מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב שאריות ציסטאין בחלבונים לפי מוטגנזה מכוונת אתר באתרים מסוכררים באופן טבעי ולהשתמש בגישות הצמדה והערכה של גלוקוז במבחנה כדי להעריך את היעילות וההשפעות המבניות של גליקוזילציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית כגון, מהן ההשלכות המבניות של גליקוזילציה של חלבון וכיצד שינויים אלה משפיעים על מנגנוני התפקוד הבסיסיים? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת להתאמה בקלות ללימוד או לטיפול בגליקוזילציה.

הוא יעיל ביותר וניתן להעריך במהירות גם הפרעות במבנה וגם יעילות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות מכיוון שדפוסי גליקוזילציה משתנים נקשרו למספר סוגי סרטן והפרעות ניווניות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות של חלבונים מגליקוזיליים מקוריים, היא יכולה גם לספק מידע נחוץ על איך לשנות דפוסי גליקוזילציה עשויים לתרום למגוון מחלות זה.

כדי להכניס מוטציה בודדת של ציסטאין בווקטור הביטוי, הכינו שני צינורות תגובת PCR בודדים. בצינור הראשון, הוסף את הפריימר המוטגני קדימה ובצינור השני, הוסף את הפריימר המוטגני ההפוך. הוסף ריכוז סופי של מאגר PCR 1X לשני הצינורות.

לאחר מכן, הגדר תוכנית של חמישה מחזורים עבור שני צינורות התגובה הנפרדים של PCR. הוסף זמן הארכה של שבע וחצי דקות ב-72 מעלות צלזיוס בסוף המחזור החמישי. לאחר השלמת חמשת המחזורים, ערבבו את שתי תגובות ה-PCR הנפרדות בצינור אחד, צנטריפוגה את הצינור למשך כשלוש שניות וחזרו על 20 מחזורים נוספים בהתאם לאותם תנאי PCR.

לאחר מכן, הפעל 15 מיקרוליטר מהדגימה על ג'ל אגרוז DNA של 1% ב-120 וולט למשך 40 דקות. לאחר מכן, טבלו את הג'ל במים המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר אתידיום ברומיד ונערו אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, אשר את ההגברה של התבנית תחת אור UV באורך גל של 302 ננומטר.

לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלת DPN1 ל-25 המיקרוליטרים הנותרים של תערובת תגובת PCR. דגרו את התערובת במשך שעתיים וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעכל את התבנית המתילית DNA. לאחר מכן, הוסיפו כחמישה עד 10 מיקרוליטר מהתערובת המעוכלת ל-100 מיקרוליטר של תאי E.coli המסוגלים להלם חום ודגרו על קרח למשך 60 דקות.

לאחר מכן, חשמלו את תערובת התא-DNA ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות על גוש חום יבש. לאחר מכן, דגרו מיד את התערובת על קרח למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטר מרק LB לתאים והעבירו את התרחיף לצינור סטרילי עם תחתית עגולה של 14 מיליליטר.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד ב-190 סל"ד למשך 90 דקות. לאחר מכן, מורחים את כדור התא הצנטריפוגה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

למחרת, חסנו באופן אספטי מושבה בודדת מהצלחת לחמישה מיליליטר של מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, גדלו את התרבית בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד. הפוך את שאריות הציסטאין שעברו מוטציה בפלסמיד לתאי E.coli באמצעות טיפול בהלם חום, ולאחר מכן גידול התרבית בן לילה במדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה.

למחרת, מורחים ישירות 150 מיקרוליטר של תרחיף תאים על לוחות אגר LB בתוספת קנמיצין, ושומרים את הצלחות לדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו באופן אספטי מושבה בודדת ב-20 מיליליטר של מדיום LB בבקבוק ארלנמאייר, והשאירו לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את תרבית הלילה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה של תרבית נוזל הלילה ב -2, 400 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום מינימלי M9 לכדור התא ולאחר מכן השהה את התערובת התאית בליטר אחד של מדיום M9 המכיל קנמיצין. המשך לגדל את תרבית הנוזל M9 ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד בכ-190 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה לכ-0.6 עד 0.8.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרו-מולר של IPTG לתרבית M9 להשראת ביטוי חלבון והשאירו את התרבית לגדול בן לילה. למחרת, גלולה את תאי החיידקים מתרבית הלילה על ידי צנטריפוגה בערך פי 10,000 G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטת העברה ממונעת של 10 מיליליטר, הומוגניזציה של כדור תאי החיידקים הקפוא בכ-40 מיליליטר של מאגר הומוגניזציה.

לאחר מכן, דגרו את ההומוגנאט בתנור הכלאה למשך 90 דקות עם סיבוב מתמיד. צנטריפוגה את התערובת בערך 15,000 פעמים G בשמונה מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי להפריד את חלק החלבון המסיס מהכדור הבלתי מסיס. לאחר מכן, הוסף 50% נפח אחר נפח ניקל חומצה ניטרילוטריאצטית אגרוז תמיסת חרוזים לסופרנטנט ודגירה על ידי היפוך בתנור ההכלאה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש בעמודת טיהור חלבון זרימת הכבידה כדי לאסוף את חרוזי האגרוז עם חלבון מתויג הקסהיסטידין המחובר לניקל. לבסוף, שטפו את חרוזי האגרוז שנאספו שלוש פעמים. יש לחסל את החלבונים בסדרה של שני שברים של מיליליטר.

