Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי
7 בספטמבר 2017
חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לספק כלי חישובי להערכת ההתפלגות המרחבית ועוצמת האות של שינויים ב-DNA, המומחשים על ידי צביעה חיסונית בתוך גרעינים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, ולאפשר בחינה של לוקליזציה גרעינית ורמות יחסיות של שינויים ב-DNA במערכות מודל שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששינויי ה-DNA נמדדים על ידי גודל אות הבוט ולאחר מכן התפלגות.
אחת ההשלכות של טכניקה זו היא שהיא מקלה על ההבנה שלנו של שורות פונקציונליות פוטנציאליות של שינויים ב-DNA במערכות ביולוגיות שונות. לטכניקה זו יש גם יישום נוסף של ניתוח חישובי של אפיטופים אחרים הניתנים לזיהוי על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להתחיל, פתח את הקבצים בפורמט LSM של תמונת המיקרוסקופיה הקונפוקלית.
בחר עיבוד תמונה ולאחר מכן בחר את התמונה הרצויה לניתוח. שימו לב, שכאשר משווים פרופילי עוצמה בין דגימות, עוצמת הלייזר והרווח חייבים להיות עקביים כדי לבצע השוואות ישירות. לאחר מכן, לחץ על הצג הכל, כדי להפוך את כל הפקדים הגרפיים לגלויים, ולאחר מכן בחר בכרטיסייה הגרפית ובחר בכלי המלבן כדי לבחור אזור המכיל את הגרעינים המעניינים.
לאחר מכן השתמש בפקודה גזור אזור כדי לבודד את אזור העניין. כעת שמור את התמונה בשם חדש ובפורמט LSM או CZI ופתח מחדש את הקובץ בתוכנת Zen Blue. פתח את שולחן ZEN ב-Zen Blue, ולאחר מכן השתמש בפקודה שלח ל-ZEN ב-Zen Black כדי לפתוח את הקובץ ב-Zen Blue.
לאחר מכן, הפעל את הכרטיסייה שכותרתה 2.5d כדי לאפשר הדמיה של התמונה ב-2.5d. לחץ על הצג הכל כדי להפוך את כל הפקדים הגרפיים לגלויים ולשנות את ההגדרות באמצעות ארבעת הפסים האפורים. הסורגים שולטים בזום, בסיבוב, בהטיית הציר ובהתרחבות ובהתכווצות של פסי קנה מידה.
בחר את מצב הרינדור כדי להמחיש בצורה הטובה ביותר את הפסגות הבודדות, ולאחר מכן שנה את המרחק הגדול על ידי שינוי האחוזים. ככל שהאחוז נמוך יותר, כך כל פסגה בודדת מוגדרת יותר. כעת לפני שמירת התמונה 2.5d, הסתר את רשימת הקבצים ואת הכלים הגרפיים על ידי לחיצה על החץ האפור מתחת לתרשים 2.5d.
לאחר מכן שמור את העלילה כצילום מסך באמצעות מקש מסך ההדפסה במקלדת. פתח את אפשרות עיבוד התמונה בתוכנה ופתח את הקובץ המבוקש. לאחר מכן, בחר בכרטיסיית הפרופיל ובחר בכרטיסייה הצג הכל כדי לגשת לכל אפשרויות העיצוב.
בכרטיסיית הפרופיל, בחר באפשרות הטבלה ובלחצן החץ. כעת השתמש בעכבר כדי לבחור נקודת התחלה ולצייר קו על מספר רציף של תאים, לאחר מכן נוצרת תרשים עוצמה עבור התאים לאורך קו זה, יחד עם טבלת מדידות העוצמה. שימו לב שהטבלה מספקת גם את המרחק שבו עוצמת הפיקסלים היא אדומה עבור הקרינה האדומה, הירוקה והכחולה.
היחידה היא מיקרון. כדי לייצא נתונים אלה, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה, בחר שמור טבלה ושמור אותה כקובץ טקסט. כדי לשמור את פרופיל העוצמה, בחר באפשרות הייצוא, בחלון המוקפץ, החלף שתי אפשרויות, קובץ תמונה מתויג, פורמט ותוכן של חלון תמונה, חלונית בודדת, נתונים.
