Name: מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למד את פרוטוקול ATAC-seq לזיהוי אזורי כרומטין נגישים בגנום האנושי. השיטה מיועדת ללימפוציטים T אנושיים ראשוניים ומספקת תובנות לנוף הרגולטורי האפיגנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (גרנט 748/14), מארי קירי אינטגרציה הענק (סיגריה) - האיחוד FP7-אנשים-20013-סיגריה-618763 ואני-ליבת התוכנית של תכנון, תקצוב הוועדה ושל קרן המדע ישראל להעניק מס 41/11.

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li>
<li>Thurman, R. E., Rynes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Approaches+to+Determining+Nucleosome+Occupancy+in+Metazoans+Using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq.</a> Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Qu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+and+Variation+of+Personal+Regulomes+in+Primary+Human+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells.</a> Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).</li>
<li>Scharer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq+on+biobanked+specimens+defines+a+unique+chromatin+accessibility+structure+in+na%C3%AFve+SLE+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells.</a> Sci Rep. 6, 27030(2016).</li>
<li>Sebé-Pedrós, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+Regulatory+Genome+of+Capsaspora+and+the+Origin+of+Animal+Multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity.</a> Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).</li>
<li>Davie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Transcription+Factors+and+Regulatory+Regions+Driving+In+Vivo+Tumor+Development+by+ATAC-seq+and+FAIRE-seq+Open+Chromatin+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling.</a> PLOS Genet. 11 (2), (2015).</li>
<li>Villar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+Evolution+across+20+Mammalian+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species.</a> Cell. 160 (3), 554-566 (2015).</li>
<li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li>
<li>Prescott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+Divergence+and+cis-Regulatory+Evolution+in+the+Human+and+Chimp+Neural+Crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest.</a> Cell. 163 (1), 68-83 (2015).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Jenner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+T-bet+and+GATA-3+control+alternative+pathways+of+T-cell+differentiation+through+a+shared+set+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).</li>
<li>DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+reversible+immobilization+for+the+isolation+of+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Biol. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Meyer, C. A., Shirley Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+mitigating+bias+in+next-generation+sequencing+methods+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology.</a> Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>He, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+DNase-seq+protocol+and+data+analysis+reveals+intrinsic+bias+in+transcription+factor+footprint+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification.</a> Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).</li>
<li>Madrigal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Accounting+for+Sequence-Specific+Bias+in+Genome-Wide+Chromatin+Accessibility+Experiments%3A+Recent+Advances+and+Contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).</li>
<li>Qin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChiLin%3A+a+comprehensive+ChIP-seq+and+DNase-seq+quality+control+and+analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline.</a> BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ATAC-seq+approach+reveals+lineage-specific+reinforcement+of+the+open+chromatin+landscape+via+cooperation+between+BAF+and+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63.</a> Genome Biol. 16 (1), 284(2015).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול האטא ק-seq המתוארים כאן כבר בהצלחה מועסקים לניתוח של כרומטין נגיש בתאים הראשי (Th1 אנושי, Th2 תאים, ותאי B) כמו גם שורות תאים בתרבית (תאי סרטן השד אנושי MCF10A ו- U261 גליובלסטומה תאים). החלת האטא ק-seq סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש קצת אופטימיזציה פרוטוקול, במיוחד בשלב פירוק. אם הריכוז של דטרגנט ללא יונית גבוהה מדי, אולי יש אחוז גבוה יותר של זיהום דנ א מיטוכונדריאלי. זה יכול להיות מופחת על ידי הפחתת ריכוז דטרגנט במאגר של פירוק מבלי להפחית את התשואה גרעינים. מניסיוננו, פירוק מאגר עם 0.05% של דטרגנט נתן תוצאות משב...

