Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי
7 בספטמבר 2017
חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לספק כלי חישובי להערכת ההתפלגות המרחבית ועוצמת האות של שינויים ב-DNA, המומחשים על ידי צביעה חיסונית בתוך גרעינים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, ולאפשר בחינה של לוקליזציה גרעינית ורמות יחסיות של שינויים ב-DNA במערכות מודל שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששינויי ה-DNA נמדדים על ידי גודל אות הבוט ולאחר מכן התפלגות.
אחת ההשלכות של טכניקה זו היא שהיא מקלה על ההבנה שלנו של שורות פונקציונליות פוטנציאליות של שינויים ב-DNA במערכות ביולוגיות שונות. לטכניקה זו יש גם יישום נוסף של ניתוח חישובי של אפיטופים אחרים הניתנים לזיהוי על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להתחיל, פתח את הקבצים בפורמט LSM של תמונת המיקרוסקופיה הקונפוקלית.
בחר עיבוד תמונה ולאחר מכן בחר את התמונה הרצויה לניתוח. שימו לב, שכאשר משווים פרופילי עוצמה בין דגימות, עוצמת הלייזר והרווח חייבים להיות עקביים כדי לבצע השוואות ישירות. לאחר מכן, לחץ על הצג הכל, כדי להפוך את כל הפקדים הגרפיים לגלויים, ולאחר מכן בחר בכרטיסייה הגרפית ובחר בכלי המלבן כדי לבחור אזור המכיל את הגרעינים המעניינים.
לאחר מכן השתמש בפקודה גזור אזור כדי לבודד את אזור העניין. כעת שמור את התמונה בשם חדש ובפורמט LSM או CZI ופתח מחדש את הקובץ בתוכנת Zen Blue. פתח את שולחן ZEN ב-Zen Blue, ולאחר מכן השתמש בפקודה שלח ל-ZEN ב-Zen Black כדי לפתוח את הקובץ ב-Zen Blue.
לאחר מכן, הפעל את הכרטיסייה שכותרתה 2.5d כדי לאפשר הדמיה של התמונה ב-2.5d. לחץ על הצג הכל כדי להפוך את כל הפקדים הגרפיים לגלויים ולשנות את ההגדרות באמצעות ארבעת הפסים האפורים. הסורגים שולטים בזום, בסיבוב, בהטיית הציר ובהתרחבות ובהתכווצות של פסי קנה מידה.
בחר את מצב הרינדור כדי להמחיש בצורה הטובה ביותר את הפסגות הבודדות, ולאחר מכן שנה את המרחק הגדול על ידי שינוי האחוזים. ככל שהאחוז נמוך יותר, כך כל פסגה בודדת מוגדרת יותר. כעת לפני שמירת התמונה 2.5d, הסתר את רשימת הקבצים ואת הכלים הגרפיים על ידי לחיצה על החץ האפור מתחת לתרשים 2.5d.
לאחר מכן שמור את העלילה כצילום מסך באמצעות מקש מסך ההדפסה במקלדת. פתח את אפשרות עיבוד התמונה בתוכנה ופתח את הקובץ המבוקש. לאחר מכן, בחר בכרטיסיית הפרופיל ובחר בכרטיסייה הצג הכל כדי לגשת לכל אפשרויות העיצוב.
בכרטיסיית הפרופיל, בחר באפשרות הטבלה ובלחצן החץ. כעת השתמש בעכבר כדי לבחור נקודת התחלה ולצייר קו על מספר רציף של תאים, לאחר מכן נוצרת תרשים עוצמה עבור התאים לאורך קו זה, יחד עם טבלת מדידות העוצמה. שימו לב שהטבלה מספקת גם את המרחק שבו עוצמת הפיקסלים היא אדומה עבור הקרינה האדומה, הירוקה והכחולה.
היחידה היא מיקרון. כדי לייצא נתונים אלה, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה, בחר שמור טבלה ושמור אותה כקובץ טקסט. כדי לשמור את פרופיל העוצמה, בחר באפשרות הייצוא, בחלון המוקפץ, החלף שתי אפשרויות, קובץ תמונה מתויג, פורמט ותוכן של חלון תמונה, חלונית בודדת, נתונים.
לאחר מכן עקוב אחר ההנחיות כדי לשמור את הקובץ. כעת חזור על תהליך זה עבור כל פרופיל עוצמה נדרש. בתוכנה, בחר עיבוד תמונה ובחר את קובץ התמונה המעניין.
לאחר מכן בחר את הכרטיסייה שכותרתה coloc לניתוח לוקליזציה משותפת ובחר הצג הכל כדי לגשת לכל אפשרויות העיצוב. מארבע הכרטיסיות בחצי התחתון של המסך, בחר לוקליזציה משותפת ובחר את אפשרויות הטבלה והתמונה. לאחר מכן בחר את הסמל השלישי לאורך החלק העליון של הכרטיסייה, המזוהה על ידי הטקסט המוקפץ, הבסיר הסגור.
השתמש בכלי זה כדי להקיף גרעין יחיד. לאחר מכן יופיעו ערכים בטבלה ונוצרת תרשים פיזור עבור פלואורסצנטיות אדומה לעומת ירוקה. הציר של חלקה זו ניתן להזזה וזה שולט בשער הזיהוי.
כל עוצמות הפיקסלים בתוך הגרעין צריכות להיחשב כאותות חיוביים. מכיוון שרמות השינויים בדנ"א משתנות על פני הגרעין, כדי לקחת בחשבון אותות חלשים, איננו מגדירים את הנתונים. נדגיש כאן, שאפשר להתווכח אם יש לכלול את ערכי הרקע בניתוח.
