Name: שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: חקור מדידת pH תוך-תאי בתאי זקיק בשחלה חיה של Drosophila באמצעות חיישן פלואורסצנטי ודמייה כמותית. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת השינויים ב-pH על התנהגות תאי גזע בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Bryne Ulmschneider על תרומתה הפרוטוקול ואת מספרה דיאן לקבלת הצעות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי מכון הלאומי של בריאות גרנט GM116384 Nystul ת. ג, די. אל הספר.

הערה: כדי למדוד פי בשושלת FSC, לנו לחשב את היחס שבין עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin כדי mCherry, FSCs, pFCs ותאים זקיק בתנאים פיזיולוגיים, ולהמיר את היחס פי ערכים עם תקן עקומות כיול עבור כל תא הקלד 7. הראשון, לחיות ניסויים הדמיה מבוצעות למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של pHluorin ו mCherry ב germaria גזור לתוך מאגר המכיל NaHCO 3, אשר מחקה בתנאים פיזיולוגיים 1 , 7. הבא, רגיל עקומות מופקים על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin ו- mCherry נה +-K + מאגר המכיל את nigericin ionophore חינם, התרגלו שני ערכי pH שונים, 6.5 ו- 7.5. בנוכחות nigericin, פי equilibrates עם ה-pH של המאגר על פני קרום פלזמה, גורם פי להתאים את ה-pH חוץ-תאית. לבסוף, העיקולים רגילים משמשים כדי להמיר pHluorin mCherry יחסי לערכים פי המשוער.
 1. קדם משפט: הכנה לפני מדידה פי Vivo ב הערה: כדי למדוד פי ויוו, חייב להביע את transgene mCherry::pHluorin בסוג התא עניין. להלן כמה דרכים נפוצות כדי ליצור pHluorin הטרנסגניים זבובים בשושלת FSC. יצירת שיבוטים mCherry::pHluorin שימושי במיוחד לזיהוי FSCs, אשר ממוקמים בקצה הקדמי שיבוט FSC. רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי שימושי למדידת פי על פני הרקמה כולה, והוא גם נוח יותר בעת שילוב עם ביטוי של RNAi או transgene.
<ol><li>דור של pHluorin הטרנסגניים זבובים <ol><li>mCherry::pHluorin-ידי FSC שיבוטים <ol><li>כדי להפוך mCherry::pHluorin FSC שיבוטים, חצו UAS-mCherry::pHluorin 1 flipout Act-Gal4 במלאי או אחרים מניות עם Gal4 inducible Flp/והשפלתם.</li>
			<li>כדי להפוך heatshock inducible שיבוטים, heatshock F1s למבוגרים במשך יומיים לפרסם וגיחתו ב ריקה vials h 1 בתוך אמבט מים 37 ° C, ארבע פעמים כ כל ה 12</li>
			<li>כדי להבטיח צמיחה רגיל שיעור מרבי של oogenesis בתקופה זו, לשמור על זבובים על-ידי מתן שמרים רטובה (בחלקים שווים בקירוב יבש בייקר &#39; s שמרים ומים) מדי יום במשך לפחות 6 ימים לאחר אינדוקציה שיבוט.</li>
		</ol></li> <li>רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי</li> <li>קרוס UAS-mCherry::pHluorin 1 כדי זקיק תא מנהל ספציפי, 1 w y *; P {GawB} 10930/ארגון הקתולים הצעירים (בלומינגטון מזהה: 7023).</li>
		<li>3 ימים לאחר זבובים להתחיל eclosing, לאסוף ומניחים בקבוקונים המכילים שמרים רטובה, במשך לפחות 24 שעות לפני ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>שהופך פתרונות הערה: חשוב להכין המאגרים הבאים ביום של הניסוי, כי ריכוז ה-pH ו ממס במאגר יכולים להשתנות לאורך זמן.
	<ol><li>הכן ביקרבונט, nigericin, ניתוח מאגרי. הוסף הרכיבים לפי הסדר הרשום כדי למנוע היווצרות פוחת משקעים (עיין טבלה 1, בטבלה 2 של טבלה 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. משפט: מדידת פי בשושלת FSC הערה: הקרע, הרכבה והדמיה חי את השלבים עבור המאגר ביקרבונט ותנאי מאגר nigericin שני ייתכן שתצטרך לבצע פעמיים: פעם אחת כדי לקבוע את המיקרוסקופ הגדרות של פעם נוספת כדי לאסוף נתונים ניסיוני. עיין בסעיף 2.2 להלן לקבלת מידע נוסף.
