Name: מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: למדו שיטה לגליקוזילציה ספציפית לאתר בחלבונים באמצעות מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של יעילות השינוי והשפעותיו המבניות על תפקוד החלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (05239 כדי נשדר), קרן קנדי קרן מחקרים חדשנות/אונטריו (כדי נשדר), קרן סרטן הערמונית להילחם - טילוס נסיעה עבור אבא (כדי נשדר), אונטריו מלגות לתואר שני (כדי Y.J.C. ונ. ס).

גליקוזילציה חלבון הוא שינוי post-translational איפה סוכרים covalently מחוברים polypeptides בעיקר דרך קישורים לרשתות בצד חומצת אמינו. כ 50% של יונקים חלבונים הם glycosylated 54, שבו החלבונים glycosylated יכול לאחר מכן יש מגוון רחב של אפקטים מתוך שינוי זיקה מחייבת למערכות ביולוגיות, המשפיעים על חלבון קיפול, שינוי ערוץ פעילות, מיקוד מולקולות השפלה וסלולר סחר בבני אדם, שם כמה (נבדקה ב33). תפקידה החשוב של גליקוזילציה בפיזיולוגיה יונקים מתבטא על ידי כמה מאות חלבונים התפתחו כדי לב...

לאחסן המופעלים סידן (Ca2 +) כניסה (SOCE) הוא מסלול מרכזי שבו תאים חיסוניים לקחת את2 + Ca מן המרחב חוץ-תאית לתוך ציטוזול. בלימפוציטים מסוג T, T cell קולטנים הממוקמים על קרום פלזמה (PM) לאגד אנטיגנים אשר להפעיל חלבון טירוזין kinases (נבדקה 1,2,3). מפל זרחון שמוביל ההפעלה של phospholipase-γ (PLCγ) אשר לאחר מכן שמתווכת של הידרוליזה של הממברנה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) לתוך diacylglycerol, אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP3 ). IP3 הוא שליח diffusible קטן אשר נקשר לקולטנים IP3 (IP3R) על תוך-פלזמית (ER) ובכך לפתוח ערוץ קולטן זה ואישורים Ca2 + לזרום במורד מעבר הצבע ריכוז מחדר המיון לומן ל ציטוזול (נבדקה ב 4). קולטן למנהיגנו לבין חלבון G בשילוב קולטני טירוזין קינאז במגוון של עופרת סוגים אחרים על טמפרמנט רב ועל אי-טמפרמנט תא ייצור זהה של IP3 והפעלה של IP3ר'.
עקב גבולית קה2 + קיבולת האחסון של חדר המיון, ה-IP3-שחרור בתיווך, שנפתח על ידי עלייה Ca cytosolic2 + היא רק ארעי; עם זאת, זו דלדול ER luminal Ca2 + עמוקות אפקטים אינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1), סוג-אני transmembrane (TM) חלבון נמצאו בעיקר על6,7 5,ממברנה ER. STIM1 מכיל מונחה לומן Ca2 + חישה תחום מורכב, זוג EF-יד ו α-מוטיב סטרילי (EFSAM). שלושה תחומים של סליל מפותל cytosolic מונחה מופרדים EFSAM על-ידי קבוצת המחשבים TM יחיד (נבדקה ב 8). בעת מיון luminal Ca2 + התרוקנות, עובר EFSAM 7,oligomerization מצמידים הקשורה9 הגורמת rearrangements מבנית של TM ואת סליל מפותל תחומים 10. שינויים מבניים אלה מסתיימים השמנה של STIM1 ב ER-PM צמתי 11,12,13,14 דרך אינטראקציות עם PM phosphoinositides 15, 16 Orai1 subunits 17,18. Orai1 חלבונים הם subunits PM אשר להרכיב לטופס Ca2 + ערוצי 19,20,21,22. האינטראקציות STIM1-Orai1 ובצמתים ER-PM להקל על פתוח Ca2 + שחרור מופעל Ca2 + (CRAC) ערוץ קונפורמציה המאפשר את התנועה של Ca2 + לתוך ציטוזול מ ריכוזים גבוהים של מרחב חוץ-תאית. בתאי מערכת החיסון, מתמשכת cytosolic Ca2 + שינויי הגובה באמצעות ערוצים CRAC זירוז של Ca2 +- קלמודולין/calcineurin תלויים dephosphorylation של הגורם הגרעיני של תאי-T מופעל, אשר לאחר מכן נכנס לגרעין, מתחיל תעתיק ויסות גנים קידום T-cell הפעלה 1,3. התהליך של CRAC הפעלת הערוץ על ידי 23,STIM124 באמצעות אגוניסט-induced ER luminal Ca2 + הידלדלות שכבת שתיווצר מתמשכת cytosolic Ca2 + גובה קולקטיבי הנקרא SOCE 25. התפקיד החיוני של SOCE של תאי T-מתבטא על ידי מחקרים מדגימים כי מוטציות heritable הן STIM1 והן Orai1 יכול לגרום כשל חיסוני משולבים severe תסמונות 3,19,26, 27. EFSAM יוזם SOCE לאחר חישה Ca ER-luminal2 + דלדול דרך האובדן של Ca2 + תיאום הקנוני EF-היד, המוביל בסופו של דבר האגודה עצמית מצמידים הקשורה 7, 28,29.
