זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הציטוביולוגי כולל הבנת האפופטוזיס ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחוקרים יכולים לבצע בקלות ובצורה נכונה ניטור בזמן אמת של פוטנציאל קרום המיטוכונדריה באמצעות רודמין-123 בתוך תא בודד. תרבית קו תאי HN4 מקרצינומה קשקשית של תאי ראש וצוואר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

יום אחד לפני הטרנספקציה, צלחת 0.5 מיליון תאים בשני מיליליטר לבאר של מדיום תרבית ללא אנטיביוטיקה בצלחות של שש בארות. יש לדלל בעדינות 100 פיקומולים של CLIC4 RNA מפריע קטן או RNA מפריע קטן מקושקש ב-250 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום. לאחר מכן יש לדלל חמישה מיקרוליטרים של מגיב ליפוזום ב-250 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום ולדגור למשך חמש דקות.

שלב את ה-RNA המפריע הקטן המדולל עם מגיב הליפוזום המדולל וערבב בעדינות. מוסיפים את התערובת לכל תאים המכילים היטב בבינוני. יש לערבב בעדינות על ידי נדנוד הצלחת קדימה ואחורה.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2. החלף את המדיום במדיום גידול רגיל ארבע שעות לאחר הטרנספקציה. המשיכו לדגור על התאים במשך 20 שעות נוספות לפני שתמשיכו בהליך התיוג של רודמין-123.

לאחר טיפול RNA מפריע קטן של CLIC4 בתאי HN4 בצלחות של שש בארות, השתמש בפינצטה כדי להניח כיסויים עגולים בתחתית צלחות חדשות של 12 בארות. פיפטה 150 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר פוליליזין באמצע כל כיסויהחלקה בתוך צלחות 12 הבארות. לאחר שתי דקות, הסר היטב את הפוליליזין על ידי צינור.

לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות של תאי HN4 בתוך הצלחת והוסף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין כדי לנתק את התאים. לאחר שש דקות מוסיפים שני מיליליטר מדיום תרבית כדי לנטרל את הטריפסין. מערבבים בעדינות את תאי HN4 על ידי פיפטר חמש פעמים וזורעים את התאים על כיסויים עגולים.

הנח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר שמונה שעות דגירה, הוסיפו שתי מיקרומול לליטר רודמין-123 וערבבו בעדינות את המדיום למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד במדיום. דגרו על תאי HN4 למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

השתמש בפינצטה כדי להסיר את הכיסויים ולהעביר אותם בקצרה למאגר NPSS שחומם מראש כדי לשטוף את הנוזל שנותר. הנח את הכיסויים בתחתית תא הנירוסטה בנפח 500 מיקרוליטר עם תחתית כיסוי זכוכית 25 מילימטר להחלפה אטומה במקומה על ידי טבעת O. תקן את החלקות הכיסוי במקומם על ידי הידוק המכסה בתא.

הוסף 450 מיקרוליטר של מאגר NPSS שחומם מראש לתא המורכב. לאחר מכן הנח את האמבטיה מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ הקרינה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת לייזר קונפוקלי. הפעל את המיקרוסקופ הקרינה בהתאם להוראות היצרן.

פתח את תוכנת מערכת ההדמיה ובחר בלחצן החדש מסרגל הפקודות כדי להתחיל בניסוי חדש. התאם את שדה הראייה והמיקוד כדי למצוא את מיקום התאים באור הלבן. לאחר מכן כבה את האור ולחץ על הכפתור כדי לסגור את האור הלבן.

לחץ על לחצן המיקוד מסרגל הפקודות ובחר התחל להתמקד כדי להפעיל את הקרינה. מצא שוב את מיקום התאים באמצעות המיקרוסקופ עם עירור של 507 ננומטר ואורך גל פליטה ארוך של 529 ננומטר. התאם את שדה הראייה והתמקד שוב במידת הצורך.

בחר שדה חזותי המכיל רק 20 עד 30 תאי HN4 מופרדים. לאחר השגת שדה ראייה ברור, לחץ על מיקוד קרוב מסרגל המיקוד. לאחר מכן לחץ על השג אחד מסרגל הפקודות כדי לקבל ערכת תמונות אחת.

לאחר מכן, לחצו על אזורים מסרגל הפקודות ולחצו על הלחצן 'אשר' לעריכת אזורי המדידה. כדי להתאים לצורות שונות של תאים בודדים, בחר בכלי אזור המעקב. הקף בעיגול את האזור של תא בודד ולחץ פעמיים בסיום.

חזור על ההליך עד שכל התאים מוקפים בעיגול. לחץ על סיום ובחר שמור תמונות כדי למצוא את המיקום השמור. לחץ על שעון אפס ולחץ במהירות על F4 כדי להתחיל לעקוב אחר השינוי בעוצמת הקרינה.

רשום את השינוי בזמן אמת בעוצמת הקרינה אחת לחמש שניות למשך חמש דקות. כאשר קו הבסיס מתייצב, הוסף 50 מיקרוליטר של NPSS מעורבב עם 0.5 מיקרוליטר של 100 מילימול לליטר ATP לתא באמצעות פיפטר. הפעל את מיקרוסקופ הקרינה של סריקת לייזר קונפוקלית בהתאם להוראות היצרן ופתח את התוכנה המצורפת.