<ol><li>לנתיחה, הרכבה הערה: החומרים הדרושים לביצוע שלב זה עיין באיור 1 ו לטבלה של חומרים. עבור הרכבה מודפס 3D צ'יימברס, ניתנים הקבצים במדפסת תלת-ממד כמו משלימה קובץ 1 ו- 2 קובץ משלים.
	<ol><li>ניתוח: <ol><li>הכן צ'יימברס גובר על-ידי החלת ציפוי דק של גריז ואקום לצד להחמיא של 3D מודפס הרכבה קאמרית. למקם את הצד הזה coverslip 22 x 40 מ מ כדי לאטום את coverslip אל התא הרכבה.</li>
		</ol></li> <li>לנתח השחלות של נקבות הזבוב הבוגר במאגר 500 µL לנתיחה (ביקרבונט או nigericin מאגר, טבלה 3) <ol><li>עזים ומתנגד 3-4 זבובים באמצעות גז 2 CO וזבובים העברה על גבי משטח לטוס perfused עם CO 2 גז-</li>
			<li>להרים של זבוב anesthetized עם מלקחיים ומקום לתוך כלי התקשורת לנתיחה.</li>
			<li>לצבוט את בית החזה של הזבוב עם forcep אחד, בזמן המשוחררים על קצה הבטן שלה עד השחלות שלה חשופים.</li>
			<li>לאחר ניתוק השחלות מן האיברים האחרים, להקניט לגזרים את ovarioles באמצעות 22 1/2 מחטי מזרקים. מעטפת השריר בקפידה נפרד מן השחלות נפרד ovarioles בודדים מהאשכול של ovarioles. טכניקה יעילה כדי לבודד למעטפת השרירים היא להשתמש מחט מזרק אחת כדי להחזיק את האשכול של ovarioles במקום בקצה הקדמי שלו, ולטף כלפי מטה לאורך יחיד ovarioles.</li>
			<li>דגירה את שחלות והטרף בתקשורת לנתיחה בדיוק 10 דקות לפני שתמשיך לשלב הרכבה על כך שאין מספיק זמן פי תאים equilibrate באופן מלא עם ה-pH של התקשורת דיסקציה nigericin. 
			הערה: ודא כי נדן שריר מוסר את ovarioles. שריר נדן עשוי להחליש את האות פלורסצנטיות, מה שהופך את זה קשה לזהות תאים בודדים באמצעות Concanavilin-A, עלול לגרום ovarioles להעביר באופן ספונטני במהלך דימות בשידור חי-</li>
		</ol></li> <li>הרכבה <ol><li>מקום טיפה קטנה של מדיה דיסקציה coverslip זכוכית בתוך החדר הרכבה.</li>
			<li>העברת מופרדים באמצעות מלקחיים ovarioles.</li>
			<li>להפריד תאי ביצה בשלב מאוחר יותר germaria המשויך צ'יימברס ביצה בשלב מוקדם יותר, ולנסות להבטיח germaria גזור ממוקמים במרכז הירידה מדיה לנתיחה.</li>
			<li>להוסיף 2 טיפות קטנות של לק צידי coverslip 12-מ מ עגול, לתת לו אוויר יבש כ-10 ס</li>
			Coverslip <li>מקום בסיבוב על המסירה של דיסקציה המדיה המכילה מופרדים germaria כך את הצד הזה עם לק פונה כלפי מטה ואנשי קשר התקשורת לנתיחה. לחץ כלפי מטה החלקים של הקצה עם לק לשטח ולאבטח את germaria בעמדה. אנו ממליצים על שימוש לק בוגרים כי זה מכפיש פחות על coverslip פני כמו זה המאובטחת במקום.</li>
			<li>למלא תא הרכבה עם מדיה נוספים לנתיחה. מאגר ספציפי תנאי שאינו מכיל צבע Concanavalin-A יכול לשמש כדי למלא התא. 