גליקוזילציה הוא מצורף קוולנטיות עיבוד של פחמימה # מיון הפחמימות מבנים, הידוע גם בשם glycans, דרך השלבים השונים biosynthetic הוחלף נגזר ER, גולג'י (נבדקה ב 30,32,33). ישנם שני סוגי גליקוזילציה ב פרוקריוטים השולט: N-המקושר ו- O-מקושרים, בהתאם חומצת אמינו ספציפית אטום גישור ניגודים. ב- N- גליקוזילציה, glycans מחוברים את אמיד שרשרת הצד של Asn, ברוב המקרים, שלב החניכה מתרחשת בחדר המיון כמו מפוליפפטיד שרשרת נע לתוך לומן 34. הצעד הראשון גליקוזילציה - Nהוא ההעברה של מבנה ליבה 14-סוכר המורכב גלוקוז (Glc), מנוז (אדם) ו- N- acetylglucosamine (GlcNAc) (קרי Glc3איש9GlcNAc2) ממיון ממברנה השומנים על ידי 35,oligosaccharyltransferase36. צעדים נוספים, כגון מחשוף או העברה של גלוקוז משקעים, הן מזורז בחדר המיון glycosidases ספציפיות, glycosyltransferases. כמה חלבונים להשאיר בחדר המיון ולהעביר גולג'י יכול להיות עוד יותר מעובד 37. O- גליקוזילציה מתייחס התוספת של glycans, בדרך כלל אל קבוצת הידרוקסיל שרשרת הצד של שאריות Ser או חמישי, ומתרחשת שינוי זה לחלוטין ב 33,הגולגי34. ישנם מספר מבנים - glycan Oאשר יכול להיות מורכב של N- acetylglucosamine, fucose, גלקטוז, חומצה sialic עם כל חד-סוכר נוסף ברצף 33.
אמנם אין רצף מסוים זוהה תנאי הכרחי עבור סוגים רבים של O- גליקוזילציה, רצף קונצנזוס נפוצות נמצא קשור N-מקושרים השינוי: Asn-X-Ser/חמישי/Cys, שבו X יכול להיות כל חומצת אמינו רק Pro 33. STIM1 EFSAM מכיל את שני האתרים האלה - גליקוזילציה קונצנזוס N: Asn131-Trp132-Thr133 ו- Asn171-Thr172-Thr173. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי EFSAM יכול להיות N- glycosylated בתרבית של תאים ב- Asn131 ו- Asn171 38,39,40,41. עם זאת, מחקרים קודמים ההשלכות של N- גליקוזילציה על SOCE היו incongruent, רומז מדוכא, potentiated או אין השפעה על ידי שינוי זה post-translational על SOCE ההפעלה 38,= "xref" >40,,3941. לפיכך, מחקר על ההשלכות biophysical, ביוכימי, מבניים הבסיסית של EFSAM N- גליקוזילציה חיוני כדי לגלות את ההשפעות הרגולציה של שינוי זה. עקב הדרישה לקבלת רמות גבוהות של חלבונים הומוגנית בניסויים אלה במבחנה , הוחל בגישה סלקטיבית באתר לצרף covalently גלוקוז moieties EFSAM. מעניין, Asn131 ו- Asn171 גליקוזילציה גרם לשינויים מבניים להתכנס בתוך תוכו EFSAM ולשפר את המאפיינים biophysical אשר לקדם בתיווך STIM1 SOCE 42.
הקובץ המצורף כימי של קבוצות glycosyl כדי Cys תיולים כבר ומבוססת על ידי עבודה הזרע אשר שהראו את התועלת של גישה זו ללא אנזים להבנת השפעת גליקוזילציה בייעודי לאתר על תפקוד החלבון 43 , 44. לאחרונה, ובעניין STIM1, משקעי Asn131 ו- Asn171 היו מוטציה כדי Cys ושימש glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] כדי covalently לקישור גלוקוז חופשי תיולים 42. כאן, אנו מתארים גישה זו, אשר לא רק משתמשת מוטגנזה מכוונת לשלב באתר ספציפי Cys שאריות ולשנותן, אלא חל גם פתרון ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להעריך במהירות יעילות שינויים מבניים לפליטת כתוצאה גליקוזילציה. ראוי לציין, מתודולוגיה כללית זו ניתנת להתאמה בקלות לחקור את ההשפעות של או O- או N- גליקוזילציה של כל recombinantly מיוצר חלבון.