לאחר מכן עקוב אחר ההנחיות כדי לשמור את הקובץ. כעת חזור על תהליך זה עבור כל פרופיל עוצמה נדרש. בתוכנה, בחר עיבוד תמונה ובחר את קובץ התמונה המעניין.
לאחר מכן בחר את הכרטיסייה שכותרתה coloc לניתוח לוקליזציה משותפת ובחר הצג הכל כדי לגשת לכל אפשרויות העיצוב. מארבע הכרטיסיות בחצי התחתון של המסך, בחר לוקליזציה משותפת ובחר את אפשרויות הטבלה והתמונה. לאחר מכן בחר את הסמל השלישי לאורך החלק העליון של הכרטיסייה, המזוהה על ידי הטקסט המוקפץ, הבסיר הסגור.
השתמש בכלי זה כדי להקיף גרעין יחיד. לאחר מכן יופיעו ערכים בטבלה ונוצרת תרשים פיזור עבור פלואורסצנטיות אדומה לעומת ירוקה. הציר של חלקה זו ניתן להזזה וזה שולט בשער הזיהוי.
כל עוצמות הפיקסלים בתוך הגרעין צריכות להיחשב כאותות חיוביים. מכיוון שרמות השינויים בדנ"א משתנות על פני הגרעין, כדי לקחת בחשבון אותות חלשים, איננו מגדירים את הנתונים. נדגיש כאן, שאפשר להתווכח אם יש לכלול את ערכי הרקע בניתוח.
חשוב לציין, מקדם החפיפה אינו תלוי בהבדלים בעוצמות האות בין שני הערוצים. בעוד שמקדם מתאם אדם מניח קשר ליניארי בין האותות. כעת חזור על תהליך זה של הקפת גרעינים על מנת להשלים את מערך הנתונים.
לאחר מכן כדי לייצא את הנתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה ופעל לפי האפשרויות לשמירת הנתונים. כדי לשמור תמונת לוקליזציה משותפת, השתמש בפקודת הייצוא עם שתי האפשרויות, קובץ תמונה מתויג, עיצוב ותוכן של חלון תמונה חלון יחיד, נתונים, ולאחר מכן בצע את האפשרויות לשמירת הקובץ. ההתפלגות המרחבית של שני נגזרות מחומצנות של חמישה מתיל ציטוזין נבדקה בהבחנה בין אבות הפדיים, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר.
אותות אדומים וירוקים מייצגים את שני שינויי הדנ"א השונים. האותות מוגדרים היטב עם חפיפה מוגבלת. בהתאם לציפיות, הפרופילים של שתי עוצמות האות והתא המתאים, אינם חופפים זה לזה.
הדפוס המובהק מצביע על כך שחמצון תלוי ברז של חמישה מתיל ציטוזין יכול ליצור נגזרות מחומצנות שונות באזורי כרומטין ספציפיים. השוואה דומה בין שני שינויי ה-DNA נעשתה בתאי מדולובלסטומה של Daoy ובתאי BXD ependymoma. שתי שושלות התאים הן מגידולי מוח בילדים.
כימות מגלה שתאי BXD מציגים רמות נמוכות משמעותית של שני האותות בהשוואה לתאי דאוי. הקו-לוקליזציה הבאה של הנגזרות המחומצנות של 5MC, נבדקה ב-hiPSCs לא מובחנים. תוך 24 שעות לאחר השראת התמיינות אנדודרם בכבד ו-hiPSCs.