האטא ק-seq1,2 היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורים פתוחים כרומטין רגולטוריות3 והמיקום נוקלאוזום. מידע זה מוחל על אומדן משוער, זהות, והמיקום פעילותם של גורמי שעתוק. רגישות השיטה למדידת כמותיים בווריאציות הכרומטין מאפשר חקר הפעילות של כרומטין גורמים, כולל כרומטין remodelers מגבילים, כמו גם את הפעילות תעתיק של RNA פולימראז II1. ובכך האטא ק-seq מספק גישה רציונלית ובלתי עוצמה בפענוח מנגנוני המפקחים על תעתיק רגולציה בכל סוג התא של ריבית. אנו מתארים את העיבוד של האטא ק-seq תאי Th1 ו Th2 אדם ראשי.
ב האטא ק-seq, transposase Tn5 היפראקטיבי עמוסה מתאמים עבור הדור הבא רצפי (הגדרות) זוגות DNA פיצול עם תיוג של ה-DNA עם מתאמים (כלומר, תהליך "tagmentation")1. בעקבות ה-PCR-הגברה, ספריות DNA שנוצר מוכנים עבור הדור הבא רצפי (איור 1). Tagmentation מועדף של כרומטין נגיש הוא זוהה על ידי הניתוח של העשרה המקומיים הקריאות רצף האטא ק-seq.
ניתוח ניסיוני קצר ואת הדרישה פחות חומר המוצא, ביחס שיטות אחרות למדידת כרומטין נגישות ומיקום nucleosomal כגון DNase-seq4, שלהם-seq5MNase-seq6, יש קידם את השימוש האטא ק-seq במערכות ביולוגיות מרובות, כולל תאים אנושיים ראשי1,7 דוגמאות קליניות8, וכן אורגניזמים חד־תאיות9, צמחים10, זבובי פירות11 , יונקים שונים12.
זהותו של שעתוק ניתן חשפו גורמים שמאוגדים לוקוסים נגיש על ידי ניתוח את העשרת של מוטיבים רצף שלהם מחייב או שילוב האטא ק-seq עם כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ואחריו (רצפי DNA תפוקה גבוהה ChIP-seq). גישה זו איפשרה זיהוי גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין חשוב hematopoiesis העכבר13. הטבע לא משוחד ואשר הכללית של האטא ק-seq מאפשר ללמוד הכונה אורגניזמים אשר ריאגנטים כגון נוגדנים לניתוח שבב אינם זמינים. לדוגמה, אבולוציונית וריאציות ב- cis-אזורים רגולטוריות זוהו על ידי לימוד הרכס העצבי הגולגולת תאים מן השימפנזים ובני14, וריאציות התפתחותית ברכיבי תקינה במהלך העכבר בתחילת מופרה15, שינויים בנוף תקינה במהלך מחזור החיים של חד־תאיות owzarzaki ג9, והתפתחות של היזמים, משפרי מעבר יונקים 20 מינים12.
האטא ק-seq היה גם אינסטרומנטלי למדידת כרומטין נגישות בתאים בודדים, ובכך לחשוף השתנות בתוך אוכלוסיות תאים, אשר בדרך כלל מתחמק מחקרים ברמת הגנום7,16. בנוסף, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים המתרחשים באזורים רגולטוריות DNA בתנאים מחלה, שבה מדגמים נדירים. לדוגמה, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים בנוף תקינה במהלך תחילת לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)17 או ראס-מונע oncogenesis11.

<table><tbody><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td>4489</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמות</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>Countes Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>תאים חד-גרעיניים בדם היקפי&nbsp;( PBMC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS&s; 800 וביישן; 011</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>תעשיות ביולוגיות בינוניות</td><td>01-103-1A</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-020-1B</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-031-1B</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS),&nbsp; מושבת בחום,</td><td>תעשיות ביולוגיות</td> בדרגה אירופאית <td>04-127-1</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזי MACS CD4, אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>עמודות MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG1 בקרת איזוטיפ FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>CD28 אנטי אנושי SAFIRE</td><td>Purified Biogems</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL4</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL12 p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo מוכן אנטי אנושי IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; IFN-וגמא מטוהרים אנטי-אנושיים;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, קרלו ארבה בדרגה אנליטית</td><td></td><td>479687</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, הקסהידרט, ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>Tris, טהור במיוחד, 99.9%</td><td>MP Biomedicals</td> טהור <td>819620</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>חלופה NP-40 (נונילפניל פוליאתילן גליקול)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז זה הוא אבקה. להכנת תמיסה של 100 x יש לדלל ב -1 מ"ל מים בדרגת ביולוגיה מולקולרית.</td></tr><tr><td>חרוזי אימוביליזציה הפוכה של פאזה מוצקה מגנטית: חרוזי AMPure XP</td> ערכת טיהור PCR <td>של בקמן</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>ערכת הכנת ספריית ה-DNA של Nextera (טרנספוזאז TDE1 ומאגר TD)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 התחלה חמה HiFi PCR Master Mix</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR ירוק I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CFX Connect PCR בזמן אמת&nbsp; זיהוי&nbsp; מערכת</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>מאסטר מיקס עבור qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>פלואורומטר קיוביט 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>מגנט לצינורות אפנדורף</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגת קירור דלי נדנדה עם הדליים לצינורות בז של 15 מ"ל וצינורות אפנדורף</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>יכול להיות מספקים אחרים. חשוב שיהיו לו דליים לצינורות אפנדורף.</td></tr><tr><td>תרמו-שייקר</td><td>MRC</td><td></td><td>יכול להיות מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>רגישות גבוהה D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>רגישות גבוהה D1000 ריאגנטים</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 מערכת TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>פלטפורמה מבוססת קלטת עבור &nbsp; אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>ערכת DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>מגיב עבור ניתוח TapeStation ברגישות גבוהה</td></tr><tr><td>שם ורצף פריימר</td><td>Ad1_noMX חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad1-noMx: 5'-P5 רצף-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.1_TAAGGCGA</td></tr>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.1_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.2_CGTACTAG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.2_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.3_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.4_TCCTGAGC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.4_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.5_GGACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.5_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.6_TAGGCATG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.6_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.7_CTCTCTAC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.7_expected רצף אינדקס נקרא: 5'-P7 רצף-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.8_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.9_GCTACGCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.9_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.10_CGAGGCTG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.10_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.11_AAGAGGCA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.11_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.12_GTAGAGGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.12_expected רצף אינדקס נקרא: 5'-P7 רצף-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.13_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.14_ACCACTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.14_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.15_TGGATCTG</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.15_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.16_CCGTTTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.16_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.17_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>רצף אינדקס Ad2.18_expected קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.19_AGGTTGGG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>רצף אינדקס Ad2.19_expected נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.20_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.21_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.22_TGGTCACA</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.22_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.23_TTGACCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.23_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.24_CCACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.24_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'F1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-CCTTTTTTTTTTTGCCCATACACTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג t אנושי ראשוני על ידי האטא ק-seq