<table><tbody><tr><td>שימוש ב-DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>F530S</td><td>בשלב 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA סולם</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>FERSM1163</td><td>שימוש בשלב 1.6.</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה DpnI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>השתמש בשלב 1.8.</td></tr><tr><td>ערכת פרסטו מיני פלסמיד</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>השתמש בשלב 1.16.</td></tr><tr><td>קודון BL21 DE3 (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>השתמש בשלב 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>השתמש בשלב 1.9.</td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.22 מ"מ</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>השתמש בשלב 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA שרף אגרוז</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>88221</td><td>השתמש בשלב 3.3.</td></tr><tr><td>3,500 צינורות דיאליזה של MWCO BioDesign</td><td>, Inc.</td><td>D306</td><td>השתמש בשלבים 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 ו-4.6.</td></tr><tr><td>בקר תרומבין</td><td>מעבדות ביופארם בע"מ</td><td>SKU91-055</td><td>השתמש בשלב 3.9.</td></tr><tr><td>5 מ"ל HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>השתמש בשלב 3.11.</td></tr><tr><td>גלוקוז-5-MTS</td><td>טורונטו מחקר כימיקלים, בע"מ</td><td>G441000</td><td>השתמש בשלב 4.1.</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 ריכוזי צנטריפוגל אולטרה-סינון</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>השתמש בשלבים 3.11, 4.2, 4.5 ו-4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler סולם חלבון רחב לא מוכתם</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>השתמש בשלב 3.7, 3.10 ו-3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>השתמש בשלב 3.12.</td></tr><tr><td>מערכת כרומטרוגרפיה נוזלית מהירה טהורה של AKTA GE</td><td>Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>השתמש בשלב 3.14.</td></tr><tr><td>600 מגה-הרץ Varian Inova NMR ספקטרומטר</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>השתמש בשלב 5.2 ו-5.5.</td></tr></tbody></table>

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

האינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1) הוא סוג-אני טראנסממברנלי הממוקם על רשתית תוך-פלזמית (ER), ממברנות פלזמה (PM). ER-תושב STIM1 מווסת את הפעילות של ערוצי PM Orai1 בתהליך המכונה תאחסן המופעלים סידן (Ca2 +) זהו המנהל Ca2 + איתות התהליך שמניע את התגובה החיסונית. STIM1 עובר post-translational N- גליקוזילציה בשני אתרים Asn luminal בתוך Ca2 + חישה תחום של המולקולה. עם זאת, הביוכימי, biophysical, מבנה השפעות ביולוגיות של N- glycosylated STIM1 היו ממעטים להבין עד לאחרונה עקב חוסר יכולת להשיג בקלות רמות גבוהות של חלבון - glycosylated Nהומוגנית. כאן, אנו מתארים מימוש במבחנה כימית גישה שמתחבר גלוקוז moieties לאתרים חלבון ספציפי, החלים על הבנת ההשפעות הבסיסית של N- גליקוזילציה על מבנה החלבון ואת מנגנון. באמצעות פתרון תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה לנו להעריך הן יעילות של השינוי, כמו גם את ההשלכות מבנית של הקובץ המצורף גלוקוז עם דוגמה אחת. גישה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד את החלבונים glycosylated הרבות המצויים בטבע.