			הערה: הזמן הכולל בילה לנתח, הרכבה לא יעלה על 15 דקות. זה חשוב למזער את ההשפעות של נזק לרקמות ותא מוות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>הדמיה בשידור חי: הערה: בשלב זה, קודם לאסוף תמונות מן התנאי ביקרבונט, שני תנאים nigericin כדי לקבוע את הגדרות מיקרוסקופ נכונה; לכוונן את הגדרות מיקרוסקופ לפי הצורך, . ולאחר מכן לאסוף תמונות עבור המידע מהניסוי השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי המסוגל הדמיה 3 ערוצים: GFP (פליטת עירור 475/509), mCherry (575 פליטה עירור/610), ואת מרחיקת אדום (633 עירור/647 פליטה). 
	הערה: ערכת מיקרוסקופ הגדרות: ניתן לכמת עוצמות פיקסל תמונות שנאספו כדי לקבוע את ההערכות של pHi, לכן חשוב כי ערכי העוצמה של האות בערכת כל תמונה היא לא נמוכה מדי ולא רוויים. טווח ממידות ניתן ללכוד תמונה מוגדרת על-ידי עומק הסיביות התמונה. במקרים רבים, תמונות של 8 סיביות נוצרות כברירת מחדל, אך אנו ממליצים על רכישת הנתונים כתמונות 16 סיביות, אשר יש טווח דינאמי רחב יותר. חשוב להבטיח כי crosstalk בין ערוצי פלורסנט ממוזער, אז צריך ניתן להתאים את ההגדרות כך ספקטרום הפליטה שנאסף בכל fluorophore לא חופף. כדי לבדוק את הגדרות אלה, קח תמונה לדוגמה באמצעות הקשת עירור GFP ולאסוף ספקטרום הפליטה של mCherry, ולהיפך. אם ההגדרות הותאמו כהלכה, צריך להיות בלי קליטה בכל מקרה. קבע את הגדרות מיקרוסקופ (כלומר, הגדרות מתח על סריקתה לייזר קונפוקלי, גודל הכוח ואת חריר לייזר) כך פיקסל עוצמות האות כל תמונה שלוש ערכות הם בתוך הטווח הדינמי של קובץ התמונה. עבור כל הניסויים שלנו, השתמשנו לייזר אור לבן מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד 40 x סורק כדי לרכוש תמונות 16 סיביות בתבנית 1,024 × 1,024, בעוד אנחנו ממוטב מתח הרווח עבור כל ניסוי לפי הצורך. לדוגמה, בניסוי אחד, נוכל להגדיר את הרווח מתח עבור ה-GFP, mCherry, ו מרחיקת אדום כמו 37.8%, 72.9% ו- 260%, בהתאמה.
	<ol><li>התמונה ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 6.5, והתאם את הגדרות כאלה פיקסל עוצמות של תמונות pHluorin ו- mCherry נמוכים, אך לא מתחת לגבולות של זיהוי של המצלמה.</li>
		<li>תמונה קבוצה נוספת של ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 7.5 והתאם את ההגדרות כאלה עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry הם גבוהה, אבל לא רוויים.</li>
		<li>השחלות תמונה של ביקרבונט לנתיחה מאגר ולהבטיח כי עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry לא רוויים עם ההגדרות שבחרת. אם הפיקסלים רוויים, להתאים את ההגדרות לפי הצורך. 
