים את התמיסות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.אטום את הצלחת בסרט דבק שקוף. צנטריפוגה את הצלחת ב -112 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הגדר מערכת PCR בזמן אמת להגביר מארבע ל-99 מעלות צלזיוס בקצב של שלוש מעלות לדקה עם זמן המתנה של 10 שניות.הגדר את המערכת לבצע קריאות פלואורסצנטיות כל חצי מעלות. הגדר את הגדרת מסנן הקרינה. ולהקצות את הדגימות.הפעל את הניסוי וזהה את מצב החיץ עם טמפרטורת ההיתוך הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הכינו חיץ עם ריכוז ה-pH והנתרן הכלורי הנבחר הכולל 2.5% בנפח גליצרול וריכוז TCEP של 0.5 מילי-מולר. אפיין את ה-SBP המטוהר עם כרומטוגרפיה אנליטית עם פיזור אור רב זוויות.זהה את המינים היציבים ביותר המתאימים להתגבשות, והשתמש ב-SEC מכין כדי להשיג שברים טהורים של מינים אלה. בצע בדיקות טרום התגבשות כדי לקבוע את ריכוז החלבון האופטימלי להתגבשות. השתמש במערכת רובוטית התגבשות כדי להוציא את פתרונות ההתגבשות המסחריים הרצויים למאגרי התמיסה של צלחת טיפה אופטית עם 96 בארות.לאחר מכן השתמש במערכת כדי להוציא 100 ננוליטר מתמיסת החלבון לכל טיפת התגבשות היטב. העבר 100 ננוליטר מכל תמיסת התגבשות מבארות המאגר לטיפות הבאר המתאימות. אטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי.השתמש במיקרוסקופ או במערכת הדמיה אוטומטית כדי להעריך את היווצרות הגביש וצמיחתו כל יום עד יומיים במשך שבועיים, ופעם בשבוע לאחר מכן. כאשר נוצרו גבישים גדולים ומעוצבים מספיק, הכינו אצווה של תמיסת ההתגבשות עם 25% נוספים בנפח גליצרול כדי לשמש כחומר קריאופרוטקט. לאחר מכן, מלאו דיואר קצף בחנקן נוזלי.טבלו מארז דגימת unipuck בחנקן הנוזלי ואפשרו למארז להתקרר. לאחר מכן גזרו את הסרט על טיפה המכילה גביש מעניין. הפקידו 0.5 מיקרוליטר של חומר ההגנה על מגלשת כיסוי קרוב לטיפה או בתא הטיפה הריק באותו מצב אם זמין.חבר לשרביט מגנטי קריולופ המותקן על בסיס סטנדרטי SPINE. השתמש ב-cryoloop כדי להעביר את הגביש המעניין לטיפה של cryoprotectant. לאחר מכן השתמש ב-cryoloop כדי להעביר את הגביש מה-cryoprotectant למצב הריק הראשון של מארז הדגימה השקוע.חזור על תהליך זה כדי לקצור גבישים נוספים. לאחר שכל הגבישים המעניינים הועמסו לתוך מארז הדגימה, השתמש בשרביט הדיסקית כדי להניח את לוחית הבסיס של החד-פאק על המארז. העבר את היוניפאק בחנקן נוזלי לקו האלומה.השתמש במלקחיים קריו ובכלי טעינת דיסקית כדי לטעון את היוניפאק לתוך מחליף הדגימה של קו האלומה ולנתק את מארז הדגימה. לאחר מכן בחר את הדגימה בתוכנת קו האלומה כדי לטעון ולמרכז אוטומטית את הדגימה בקרן הרנטגן. רכוש ספקטרום פלואורסצנטי של קרני רנטגן וזהה את כל האלמנטים שניתן להשתמש בהם בניסוי עקיפה חריגה.קבע את אורך הגל האופטימלי לאיסוף נתוני עקיפה חריגים על ידי ביצוע סריקת אנרגיית קצה ספיגת קרני רנטגן. לאחר מכן רכוש שלוש דפוסי עקיפה של קרני רנטגן במרווחים של 45 מעלות במצב תנודה סטנדרטי כדי לקבוע אוטומטית את הפרמטרים של תא יחידת הגביש, הסימטריה וגבול העקיפה. ייבא את פרמטרי איסוף הנתונים המומלצים לתוכנת קו האלומה והפעל ניסוי עקיפה חריגה באורך גל יחיד או רב אורכי גל לפי הצורך.