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

וזמינותו של כרומטין Transposase נגיש עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה לצורך זיהוי פתוח מחוזות כרומטין (נגיש). אזורים אלה מייצגים רגולטוריות DNA אלמנטים (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, לוקוס שליטה אזורים, insulators) שעתוק אילו גורמים איגוד. מיפוי הנוף כרומטין נגיש היא גישה רב-עוצמה לרכיבים שיגורי רגולציה פעילה ברחבי הגנום. מידע זה משמש גישה לא משוחדת על גילוי הרשת של גורמי שעתוק הרלוונטיים ומנגנונים של הכרומטין המפקחים על תוכניות ביטוי גנים. האטא ק-seq היא חלופה חזקה ורגיש DNase אני ניתוח רגישות יתר בשילוב עם הדור הבא רצפי (DNase-seq) ובידוד פורמלדהיד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם-seq) לניתוח ברמת הגנום של כרומטין נגישות וכדי הרצף של נוקלאז רגיש micrococcal אתרים (MNase-seq) כדי לקבוע את מיקום נוקלאוזום. אנו מציגים פרוטוקול האטא ק-seq מפורט ממוטב עבור החיסון האנושית ראשי תאי CD4 + כלומר לימפוציטים (T helper 1 (Th1) ותאים Th2). פרוטוקול מקיף זה מתחיל עם תא הקציר, מתאר את ההליך מולקולרית של כרומטין tagmentation, הכנת הדוגמא עבור הדור הבא רצפי, ואז כולל גם שיקולים הבדיקות חישובית נהגה ושיטות לפרש את התוצאות. יתר על כן, כדי לחסוך זמן וכסף, הצגנו את אמצעי בקרה כדי להעריך את ספריית האטא ק-seq לפני רצף. חשוב, העקרונות שהוצגו פרוטוקול זה מאפשר שלה ההסתגלות אחרים תאים ראשי אנושיים של המערכת החיסונית, הלא-החיסון, שורות תאים. קווים מנחים אלה גם יהיה שימושי עבור מעבדות אשר אינם בקיאים בשיטות הדור הבא רצפי.

התוצאה הסופית של פרוטוקול זה הוא ספריה האטא ק-seq של בדרך כלל 3-20 ng/µL. מתי לרוץ על מערכת עבור ניתוח שלמות הדנ א (ראה טבלה של חומרים/ציוד), הם מציגים מראה כמו סולם2 (איור 3 א). הגודל הממוצע של קטעי DNA היא בדרך כלל bp ~ 450-530.
בקרת איכות נאותה של ספריות האטא ק-seq לפני שתבצע הדור הבא רצפי חשוב לחסוך זמן וכסף. אנו רואים את הספריות מתאים הדור הבא רצפי (הגדר...

וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

המטרה הכוללת של שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה באמצעות טרנספוזאז היא לזהות אזורי כרומטין נגישים בגנום האנושי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים האפיגנומיים כגון מיקומים ברחבי הגנום של אלמנטים רגולטוריים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא חזקה, קצרה יחסית ודורשת פחות חומר התחלתי ביחס לשיטות אחרות למדידת נגישות כרומטין כגון DNase-seq או FAIRE-seq.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הנוף הרגולטורי של לימפוציטים T אנושיים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון תאים ראשוניים אנושיים אחרים, תאים סרטניים, דגימות קליניות אנושיות, תאים מיונקים ואורגניזמים אחרים. הפשירו מינון של מיליליטר אחד של 10 מיליון PBMCs אנושיים והעבירו אותו לצינור של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום RPMI משלים. הם, צנטריפוגה של התאים ב -500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב -15 מיליליטר של מדיום RPMI בתוסף. לאחר מכן, העבירו את התאים לבקבוק תרבית T-75 ודגרו אותם למשך הלילה עם לחות. למחרת, העבירו את התאים הצפים עם פיפטה סטרילית של 25 מיליליטר לצינור של 50 מיליליטר.לאחר מכן, ספרו את התאים החיים באמצעות אי הכללה כחולה של טריפאן. לאחר מכן, בודדו את התאים החיוביים ל-CD4 מ-10 מיליון PBMCs חיים שאינם נדבקים באמצעות עמודת הפרדת מיקרו-חרוזים. לאחר בידוד התאים, צלחת והפעל את תאי ה-T בתנאי קיטוב Th1 ו-Th2 בהתאם לפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן בודד את גרעיניהם.כדי להיות, הכינו מאגר ליזה טרי ושמרו אותו מקורר על קרח. כמו כן, לקראת תגובת הטרנספוזיציה, יש לחמם שייקר תרמי ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, טען חצי מיליון תאי T לתוך מיקרו-צינורות של 1.5 מיליליטר וסובב אותם ב-500 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS קר וחזרו על מחזור הסיבוב, אך כעת השעו את התאים במיליליטר אחד של מאגר ליזה קר. ערבבו את התאים עם פיפטינג עדין כדי למנוע מהגרעינים להיפגע יותר מדי. לאחר מכן, קח במהירות 10 מיקרוליטר כדי לצפות בחלק התאים.הקפידו לשמור על התאים קרים ולעבוד במהירות. תוך חמש דקות, המשך בתגובת הטרנספוזיציה. כדי להתחיל, העבירו 100,000 גרעינים למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר וסובבו את הדגימה ב-500 Gs למשך 10 דקות בצנטריפוגה קרה.לאחר מכן, הסר בעדינות את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף את רכיבי תגובת הטרנספוזיציה לגרעינים. לאחר מכן, השעו מחדש את הגרעינים עם פיפטינג עדין ודגרו את הגרעינים על השייקר התרמי ב-500 RMP למשך 30 דקות כדי להשלים את תגובת הטרנספוזיציה.לאחר מכן, בצע שלב ניקוי DNA והוציא את שברי ה-DNA ב-20 מיקרוליטר של Tris hydrochloride. לאחר מכן, השתמש ב-PCR כדי לבצע הגברה ראשונית של ספריות ריצוף ATAC. לאחר מכן, העריכו את המספר האופטימלי של מחזורים נוספים הדרושים להגברה הסופית על ידי PCR כמותי.מהתוצאות הנמדדות, קבע את מספר המחזורים הדרושים להגברת ה-PCR הסופית של ספריות ריצוף ATAC. לאחר מכן, בצע את ההגברה הסופית. הגדרת גודל אופטימלי של מקטעי ספריית DNA יכולה לשפר את ריצוף הדור הבא.ראשית, חממו את החרוזים המגנטיים לטמפרטורת החדר והכינו אתנול טרי של 70% במים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף מים נטולי נוקלאז לספריות ריצוף ATAC לנפח של 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים קושרים DNA תלויים.הכניסו את החרוזים לתוך הדנ"א לפחות 10 פעמים והמתינו חמש דקות. אם טיפות חרוזים נתקעות על דופן הצינור או המכסה, סובב בקצרה את הצינור. כעת, הניחו את הדגימה ליד המגנט למשך שתי דקות, ואז העבירו את הסופרנטנט למיקרו-שפופרת חדשה.מדוד את נפח האוסף והוסף נפח של 70% של מתלה חרוזים מגנטי. מערבבים את החרוזים כמו קודם ונותנים להם לדגור במשך חמש דקות לפני שתמשיך. לאחר מכן, הפרד את החרוזים באמצעות המגנט למשך שתי דקות וכעת השליך את הסופרנטנט.בעודך נגד המגנט, הוסף לחרוזים 200 מיקרוליטר של אתנול 70%. המתן 30 שניות ואז השליך את האתנול וחזור על שטיפת האתנול פעם נוספת. סיים את השטיפות על ידי הסרה מוחלטת של האתנול שנותר ומתן לחרוזים להתייבש באוויר במשך חמש דקות על המגנט.במידת הצורך, סובב בקצרה את הצינור ושאף החוצה כל אתנול גלוי עם פיפטה של 10 מיקרוליטר. כעת, הסר את הצינור מהמגנט והוסף 22 מיקרוליטר של טריס הידרוכלוריד. לאחר שתי דקות, החזר את הצינור למעמד המגנטי ותן לתמיסה להתנקות.לאחר מכן, אספו 20 מיקרוליטר של אלואט המכיל את הספרייה המוכנה ואחסנו אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה מייצר ספריות ריצוף ATAC שהן בדרך כלל שלושה עד 20 ננוגרם למיקרוליטר. כאשר הם מופעלים על מערכת לניתוח שלמות ה-DNA, יש להם מראה דמוי סולם.בין היתר, בקרת איכות חשובה נוספת היא העשרת הבקרות החיוביות. יחסית לבקרות השליליות, יש להעשיר את זוג הפריימר שלוש לפחות פי 25, ואת זוג הפריימר ארבע יש להעשיר לפחות פי 75. לאחר 10 מיליון קריאות ראשוניות, אם הדגימה עוברת את כל הפרמטרים המכריעים בקובץ דוח FastQC, ומתקבלות 1,000 עד 2,000 שיאים מקריאת שיא, ניתן לרצף את הספרייה בצורה עמוקה יותר עבור יותר מ-30 מיליון קריאות.מספריות העומדות בתקני האיכות, רק שישה עד 20% מהקריאות ממופות לגנום המיטוכונדריאלי. שאר הקריאות הייחודיות מפות את הגנום האנושי הייחוס ושבעה עד 12% נמצאים בשיאי ריצוף ATAC. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריות ATAC-seq, להגיש ולספק רצף מנות ולנתח את הנתונים שהתקבלו.לאחר השליטה, הכנת ספריית ATAC-seq יכולה להיעשות תוך יום עבודה אחד או שניים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאולי תצטרך תחילה לבצע אופטימיזציה של כמה שלבים כמו מספר התאים והרכב מאגר הליזיס בשלב בידוד גרעינים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כרומטין אימונו-משקעים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזה גורם שעתוק נקשר לאזורי הכרומטין הפתוחים בדגימות שנבדקו?