		הערה: מיקרוסקופ הגדרת פרמטרים עשויות להשתנות בהתבסס על הכיוונון מיקרוסקופ המדויק בשימוש, חייב להיות אופטימיזציה עבור ניסוי. לאחר מיקרוסקופ הוגדרו הגדרות, אל תשנה אותם לאורך כל הניסוי. הגדרות צריכות להיות עקביים על-פני שליטה ומצבים ניסיוני. בניסויים פי הראשונית שלנו, אנחנו שנוצר 2 ו 3 עקומות כיול נקודת nigericin ומצא הבדל משמעותי בין פי מחושב באמצעות כל אחת מהשיטות. עם זאת, באופן כללי, התוספת של יותר נקודות בתוך עקומת כיול יהיה צפוי לשפר את דיוק. לכן, אנו ממליצים להפקת העקומות עם מספר שונה של נקודות כדי לקבוע כמה נדרשים קבוצה נתונה של תנאי הניסוי-</li>
	</ol></li> <li>איסוף נתונים: <ol><li>לבצע ניתוח, הרכבה, והדמיה של הדגימות בתנאים מאגר ביקרבונט ו- nigericin. לאחר ניתוח, הרכבה, הזמן המרבי הדמיה ערכה אחת של דגימות לא יעלה על 45 דקות על מנת להבטיח כי המדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עשויים ברקמת בשידור חי, בריא.</li>
		<li>עבור כל תנאי, לרכוש תמונות לפחות 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. שלאחר המשפט: ניתוח תמונות <ol><li>למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב FSCs, pFCs, ותאים זקיק <ol><li>רקע חיסור: <ol><li>פתוח לא מעובדת תמונות בפיג'י עם כל ערוץ (בחלון נפרד איור 4C).</li>
			<li>השתמש בכלי מלבן כדי לצייר אזור בעל עניין (ROI) בחלון ערוץ pHluorin בחלק של התמונה ללא האות.</li>
			שלב <li>אופציונלי: להגדיר את הגבול התחתון של הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע הם לא נכלל והגדר את הגבול העליון של הסף המרבי. הסף מוגדר באופן זה, האזורים של התמונה ללא האות הם בעיקר כחול, האות הוא נראה בבירור ( איור 4A).</li>
			<li>למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של רועי. אם הסף הוגדר בשלב 3, הקפד לבדוק &#34; הגבלה על סף &#34; תיבה בתיבת הדו-שיח הגדרת המידות.</li>
			<li>להפחית את עוצמת רקע נמדד מן הערוץ כל פרוסה של התמונה באמצעות הפונקציה הפחת, נמצא בתהליך &#8594; תפריט במתמטיקה-</li>
			<li>חזור על צעדים 3.1.1.2-6 עבור החלון ערוץ mCherry חוץ מזה, בשלב 3.1.1.2, במקום ציור מלבן חדש עם הכלי מלבן, השתמש בפונקציה הבחירה שחזור, נמצאו ערוך &#8594; תפריט הבחירה, כדי להוסיף מלבן עם אותם המידות והמיקום על התמונה.</li>
		</ol></li> <li>FSCs לזהות, pFCs ותאים זקיק: <ol><li>לזהות את FSCs, pFCs ותאים זקיק לפי תאור ומיקום באמצעות ההכתמה Concanavalin-A כדי למצוא תא לגבולות התא ( איור 2).</li>
			<li>FSCs הם תאים משולשים דקים ממוקם על קצה germarium בגבול אזור 2a/2b. אם mCherry::pHluorin מתבטאת של שיבוט FSC, FSC גם ניתן לזהות של התא הקדמי ביותר של השיבוט.</li>
			<li>pFCs הם תאים בצורת לא סדיר ב אזור 2b, מיד בסמוך ויוצאת של FSCs.</li>
			<li>זקיק תאים הם תאים מרובע או טורי המקיפים ציסטה תא הנבט 3 אזור.</li>
		</ol></li> <li>קבלת קרינה פלואורסצנטית יחסי העוצמה <ol><li>בחרו פרוסה אחת או יותר שבו התא של עניין יש עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה בערוץ mCherry ולוודא כי כתמים Concanavalin-A, ראיתי בערוץ מרחיקת אדום, יש foc אותנו בתוך הפרוסה שנבחר.</li>
			<li>לצייר רועי סביב כל FSC ולמדוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע pHluorin ו mCherry כל פרוסות שבחרת למדידות.</li>
			<li>לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע בערוץ pHluorin על ידי עוצמת קרינה פלואורסצנטית אכזרי של הערוץ mCherry כדי לחשב יחס של pHluorin כדי mCherry זריחה.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Derive פי ערכים, ליצור תמונות pseudocolored <ol><li>Derive פי ערכים <ol><li>בכל המקרים, העקומה רגרסיה ליניארית צריך להיווצר באמצעות שימוש השחלות מהזבובים של גנוטיפ באותה לשניהם ניסיוני ולשלוט תנאים. יוצרות עקומה רגרסיה ליניארית לכל סוג התא באמצעות הנתונים nigericin שני מאגר תנאים ( איור 3). ב- Excel, זה יכול להיעשות על-ידי התוויית הנתונים על גרף והוספת קו מגמה ליניארי. לחלופין, לראות:</li> <li>שימוש המדרון וחיתוך y של העקומה רגרסיה ליניארית שמחושבים התנאים nigericin, המשוואה של קו (y = mx + b) כדי להמיר את pHluorin mCherry יחס ערכי שמחושבים דוגמאות ביקרבונט מצב ערכי pH. במשוואה הזו, תחליף את הטופס מדרון (החיתוך-y) b, לשים את הערך יחס עבור x ו לפתור עבור י'</li>
		</ol></li> <li>ליצור תמונת pseudocolored המשקף את ערכי יחס בפיג'י.