היציבות של חלבון קושר המצע SP0092 במאגרי מלח שונים הוערכה כדי לזהות את תמיסת החיץ האופטימלית. טמפרטורות ההיתוך הגבוהות ביותר נמצאו עבור חוצצים עם pH של 6.5 וריכוזי נתרן כלורי הנעים בין אפס ל-0.2 מולר. להליך נבחר בופר עם pH של 6.5 וריכוז נתרן כלורי של 0.2 מולארי.מצבי האוליגומריזציה השונים של SP0092 זוהו והופרדו עם SEC-MALS. ניתוח של פרופיל ה-SEC בריכוזי חלבון שונים הצביע על כך שריכוז חלבון מוגבר מעורר אוליגומריזציה, מה שמצביע על כך שאוליגומרים גדולים יותר יציבים יותר בריכוזים גבוהים. בהתאם לכך, האוליגומרים הגדולים ייצרו גבישים בניסויי התגבשות, בעוד שהמונומר לא.פלואורסצנציה של קרני רנטגן של גבישי SP0092 מקוריים וסלנומתיונין הצביעה על אבץ הקשור לחלבון בשתי הצורות. האות החריג הוגבר על ידי כוונון אורך הגל של קרני הרנטגן לקצוות ספיגת קרני הרנטגן של אבץ או סלניום. לאחר מכן הושג מערך נתונים חריג שלם, וניתוח אוטומטי המופעל על ידי נוכחות של אות חריג יצר מפות ראשוניות של מבני החלבון.מודלים שנבנו במפות הראשוניות הללו שוכללו ואומתו כדי לייצר את המודלים הסופיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשלים אפיון מבני מקיף של חלבון קושר סובסטרט או של כל יעד חלבון פוטנציאלי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח טיפולים חדשים למחלות מירוקוקליות, מכיוון שהיא מספקת תובנות בסיסיות לתכנון מבוסס מבנה של מעכבים לסוג זה של חלבונים.ניתן ליישם שיטות אלה גם על חלבונים קושרי מצע מאורגניזמים אחרים, וניתן להשתמש בהן עבור כל סוג חלבון.

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

אנו מציגים גישות עבור biophysical ומבניים אפיון glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים אינטרפרומטריה biolayer, calorimetry איזותרמי טיטור ו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן.

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

מחקרים אחרונים מדגישים את תפקידם של אנזימי מיקרוביוטה של המעי האנושי בחילוף חומרים של C-גליקוזידים. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מקיפה המשלבת טכניקות כימיה אנליטית (LC-MS/MS ו-NMR) עם גישות ביולוגיה מבנית כדי לאפיין באופן שיטתי את שרשראות התגובה המבניות והאנזימטיות של אנזימים מטבוליים C-גליקוזידים אלה.

גישות בביולוגיה מבנית וכימיה אנליטית לאפיון אנזימים מטבוליים של C-גליקוזיד במיקרוביוטה של המעי האנושי

פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.

חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

חקור את האפיון הביוכימי והמבני של חלבון SP0092 מ-Streptococcus pneumoniae. השיטה משתמשת בבדיקות יציבות פלואורסצנטיות, SEC-MALS וקריסטלוגרפיית קרני X לזיהוי תנאי חיץ אופטימליים להגברת הצלחת ההתגבשות והבנת מבנה החלבון.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

גלה סרטונים נוספים