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת המשקעים החיסוניים של הכרומטין כדי לזהות אתרי קישור חלבונים באזורים ספציפיים של הדנ"א הגנומי של תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים באמצעות משקעים חיסוניים סלקטיביים של מקטעי כרומטין הקשורים לחלבון. שיטה זו מסייעת לחקור את האינטראקציה של מספר חלבונים רגולטוריים, כולל גורמי שעתוק המעורבים בבקרת גנים.

משקעים חיסוניים של כרומטין לזיהוי אתרי קישור חלבוני מטרה בדנ"א גנומי

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

רכיבים רגולטוריות דנ א, כגון מוצרי טיפוח טבעיים, לשלוט ביטוי גנים פיזית שעת היעד ג'ין היזמים, לרוב באמצעות אינטראקציות כרומוזומלית ארוכי טווח הנמשכים מרחקים גדולים גנומית. יזם ללכוד Hi-C (PCHi-C) מזהה אינטראקציות משמעותיות בין היזמים ואזורים הדיסטלי, המאפשר את ההקצאה של פוטנציאל רגולטוריות רצפי הגנים היעד שלהם.

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.

ATAC-Seq ספציפי לאדיפוציט עם רקמות שומן באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להכנת ספריית ATAC-seq של נויטרופילים ממח עצם עכבר, במטרה להבטיח כדאיות אופטימלית של נויטרופילים ואיכות ספרייה גבוהה. הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על הכנת BMC, מיון אימונומגנטי ובניית ספרייה, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים לחקר נויטרופילים.

הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.

פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4

אנו מתארים כאן גישה מהירה ופשוטה יחסית למיפוי תזמון שכפול יונקים ברחבי הגנום, מבידוד תאים ועד לניתוח בסיסי של תוצאות הריצוף. מפה גנומית של תוכנית שכפול מייצגת תסופק בהתאם לפרוטוקול.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

למד את פרוטוקול ATAC-seq לזיהוי אזורי כרומטין נגישים בגנום האנושי. השיטה מיועדת ללימפוציטים T אנושיים ראשוניים ומספקת תובנות לנוף הרגולטורי האפיגנטי.

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

גלה סרטונים נוספים