		<ol><li>בצע ההליך לעיל על רקע חיסור (שלב 3.1.1 ואיור 4).</li>
			<li>לחלק את הערוץ pHluorin מערוץ mCherry באמצעות הפונקציה תמונת מחשבון, למצוא בתפריט תהליך. ודא &#34; יצירת חלון חדש &#34; ו &#34; 32-bit (float) תוצאה &#34; תיבות סימון מסומנות שתיהן. לשנות את טבלת בדיקת מידע (LUT), נמצאו תחת תפריט תמונה, תרמית או LUT של בחירה. ראה איור 4 אפשרויות מתאימים אחרים.</li>
			<li>כוונון הבהירות והניגודיות בתיבת הדו-שיח (תמונה &#8594; התאם &#8594; בהירות/ניגודיות), לחץ על &#34; להגדיר &#34; לחצן. קבע המינימום מוצג הערך 0 ותוצג המרבי ערך לכל יחס הטובים ביותר לוכדת את הנתונים, בדרך כלל 1.0-2.0 ( איור 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
<li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
<li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li>
<li>Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li>
<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+pH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ovary%3A+an+active+stem+cell+community%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+stem+cell+niches%3A+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila%3A+themes+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev.+of+Gen%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li>
<li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia%3A+parallels+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li>
<li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li>
<li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה למדידת על פי של תאים בשושלת FSC בתוך רקמת wildtype. פרוטוקול זה פותחה, מעודן בחמש השנים האחרונות, מאז אנחנו הראשונים החלו ללמוד פי ברקמת השחלה דרוזופילה . במהלך זמן זה, הפרוטוקול שימש בהצלחה על ידי מספר חוקרים במעבדה שלנו, על פחות ארבעה דיסק מסתובב שונים ועל סריקת מיקרוסקופ לייזר. הפארמצבטית ההתבוננות שלנו המקורי, כי גדל פי כמו תאים בשושלת FSC להבדיל מתא גזע טוראי המדינה תא זקיק, על פני אלה ניסויים מרובים מדגים הן תופעה ביולוגית זו היא חזקה וזה המתודולוגיה היא אמינה. עם זאת, מניסיוננו, זהו ת...

מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות3, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .
כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי8. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.
כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית12 , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה15,germarium16. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק2. חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 Flipout stock</td><td>Center Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals for Buffer Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>השתמש לייצור KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>השתמש לייצור KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 מצומד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>C21421</td><td>0.25 מ"ג/מ"ל דילול</td></tr><tr><td>ניגריצין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק</td><td>><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>כלי חיתוך והרכבה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 דומונט מלקחיים של Inox (גודל 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 מחטי מזרק 23 מד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חיתוך זכוכית 9 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 מ"מ כיסויי זכוכית Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים, קוטר 12 מ"מ, עובי 0.13-0.16 מ"מ</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>תא הרכבה תלת מימדי</td><td>מותאם אישית מיוצר</td><td></td> <td>קבצי stl ו- .ipt עבור מדפסת תלת מימד כלולים כקבצים משלימים</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>ציוד אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>13-620-183A</td><td>דגם: מיקרוסקופ דיסקציה Accumet AB15</td></tr><tr><td></td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>דגם: SZ2-ST</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 או SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם 40 פעמים; מטרה עם צמצם מספרי של 1.3</td></tr></tbody></table>

שיטות הדמיה תאיים ph של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שינויים ב- pH תאיים (פי) תפקיד חשוב בוויסות תאיים רבים, כולל מטבוליזם, התפשטות של בידול. בדרך כלל, דינמיקה פי נקבעים בתאים בתרבית, אשר נתונות מדידה וטיפול השפעול pHi. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיות וכלים חדשים איפשרה בחקר דינמיקה פי בתוך רקמת ללא פגע, בשידור חי. דרוזופילה מחקר, פיתוח חשוב אחד היה הדור של קו הטרנסגניים נושאת ביוסנסור על פי, mCherry::pHluorin. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בהם אנו עושים שימוש שגרתי הדמיה ovarioles דרוזופילה בשידור חי כדי למדוד את פי בשושלת זקיק אפיתל תאי גזע (FSC) בקווים הטרנסגניים פראי סוג mCherry::pHluorin; עם זאת, בשיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות בשביל לרקמות אחרות, כולל דיסקים כנף עין האפיתל. אנו מתארים שיטות לביטוי mCherry::pHluorin בשושלת FSC, שמירה על רקמות השחלה במהלך חיים הדמיה, ואת רכישת וניתוח תמונות כדי להשיג פי ערכי.