לאחר מכן, אשר חלבון מתויג הקסהיסטידין מטוהר בשברים המנופחים על ידי הפעלת ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכחול של Coomassie. אסוף את שברי החלבון המופשטים לקרום דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 3,500 דלטון ודגירה במאגר מתקפל מחדש בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ערבוב מגנטי. לאחר מכן, הוסיפו כיחידה אחת של תרומבין למיליגרם חלבון לחלבון המאוגד בקרום הדיאליזה ודגרו שוב למשך יום אחד בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, הוציאו את החלבון משקית הדיאליזה ורכזו אותו בערך פי עשרה באמצעות רכז צנטריפוגלי אולטרה-סינון עם חתך משקל מולקולרי של 10,000 דלטון. לאחר מכן, יש לדלל מחדש את תרכיז החלבון בערך פי 20 במאגר מתקפל ללא נתרן כלורי. כדי לטהר את החלבון, טען אותו על עמודת חילופי אניונים ארוזה מראש המאוזנת עם אותו מאגר נטול נתרן כלורי.

התחל לנטרל את החלבונים בשיפוע של אפס עד 60% של נתרן כלורי מולרי אחד המכיל מאגר מתקפל מחדש. העבירו את שברי החלבון המאוגדים לשקית דיאליזה. בצע שלב דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להחליף את החלבון למאגר המתקפל מחדש הניסיוני עם הריכוז המולרי האופטימלי של נתרן כלורי.

ראשית, דיאליזה של 1.5 מיליליטר של כ-60 חלבון מיקרו-מולרי לליטר אחד של מאגר שינוי לגליקוזילציה של חלבון. לאחר 24 שעות, בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את החלבון המותאם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו גלוקוז-5-MTS מסיס DMSO לריכוז סופי של שתי מילימולר. הקש בעדינות על צינור המיקרו-צנטריפוגה כל 10 דקות תוך דגירה של הדגימה בחושך למשך שעה בטמפרטורת הסביבה.

לאחר הדגירה, בצע דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס כדי להחליף מחדש את החלבון למאגר הניסוי הסופי. מדוד את המסה המדויקת של החלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרוספריי. לבסוף, השתמש בתמ"ג תמיסה כדי לחשב את יעילות השינוי ולזהות את השינויים המבניים של שאריות ציס מסוכררות בחלבון.

DNA תבנית מוגבר PCR מוטציוני מוצלח מוצג בג'ל אגרוז מייצג זה של 1% DNA. סולם DNA וכמות שווה ערך של תבנית DNA שלא הוגברה על ידי PCR משמשים כבקרות בג'ל. הרצועה העליונה ביותר עם צביעת אתידיום ברומיד בעוצמה גבוהה מציגה את התבנית המוגברת בגודל הרצוי.

לאחר מכן, החלבון טוהר באמצעות עמודת חילופי אניונים. הכרומטוגרמה מציגה פרופיל פליטה שנצפה ב-280 ננומטר בכחול המציג שלוש פסגות הבולטות כנגד שיפוע נתרן כלורי המסומן באדום עם ריכוז הולך וגדל עד 0.6 טוחנת. הפאנל התחתון מציג ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכחול של Coomassie של שברי החלבון.

גליקוזילציה של שאריות הציסטאין נקבעה על ידי ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי. הכרומטוגרמה מציגה את המסות של החלבון הלא שונה והשונה לפני ואחרי גליקוזילציה של שאריות הציסטאין. לאישור, בוצע תמ"ג תמיסה המציג את הכיסוי הספקטרלי של HSQC של התזוזות הכימיות הספציפיות של האמיד, מה שמעיד הן על שינויים והן על הפרעות מבניות של חלבון מסוכרר.

כאשר שולטים בו, ניתן להשלים את כל השלבים ממוטגנזה ועד הערכת NMR תוך כ-12 יום, לא כולל זמן ההמתנה לסינתזה של פריימר, ריצוף DNA ושירותי ספקטרוסקופיה מסה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להעריך את ההשפעות המבניות והביופיזיקליות של מוטציות הציסטאין בהיעדר שינוי התיול כמדידות בקרת קו בסיס. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון יציבות, מבנה משני, קשירת יונים, הערכות אינטראקציה בין חלבון לחלבון, כדי לחשוף כיצד התכונות הביופיזיקליות של תפקודי החלבון הבסיסיים מושפעות מגליקוזילציה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות הסידן להעריך באופן אינדיבידואלי ומצטבר את התפקידים של אספרגין 131 ואספרגין 171 וגליקוזילציה במולקולת אינטראקציה סטרומלית איתות סידן אחד הקשור לכניסת סידן המופעלת בחנות.