הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים

חשיפה ל: רעלנים סביבתיים יכולים להשפיע בחריפות עוברי המתפתח. משבשי כגון bisphenols ידועים להשפיע לרעה על מערכת העצבים. כאן נתאר פרוטוקול באמצעות מודל הרשת העצבית בעלי חוליות (אפרוח העובר) במבחנה לחקור את ההשפעה הפונקציונלית של חשיפה הרעלן על עוברי מוקדם.

המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסיוני זה היא לבחון את ההשפעות של תרכובות משבשות אנדוקריניות, כמו ביספנולים, על פעילות זינוק הרשת של רשתות עצביות של בעלי חוליות שהוקמו על מערכים מרובי אלקטרודות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בנוירוביולוגיה התפתחותית וטוקסיקולוגיה סביבתית כגון מנגנון הפעולה של רעלנים סביבתיים על התפתחות פעילות הרשת במוח העוברי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן כעת לחקור את ההשפעות על פרמטרים של רשת עצבית, כמו קצב הירי הממוצע, המספר הכולל של קוצים ומשרעת הספייק כמו גם סנכרון.

המחקר הקודם שלנו הראה ש-EDCs משפיעים על מילים והתנהגות שהם פלט ישיר של רשתות עצביות, והפרוטוקול שלנו שואף כעת להבין את ההשפעה של EDCs על הרשתות האלה. ביום ציפוי הנוירונים, הוציאו בקבוקון של מטריצה חוץ-תאית מהמקפיא השלילי של 20 מעלות צלזיוס, רססו באתנול 70% והניחו על קרח. הקפד להפשיר את המטריצה החוץ-תאית על קרח.

אין להפשיר בטמפרטורת החדר מכיוון שה-ECM מתפלמר מעל אפס מעלות צלזיוס. עבוד במכסה המנוע BSL2 כדי לדלל את המטריצה החוץ-תאית ל-25% על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי קר ל-100 מיקרוליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P200 כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית של 25% למרכז מערך האלקטרודות הרב-אלקטרודות תוך הקפדה לא לגעת באלקטרודות.

הסר מיד את ה-ECM והשאיר סרט דק על פני השטח. מכסים את מערך האלקטרודות המרובות ומניחים באינקובטור תרבית הרקמה עד שיהיו מוכנים לצלחת הנוירונים. התחל בבידוד נוירונים של אפרוחים על ידי עיקור הקליפה החיצונית של ביצת E7 עם 70% אתנול.

חשוב לשמור על תנאים סטריליים מנקודה זו ואילך. ודא שכל המכשירים מעוקרים עם 70% אתנול והתמיסות סטריליות. כדאי להשתמש במכסה המנוע, אך אין זה הכרחי לחלוטין לדיסקציה אם הוא מבוצע במהירות.

לאחר מכן לאחר החזרת העובר ועריפת ראשו, חתכו סביב העיניים והסירו את גלגלי העיניים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים של Dumont מספר חמש ובמספריים קפיציים כדי לבצע חתך בצד הגחון ולהסיר את שכבות העור החיצוניות כדי לחשוף את המוח הקדמי ואת הטקטום האופטי. מקלפים ומסירים את קרום הקליפה בזהירות.

העבירו את המוח הקדמי לצלחת פטרי אחרת המכילה HBSS וחתכו אותה לחתיכות קטנות של כשני מילימטרים בעזרת מספריים קפיציות. השתמש בפיפטה סטרילית כדי להעביר את חלקי המוח הקדמי לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר שחלקי המוח הקדמי שוקעים לתחתית צינור הצנטריפוגה, הסר כמה שיותר HBSS.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.5% טריפסין EDTA מחומם מראש ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להסיר בזהירות את הטריפסין מבלי להפריע לחתיכות הרקמה. הוסף מיליליטר אחד של מדיום נוירו-בזאלי ותן לחתיכות הרקמה לשקוע לתחתית.