לחץ על המטרה תחת תפריט הרכישה כדי לבחור את עדשת אובייקט שמן הצמצם המספרי 63X 1.4. התבונן בדגימה ומצא שדה ראייה ברור מתחת לשדה האור. לחץ על לחצן בחירת האור כדי לעבור למצב פלואורסצנטי ובחר את מסנני הקרינה הנכונים כדי למצוא את מיקום התא בחושך באמצעות המיקרוסקופ.

לחץ על התריס כדי להגן על הדגימה בסיום התצפית. תחת תפריט הרכישה, התאם את ערוץ ה-PMT המתאים ולחץ על השג כדי להפעיל את הנתיב האופטי המיושב. לחץ על תפריט התצורה ובחר לייזר כדי לקבוע את סוג הלייזר הנדרש.

לחץ בשידור חי כדי לקבל תמונות בזמן אמת ולוודא שהשדה החזותי מכיל רק 20 עד 30 תאי HN4 מופרדים. לאחר מכן, בחר XYT במצב הרכישה בתפריט המשנה של הרכישה תחת תפריט הרכישה. הגדר חמש שניות למרווח הזמן ו-20 דקות למשך הזמן.

לחץ על החל כאשר כל הפרמטרים יוסדרו. תחת תפריט הכמות, השתמש בכלי ציור פוליקו כדי להקיף את אזור ההקלטה של כל תא. בחר פרופיל קו ובחר התחל לבצע תצפית.

רשום את השינוי בזמן אמת של עוצמת הקרינה למשך חמש דקות. כאשר קו הבסיס מתייצב, הוסף לתא 50 מיקרוליטר NPSS מעורבב עם 0.5 מיקרוליטר של 100 מילימול לליטר ATP באמצעות צינור. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נפוץ, פתח את תוכנת מערכת ההדמיה ובחר בלחצן הפתיחה מסרגל הפקודות כדי לפתוח ניסוי שמור.

לחצו על אזורים מסרגל הפקודות ולחצו על הלחצן 'אשר' לעריכת אזורי המדידה. בחרו בכלי אזור המעקב. הקף בעיגול את האזור של תא בודד ולחץ פעמיים בסיום.

חזור על ההליך עד שכל התאים מוקפים בעיגול. לחץ על סיום ובחר בלחצן F4 קדימה כדי לקבל עקבות המציגות את עוצמת הקרינה. לאחר שתסיים, לחץ על כפתור החץ למטה הממוקם בפינה השמאלית התחתונה של הגרף ולחץ על הצג נתוני גרף.

לחץ על אישור פעמיים ובחר את נתוני היומן כפתור כדי לפתוח את הממשק של תוכנת עיבוד נתונים. לאחר מכן לחץ שוב על נתוני יומן כדי למצוא את הרשומות של תנודות בזמן אמת של עוצמת הקרינה המופיעות בגיליון האלקטרוני. מוצגות כאן תוצאות מייצגות המראות שינויים הנגרמים על ידי ATP של דפולריזציה מיטוכונדריאלית בתא HN4 תחת התערבות שונה כפי שנפתרו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נפוצה.

הדפולריזציה של הממברנה המיטוכונדריאלית גדלה במהירות לאחר טיפול ב-ATP והתאוששה בהדרגה לרמה הנורמלית בשתי הקבוצות. עקבות מייצגים של עוצמה פלואורסצנטית של רודמין-123 מדגימים טיפול MMP ב-RNA מפריע קטן CLIC4 שיפר את הדפולריזציה המיטוכונדריאלית בהשוואה לקבוצת הביקורת. היסטוגרמה מייצגת גילתה עוד כי הפלה של CLIC4 שיפרה את הדפולריזציה המיטוכונדריאלית בהשוואה לקבוצת הביקורת.

כאן, תוצאות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי מייצגות מראות גם שינויים הנגרמים על ידי ATP של דפולריזציה מיטוכונדריאלית בתא HN4 תחת התערבות שונה. הדפולריזציה של הממברנה המיטוכונדריאלית עולה במהירות לאחר טיפול ב-ATP ומתאוששת בהדרגה לרמה תקינה בשתי הקבוצות. עקבות מייצגים של עוצמה פלואורסצנטית של רודמין-123 מדגימים כי טיפול MMP ב-CLIC4 RNA מפריע קטן שיפר את הדפולריזציה המיטוכונדריאלית בהשוואה לקבוצת הביקורת.

באופן דומה, ההיסטוגרמה המייצגת גילתה עוד כי הפלה של CLIC4 שיפרה את הדפולריזציה המיטוכונדריאלית בהשוואה לקבוצת הביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה יותר כיצד להשתמש ברודמין-123 כדי לבצע ניטור בזמן אמת של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית הן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל והן על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. לאחר שליטה, טכניקה זו של מיקרוסקופיה עם רודמין-123 יכולה להיעשות תוך פחות מ-20 דקות עבור דגימה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא ליצור כל מגע עם התא בזמן ההזרקה בהמתנה לתהליך הסריקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Western Blot ו-Flow Cytometry כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם התרחשו אפופטוזיס או נמק. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המדע החי לחקור את התפקוד הלקוי של המיטוכונדריה ולמצוא ראיות מוצקות לאפופטוזיס של תאים בתאים חיים שונים.

אל תשכח שעבודה עם רודמין-123 עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומסכות פנים בעת ביצוע הליך זה.