הצעד הראשון של גישה זו מחייבת מוטגנזה מכוונת של שאריות גליקוזילציה המועמד אל שאריות Cys אשר ניתן לשינוי באמצעות EFSAM של גלוקוז-5-MTS. יש ללא שאריות Cys אנדוגני, אז אין שיקולים מיוחדים צריכים להיעשות לפני מוטגנזה מכוונת. עם זאת, שאריות Cys יליד חייב להיות מוטציה כדי משקעים שאינם לשינוי לפני שתבצע את הכימיה. המתוארת. להשפעה מינימלית המבנה המקורי, אנו ממליצים ביצוע עולמי עימוד רצפים של החלבון עניין ומצא לקבוע שהן שאריות אחרות רוב בתדירות גבוהה-Cys אנדוגני position(s). מוטציה Cys כדי אלה שאר...

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב שאריות ציסטאין בחלבונים לפי מוטגנזה מכוונת אתר באתרים מסוכררים באופן טבעי ולהשתמש בגישות הצמדה והערכה של גלוקוז במבחנה כדי להעריך את היעילות וההשפעות המבניות של גליקוזילציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית כגון, מהן ההשלכות המבניות של גליקוזילציה של חלבון וכיצד שינויים אלה משפיעים על מנגנוני התפקוד הבסיסיים? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת להתאמה בקלות ללימוד או לטיפול בגליקוזילציה.הוא יעיל ביותר וניתן להעריך במהירות גם הפרעות במבנה וגם יעילות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות מכיוון שדפוסי גליקוזילציה משתנים נקשרו למספר סוגי סרטן והפרעות ניווניות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות של חלבונים מגליקוזיליים מקוריים, היא יכולה גם לספק מידע נחוץ על איך לשנות דפוסי גליקוזילציה עשויים לתרום למגוון מחלות זה.כדי להכניס מוטציה בודדת של ציסטאין בווקטור הביטוי, הכינו שני צינורות תגובת PCR בודדים. בצינור הראשון, הוסף את הפריימר המוטגני קדימה ובצינור השני, הוסף את הפריימר המוטגני ההפוך. הוסף ריכוז סופי של מאגר PCR 1X לשני הצינורות.לאחר מכן, הגדר תוכנית של חמישה מחזורים עבור שני צינורות התגובה הנפרדים של PCR. הוסף זמן הארכה של שבע וחצי דקות ב-72 מעלות צלזיוס בסוף המחזור החמישי. לאחר השלמת חמשת המחזורים, ערבבו את שתי תגובות ה-PCR הנפרדות בצינור אחד, צנטריפוגה את הצינור למשך כשלוש שניות וחזרו על 20 מחזורים נוספים בהתאם לאותם תנאי PCR.לאחר מכן, הפעל 15 מיקרוליטר מהדגימה על ג'ל אגרוז DNA של 1% ב-120 וולט למשך 40 דקות. לאחר מכן, טבלו את הג'ל במים המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר אתידיום ברומיד ונערו אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, אשר את ההגברה של התבנית תחת אור UV באורך גל של 302 ננומטר.לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של אנזים הגבלת DPN1 ל-25 המיקרוליטרים הנותרים של תערובת תגובת PCR. דגרו את התערובת במשך שעתיים וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעכל את התבנית המתילית DNA. לאחר מכן, הוסיפו כחמישה עד 10 מיקרוליטר מהתערובת המעוכלת ל-100 מיקרוליטר של תאי E.coli המסוגלים להלם חום ודגרו על קרח למשך 60 דקות.לאחר מכן, חשמלו את תערובת התא-DNA ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות על גוש חום יבש. לאחר מכן, דגרו מיד את התערובת על קרח למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטר מרק LB לתאים והעבירו את התרחיף לצינור סטרילי עם תחתית עגולה של 14 מיליליטר.דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד ב-190 סל"ד למשך 90 דקות. לאחר מכן, מורחים את כדור התא הצנטריפוגה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.למחרת, חסנו באופן אספטי מושבה בודדת מהצלחת לחמישה מיליליטר של מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, גדלו את התרבית בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד. הפוך את שאריות הציסטאין שעברו מוטציה בפלסמיד לתאי E.coli באמצעות טיפול בהלם חום, ולאחר מכן גידול התרבית בן לילה במדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה.למחרת, מורחים ישירות 150 מיקרוליטר של תרחיף תאים על לוחות אגר LB בתוספת קנמיצין, ושומרים את הצלחות לדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו באופן אספטי מושבה בודדת ב-20 מיליליטר של מדיום LB בבקבוק ארלנמאייר, והשאירו לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את תרבית הלילה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה של תרבית נוזל הלילה ב -2, 400 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום מינימלי M9 לכדור התא ולאחר מכן השהה את התערובת התאית בליטר אחד של מדיום M9 המכיל קנמיצין. המשך לגדל את תרבית הנוזל M9 ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד בכ-190 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה לכ-0.6 עד 0.8.לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרו-מולר של IPTG לתרבית M9 להשראת ביטוי חלבון והשאירו את התרבית לגדול בן לילה. למחרת, גלולה את תאי החיידקים מתרבית הלילה על ידי צנטריפוגה בערך פי 10,000 G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטת העברה ממונעת של 10 מיליליטר, הומוגניזציה של כדור תאי החיידקים הקפוא בכ-40 מיליליטר של מאגר הומוגניזציה.לאחר מכן, דגרו את ההומוגנאט בתנור הכלאה למשך 90 דקות עם סיבוב מתמיד. צנטריפוגה את התערובת בערך 15,000 פעמים G בשמונה מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי להפריד את חלק החלבון המסיס מהכדור הבלתי מסיס. לאחר מכן, הוסף 50% נפח אחר נפח ניקל חומצה ניטרילוטריאצטית אגרוז תמיסת חרוזים לסופרנטנט ודגירה על ידי היפוך בתנור ההכלאה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השתמש בעמודת טיהור חלבון זרימת הכבידה כדי לאסוף את חרוזי האגרוז עם חלבון מתויג הקסהיסטידין המחובר לניקל. לבסוף, שטפו את חרוזי האגרוז שנאספו שלוש פעמים. יש לחסל את החלבונים בסדרה של שני שברים של מיליליטר.לאחר מכן, אשר חלבון מתויג הקסהיסטידין מטוהר בשברים המנופחים על ידי הפעלת ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכחול של Coomassie. אסוף את שברי החלבון המופשטים לקרום דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 3,500 דלטון ודגירה במאגר מתקפל מחדש בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ערבוב מגנטי. לאחר מכן, הוסיפו כיחידה אחת של תרומבין למיליגרם חלבון לחלבון המאוגד בקרום הדיאליזה ודגרו שוב למשך יום אחד בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, הוציאו את החלבון משקית הדיאליזה ורכזו אותו בערך פי עשרה באמצעות רכז צנטריפוגלי אולטרה-סינון עם חתך משקל מולקולרי של 10,000 דלטון. לאחר מכן, יש לדלל מחדש את תרכיז החלבון בערך פי 20 במאגר מתקפל ללא נתרן כלורי. כדי לטהר את החלבון, טען אותו על עמודת חילופי אניונים ארוזה מראש המאוזנת עם אותו מאגר נטול נתרן כלורי.התחל לנטרל את החלבונים בשיפוע של אפס עד 60% של נתרן כלורי מולרי אחד המכיל מאגר מתקפל מחדש. העבירו את שברי החלבון המאוגדים לשקית דיאליזה. בצע שלב דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להחליף את החלבון למאגר המתקפל מחדש הניסיוני עם הריכוז המולרי האופטימלי של נתרן כלורי.ראשית, דיאליזה של 1.5 מיליליטר של כ-60 חלבון מיקרו-מולרי לליטר אחד של מאגר שינוי לגליקוזילציה של חלבון. לאחר 24 שעות, בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את החלבון המותאם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו גלוקוז-5-MTS מסיס DMSO לריכוז סופי של שתי מילימולר. הקש בעדינות על צינור המיקרו-צנטריפוגה כל 10 דקות תוך דגירה של הדגימה בחושך למשך שעה בטמפרטורת הסביבה.