לאחר הסרת המדיום וחזרה על הכביסה, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום נוירו-בסיסי וטריטוראטו בעדינות עד שלא נראים עוד חתיכות רקמה. לדלל את התאים התלויים מאחד עד 10 עם מדיום נוירו-בסיסי. ספרו תאים ברי קיימא באמצעות צבע כחול טריפן והמוציטומטר.

לאחר הספירה, צלחו את התאים המנותקים על מערכים מרובי אלקטרודות מצופים ECM בצפיפות של 2,200 תאים למילימטר מרובע. למחרת, הוסף 10 BPA מיקרו-מולרי בתווך נוירו-בסיסי למערכים מרובי האלקטרודות המטופלים. ביום הרכישה, החלף את מדיום התרבית במדיום נוירו-בסיסי טרי והחזיר את המערכים לחממת ה-CO2 למשך שעתיים לפחות לפני ההקלטה.

הפעל את תוכנת ההקלטה והגדר את הטמפרטורה של מערך האלקטרודות המרובות ל-37 מעלות צלזיוס על ידי לחיצה על סמל הטמפרטורה. הגדר את פרמטרי הרכישה על ידי בחירת זרמים בחלונית החלון השמאלית ולחיצה ימנית על סמל המוזה. לאחר מכן, בחר הוסף עיבוד וגלאי ספייק ולחץ על אישור בחלון המוקפץ.

גלאי ספייק שש על ידי STD יופיע מתחת לשם הקובץ. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על גלאי הדוקרנים, בחר הוסף גלאי עיבוד ופרץ ולחץ על אישור בחלון המוקפץ. גלאי פרץ ISI יופיע מתחת לסמל המוזה.

לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על גלאי פרץ, בחר הוסף מהדר עיבוד וסטטיסטיקה עצבית. בחלון המוקפץ, ודא שכותרת הקובץ, סטטיסטיקת באר מצטברת וסינכרון נבחרו, לחץ על אישור. מהדר הסטטיסטיקה יופיע למטה. לחץ על סמל השעון בתחתית המסך ושנה את המידע בקטע ההגדרות כדי להקליט כל 5.1 דקות ולהקליט במשך חמש דקות.

זה יתחיל מיד ויבוצע פעם אחת. לאחר שליפת מערך האלקטרודות הרב-אלקטרודות מהחממה, הנח אותו על יחידת ההקלטה ונעל אותו במקומו. התחל להקליט את פעילות הרשת על ידי לחיצה על התחל הקלטה בקטע ההקלטה המתוזמנת.

בדרך כלל, זמן הקלטה של חמש דקות מספיק, אם כי ניתן להשיג הקלטות ארוכות יותר של עד 10 דקות. לאחר ההקלטה, החזר את מערך האלקטרודות המרובות לחממה. המספר הממוצע של קוצים נמוך משמעותית בתרביות מוח קדמי של אפרוחי E7 שטופלו ב-BPA בהשוואה לתרביות ביקורת.

מדד הסנכרון הממוצע נמוך משמעותית בתרביות מוח קדמי של אפרוחי E7 שטופלו ב-BPA בהשוואה לתרביות ביקורת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משלוש שעות אם היא נעשית כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים סטריליים בכל עת גם בזמן רישום פעילות הספייק.

בעקבות הליך זה, ניתן להעריך את ההשפעה של תרופות פוטנציאליות, כמו תרופות אנטי-אפילפטיות ונוגדות דיכאון, על פעילות הרשת כצעד לקראת הבנת מנגנון הפעולה שלהן. להרבה EDCs יש השפעות עדינות על המוח במהלך ההתפתחות שמתבטאות בשינויים בהתנהגות. אופן פעולה הוא פלט ישיר של פעילות הרשת המשמשת כבסיס.

הפרוטוקול שלנו נועד לנתח את ההשפעות של תרכובות אלה על פעילות הרשת.