חשוב לציין, מקדם החפיפה אינו תלוי בהבדלים בעוצמות האות בין שני הערוצים. בעוד שמקדם מתאם אדם מניח קשר ליניארי בין האותות. כעת חזור על תהליך זה של הקפת גרעינים על מנת להשלים את מערך הנתונים.
לאחר מכן כדי לייצא את הנתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה ופעל לפי האפשרויות לשמירת הנתונים. כדי לשמור תמונת לוקליזציה משותפת, השתמש בפקודת הייצוא עם שתי האפשרויות, קובץ תמונה מתויג, עיצוב ותוכן של חלון תמונה חלון יחיד, נתונים, ולאחר מכן בצע את האפשרויות לשמירת הקובץ. ההתפלגות המרחבית של שני נגזרות מחומצנות של חמישה מתיל ציטוזין נבדקה בהבחנה בין אבות הפדיים, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר.
אותות אדומים וירוקים מייצגים את שני שינויי הדנ"א השונים. האותות מוגדרים היטב עם חפיפה מוגבלת. בהתאם לציפיות, הפרופילים של שתי עוצמות האות והתא המתאים, אינם חופפים זה לזה.
הדפוס המובהק מצביע על כך שחמצון תלוי ברז של חמישה מתיל ציטוזין יכול ליצור נגזרות מחומצנות שונות באזורי כרומטין ספציפיים. השוואה דומה בין שני שינויי ה-DNA נעשתה בתאי מדולובלסטומה של Daoy ובתאי BXD ependymoma. שתי שושלות התאים הן מגידולי מוח בילדים.
כימות מגלה שתאי BXD מציגים רמות נמוכות משמעותית של שני האותות בהשוואה לתאי דאוי. הקו-לוקליזציה הבאה של הנגזרות המחומצנות של 5MC, נבדקה ב-hiPSCs לא מובחנים. תוך 24 שעות לאחר השראת התמיינות אנדודרם בכבד ו-hiPSCs.
בניתוח זה, לוקליזציה משותפת של אותות השתנתה באופן משמעותי עם אינדוקציה של התמיינות, שאולי מיוחסת לגודל מופחת של חמישה CAC בתאים הלא ממויינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור עלילות ופרופילים בעוצמה של 2.5d וכיצד לייצר נתוני לוקליזציה משותפת. כלי ניתוח התמונה וההדמיה המתוארים כאן, תורמים למחקר אפיגנטי, ומספקים דרך מהירה יחסית להשוות אותות של שינויים שונים ב-DNA בקבוצות ניסוי שונות.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. חשוב להימנע מחשיפת יתר ולהשתמש באותן הגדרות עבור קבוצות ניסוי שונות במהלך המיקרוסקופיה. בועות אוויר בתושבת וטבילה לא מספקת עלולות לגרום לאובדן מקומי של הקרינה, לכן בדיקה ויזואלית של אזור הסריקה היא קריטית.
ניתן להפוך את ההליך לאוטומטי עוד יותר על ידי פילוח הגרעינים ויצירת אזורי עניין באמצעות Zen Blue. ניתן לייבא אזורים אלה ל-Zen Black, כדי לבצע ניתוח לוקליזציה משותפת על גרעינים מרובים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג תהליך חצי-כמותי להמחשת צורות מחומצנות חדשות של 5-מתילציטוזין (oxi-mCs) והתפלגותן המרחבית בתוך גרעינים. השיטה מאפשרת הערכת עוצמת האות של שינויים ב-DNA והתמקמות משותפת, ותורמת להבנת תפקידיהם הפונקציונליים באפיגנטיקה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אפיגנטיקה
- שינויים ב-DNA
- טכניקות אימונו-צביעה
רקע
- 5-מתילציטוזין ונגזרותיו המחומצנות ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות גנים.
- הבנת התפלגותם המרחבית יכולה לספק תובנות לגבי ההשלכות הפונקציונליות שלהם.
- שיטות קיימות עשויות שלא להמחיש באופן אדקווטי שינויים אלו.
- מחקר זה מציג כלי חישובי לשיפור הדמיה וניתוח.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להערכת התפלגות מרחבית של שינויים ב-DNA.
- לנתח עוצמת האות והתמקמות משותפת של נגזרות מחומצנות שונות.
- להקל על הבנת התפקידים הפונקציונליים של שינויים אלו במערכות ביולוגיות.
שיטות ששימשו
- אימונו-צביעה של שינויים ב-DNA בגרעינים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לרכישת תמונות.
- עיבוד תמונות באמצעות תוכנת Zen Blue להמחשה.
- ניתוח התמקמות משותפת של עוצמות האות.
תוצאות עיקריות
- תבניות מרחביות מובחנות של נגזרות מחומצנות נצפו בסוגי תאים שונים.
- ניתוח ההתמקמות המשותפת גילה שינויים משמעותיים במהלך ההתמיינות.
- כימות הראה הבדלים ברמות האות בין קווי תאים.
- השיטה הדגימה פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר אפיגנטיקה.
מסקנות
- תהליך העבודה שפותח משפר את הדמיה של שינויים ב-DNA.
- הממצאים מצביעים על תפקידים פונקציונליים שונים עבור נגזרות מחומצנות שונות.
- טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהקשרים ביולוגיים שונים לתובנות עמוקות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