לאחר הדגירה, בצע דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס כדי להחליף מחדש את החלבון למאגר הניסוי הסופי. מדוד את המסה המדויקת של החלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרוספריי. לבסוף, השתמש בתמ"ג תמיסה כדי לחשב את יעילות השינוי ולזהות את השינויים המבניים של שאריות ציס מסוכררות בחלבון.DNA תבנית מוגבר PCR מוטציוני מוצלח מוצג בג'ל אגרוז מייצג זה של 1% DNA. סולם DNA וכמות שווה ערך של תבנית DNA שלא הוגברה על ידי PCR משמשים כבקרות בג'ל. הרצועה העליונה ביותר עם צביעת אתידיום ברומיד בעוצמה גבוהה מציגה את התבנית המוגברת בגודל הרצוי.לאחר מכן, החלבון טוהר באמצעות עמודת חילופי אניונים. הכרומטוגרמה מציגה פרופיל פליטה שנצפה ב-280 ננומטר בכחול המציג שלוש פסגות הבולטות כנגד שיפוע נתרן כלורי המסומן באדום עם ריכוז הולך וגדל עד 0.6 טוחנת. הפאנל התחתון מציג ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכחול של Coomassie של שברי החלבון.גליקוזילציה של שאריות הציסטאין נקבעה על ידי ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי. הכרומטוגרמה מציגה את המסות של החלבון הלא שונה והשונה לפני ואחרי גליקוזילציה של שאריות הציסטאין. לאישור, בוצע תמ"ג תמיסה המציג את הכיסוי הספקטרלי של HSQC של התזוזות הכימיות הספציפיות של האמיד, מה שמעיד הן על שינויים והן על הפרעות מבניות של חלבון מסוכרר.כאשר שולטים בו, ניתן להשלים את כל השלבים ממוטגנזה ועד הערכת NMR תוך כ-12 יום, לא כולל זמן ההמתנה לסינתזה של פריימר, ריצוף DNA ושירותי ספקטרוסקופיה מסה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להעריך את ההשפעות המבניות והביופיזיקליות של מוטציות הציסטאין בהיעדר שינוי התיול כמדידות בקרת קו בסיס. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון יציבות, מבנה משני, קשירת יונים, הערכות אינטראקציה בין חלבון לחלבון, כדי לחשוף כיצד התכונות הביופיזיקליות של תפקודי החלבון הבסיסיים מושפעות מגליקוזילציה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות הסידן להעריך באופן אינדיבידואלי ומצטבר את התפקידים של אספרגין 131 ואספרגין 171 וגליקוזילציה במולקולת אינטראקציה סטרומלית איתות סידן אחד הקשור לכניסת סידן המופעלת בחנות.

targeting-cysteine-thiols-for-vitro-site-specific-glycosylation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין...

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

מאמר זה מתאר שיטות לתיוג ספין מכוון אתר ובנייה מחדש של תעלות מגודרות ליגנד פנטמרי למחקרי תהודה פרמגנטית אלקטרונית. ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל חלבון ממברנה. שיטת הבנייה מחדש המתוארת כאן יכולה לשמש גם למדידות מהדק טלאי של זרמים מקרוסקופיים וחד-ערוציים במערכת שומנים מוגדרת.

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים החשובים הנדרשים bioconjugation של ציסטאין המכיל חלבון על maleimide, כוללים טיהור מגיבה, תנאי תגובה, טיהור bioconjugate ואפיון bioconjugate.

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

אנו מציגים גישות עבור biophysical ומבניים אפיון glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים אינטרפרומטריה biolayer, calorimetry איזותרמי טיטור ו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן.

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.

לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

למדו שיטה לגליקוזילציה ספציפית לאתר בחלבונים באמצעות מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של יעילות השינוי והשפעותיו המבניות על תפקוד החלבון.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

גלה סרטונים נוספים