כאן תארנו את התהליך של מדידת פי בתוך האפיתל זקיק, אשר כרוך במספר שלבים. ראשית, השחלות הן גזור מהזבובים של גנוטיפ המתאים באמצעות כלים לנתח, הרכבה (איור 1). Ovarioles ואז הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות כמותית, הדימויים מנותחות לקבל מדידות של פי פי. עבור כל תמונה, סוגי תאים עניין מזוהים כמתואר בסעיף 3.1 (איור 2). היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים GFP, mCherry מומר על פי ערכים באמצעות עיקול רגיל (<strong class="xfig"...

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ה-pH התוך תאי של תאי זקיק בתוך רקמת שחלה דרוזופילה חיה. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתאי גזע וביולוגיה התפתחותית כגון, כיצד שינויים ב-pH התוך-תאי תורמים להחלטות סולפט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לכמת במדויק את ה- pH בתוך רקמה חיה שלמה.כדי להתחיל בניסוי, הכינו תאי הרכבה על ידי מריחת ציפוי דק של שומן ואקום על הצד השטוח יותר של תא הרכבה מודפס בתלת מימד. הנח את הצד השטוח יותר על החלקת כיסוי בגודל 22 x 40 מילימטר כדי לאטום את החלקת הכיסוי לתא ההרכבה. לאחר מכן, נתחו את השחלות מנקבות זבובים בוגרים ב-500 מיקרוליטר של מאגר דיסקציה.הרדמו שלושה עד ארבעה זבובים באמצעות גז CO2 והעבירו את הזבובים למשטח זבובים. השתמש במלקחיים כדי לבחור זבוב ולהניח אותו באמצעי החיתוך. צבטו את בית החזה של הזבוב עם זוג מלקחיים אחד תוך כדי משיכה בקצה הבטן שלו עד שהשחלות שלו נחשפות.הגדר טיימר ל-10 דקות בדיוק. לאחר ניתוק השחלות מהאיברים האחרים, הפרידו את השחלות באמצעות מחטי מזרק בגודל 22 וחצי. השתמש במחט מזרק אחת כדי להחזיק את אשכול השחלות במקומו בקצהו הקדמי וללטף כלפי מטה לאורך השחלות הבודדות כדי להפריד בזהירות את מעטפת השריר מהשחלות.דגרו את השחלות המנותחות באמצעי דיסקציה למשך שארית הזמן על הטיימר. חשוב שהשחלות יישארו באמצעי הדיסקציה למשך 10 דקות בדיוק כדי לספק מספיק זמן לתאים. הנח טיפה קטנה של מדיית חיתוך על החלקת מכסה הזכוכית בתוך תא ההרכבה.העבירו את השחלות המופרדות באמצעות מלקחיים. הפרד תאי ביצים בשלב מאוחר יותר מגרמריה הקשורה לתאי ביצים בשלב מוקדם יותר וודא שהגרמריה המנותחת ממוקמת במרכז טיפת אמצעי הדיסקציה. הוסיפו שתי טיפות קטנות של לק לצדדים מנוגדים של כ-12 מילימטר והניחו לו להתייבש באוויר למשך כ-10 שניות.הנח את החלקת הכיסוי העגולה על טיפת חומר החיתוך המכיל גרמריה מופרדת, כך שהצד עם הלק פונה כלפי מטה ויוצר קשר עם אמצעי הדיסקציה. לחץ כלפי מטה על הקצוות כדי לשטח ולהדק את הגרמריה במקומה. מלא את תא ההרכבה במדיית חיתוך נוספת ועבור להדמיה חיה.תמונה שחלות במאגר דיסקציה ב-pH 6.5. התאימו את ההגדרות כך שעוצמות הפיקסלים של תמונות pHluorin ו-mCherry יהיו נמוכות, אך לא מתחת לגבולות הזיהוי של המצלמה. לאחר מכן, דמיין קבוצה נוספת של שחלות במאגר דיסקציה של ניגריון ב-pH 7.5 והתאם את ההגדרות כך שעוצמות הפיקסלים של תמונות pHluorin ו-mCherry יהיו גבוהות אך לא רוויות.שחלות תמונה ומאגר חיתוך דו-קרבונט וודא שעוצמות הפיקסלים של תמונות pHluorin ו-mCherry אינן רוויות בהגדרות שנבחרו. אם הפיקסלים רוויים, התאימו את ההגדרות. לאחר בחירת הגדרות הדמיה חיה מתאימות, המשך לאיסוף תמונות של לפחות חמש גרמריה בכל אחד מהתנאים.הפחיתו את הרקע על ידי פתיחת תמונות לא מעובדות בפיג'י עם כל ערוץ בחלון נפרד. השתמשו בכלי המלבן כדי לצייר אזור עניין או החזר השקעה בחלון ערוץ pHluorin וחלק מהתמונה ללא אות. הגדר את הגבול התחתון של הסף כך שפיקסלים עם ערכי עוצמה מתחת לרקע לא ייכללו והגדר את הגבול העליון של הסף למקסימום.כאשר הסף מוגדר בצורה זו, אזורי התמונה ללא אות הם בעיקר כחולים והאות נראה בבירור. אם הסף נקבע, נווט אל תיבת הדו-שיח קביעת מדידות והקפד לסמן את התיבה הגבל לסף. מדוד את עוצמת הקרינה הממוצעת בהחזר ההשקעה, עבור לעיבוד ולאחר מכן לתפריט מתמטי כדי להפחית את עוצמת הרקע הנמדדת מכל ערוץ ופרוסת התמונה באמצעות פונקציית החיסור.חזור על השלבים עבור חלון ערוץ mCherry אך השתמש בפונקציית שחזור הבחירה במקום לצייר מלבן חדש עם כלי המלבן שנמצא בתפריט עריכת בחירה, כדי להוסיף מלבן עם אותם מידות ומיקום בתמונה. בחר פרוסה אחת או יותר שבה לתא המעניין יש את עוצמת הקרינה הגבוהה ביותר בערוץ mCherry וודא שצביעת הקונקנבלין A בערוץ האדום הרחוק, נמצאת במוקד בתוך הפרוסה שנבחרה. לאחר מכן, צייר החזר ROI סביב כל תא גזע זקיק או FSC ומדוד את עוצמת הקרינה הממוצעת של pHluorin ו-mCherry ואת כל הפרוסות שנבחרו למדידות.לבסוף, חלקו את עוצמת הקרינה הממוצעת של תעלת pHluorin בעוצמת הקרינה הממוצעת של תעלת mCherry כדי לחשב יחס בין pHluorin ל-mCherry fluorescence. שתי גרמריה צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי עם UAS mCherry pHluorin ו-10930 gal 4, צבועים במתאר concanavalin A ו-ROI של תאי גזע זקיקים או FSC או PFC ותא זקיק מוצג בכל תמונה. היחס בין עוצמות הקרינה בתעלות GFP ו-mCherry מומר לערכי pH I, באמצעות עקומה סטנדרטית.ה-pH I עולה עם התמיינות בשושלת ה-FSC המוקדמת, מ-6.8 ב-FSCs ל-7.0 בתאי קדם-זקיק ל-7.3 בתאי זקיק. ניתן לייצג את ערכי ה-pH I של כל סוג תא כמיקרוגרף פסאודו-צבעוני המציג את ההבדלים ביחסי pHluorin ל-mCherry ומציג את ההבדלים הללו בצבע כפי שהוגדרו על ידי LUT. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור שכל הריאגנטים מוכנים מראש מכיוון ששלבים רבים בפרוטוקול זה רגישים לזמן.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, לחקור את תפקיד ה-pH בהחלטות סולפט malano gaster תוך תאי.

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

חקור מדידת pH תוך-תאי בתאי זקיק בשחלה חיה של Drosophila באמצעות חיישן פלואורסצנטי ודמייה כמותית. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת השינויים ב-pH על התנהגות תאי גזע בביולוגיה התפתחותית.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

גלה סרטונים נוספים