בניתוח זה, לוקליזציה משותפת של אותות השתנתה באופן משמעותי עם אינדוקציה של התמיינות, שאולי מיוחסת לגודל מופחת של חמישה CAC בתאים הלא ממויינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור עלילות ופרופילים בעוצמה של 2.5d וכיצד לייצר נתוני לוקליזציה משותפת. כלי ניתוח התמונה וההדמיה המתוארים כאן, תורמים למחקר אפיגנטי, ומספקים דרך מהירה יחסית להשוות אותות של שינויים שונים ב-DNA בקבוצות ניסוי שונות.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. חשוב להימנע מחשיפת יתר ולהשתמש באותן הגדרות עבור קבוצות ניסוי שונות במהלך המיקרוסקופיה. בועות אוויר בתושבת וטבילה לא מספקת עלולות לגרום לאובדן מקומי של הקרינה, לכן בדיקה ויזואלית של אזור הסריקה היא קריטית.
ניתן להפוך את ההליך לאוטומטי עוד יותר על ידי פילוח הגרעינים ויצירת אזורי עניין באמצעות Zen Blue. ניתן לייבא אזורים אלה ל-Zen Black, כדי לבצע ניתוח לוקליזציה משותפת על גרעינים מרובים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג תהליך עבודה חצי-כמותי להדמיה של צורות מחומצנות שנתגלו לאחרונה של 5-methylcytosine (oxi-mCs) וההפצה המרחבית שלהן בתוך גרעיני תאים. השיטה מאפשרת להעריך את עוצמת האות ואת הקולוקליזציה של מודיפיקציות ב-DNA, ובכך תורמת להבנת תפקידיהם התפקודיים באפיגנטיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אפיגנטיקה
- מודיפיקציות של DNA
- טכניקות של צביעה אימונוהיסטוכימית
רקע
- 5-methylcytosine ונגזרותיו המחומצנות ממלאים תפקידים מכריעים בבקרת גנים.
- הבנת ההפצה המרחבית שלהם יכולה לספק תובנות לגבי ההשלכות התפקודיות שלהם.
- שיטות קיימות עשויות שלא להציג ויזואלית באופן מספק את המודיפיקציות הללו.
- מחקר זה מציג כלי חישובי לשיפור הוויזואליזציה והניתוח.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכת ההתפלגות המרחבית של מודיפיקציות ב-DNA.
- ניתוח עוצמת האות וקו-לוקליזציה של נגזרות מחומצנות שונות.
- סיוע בהבנת התפקידים הפונקציונליים של מודיפיקציות אלו במערכות ביולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צביעה אימונוהיסטוכימית של מודיפיקציות DNA בגרעינים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לרכישת תמונות.
- עיבוד תמונות באמצעות תוכנת Zen Blue לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח קולוקליזציה (Co-localization) של עצימויות אות.
תוצאות עיקריות
- נצפו דפוסים מרחביים מובחנים של נגזרות מחומצנות בסוגי תאים שונים.
- ניתוח קו-לוקליזציה חשף שינויים משמעותיים במהלך הגדילה (דיפרנציאציה).
- כימות הראה הבדלים ברמות האות בין קווי תאים.
- השיטה הדגימה פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר אפיגנטי.
מסקנות
- סבב העבודה שפותח משפר את הוויזואליזציה של מודיפיקציות ב-DNA.
- הממצאים מצביעים על תפקידים פונקציונליים מובחנים עבור נגזרות מחומצנות שונות.
- ניתן ליישם טכניקה זו בהקשרים ביולוגיים שונים להשגת תובנות מעמיקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת לצוותי מחקר ופיתוח בביו-פרמה להעריך באופן כמותי את ההתפלגות המרחבית ואת עוצמת האות של מודיפיקציות DNA בהקשרים גרעיניים, ובכך לסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך התיקוף של מטרות אפיגנטיות. באמצעות אספקת ניתוח חישובי של תמונות קונפוקאליות עם צביעה אימונוהיסטוכימית, היא משפרת את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי, שבהם הבנת הלוקליזציה של סימונים אפיגנטיים חדשים מנחה את בחינת ההשערות הטיפוליות. זרימת העבודה תומכת בשיתוף פעולה רב-תחומי באמצעות פלטים כמותיים סטנדרטיים הניתנים לשחזור, אשר ניתן להחיל על מערכות מודל מגוונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של הופעת מודיפיקציות של DNA בבעלי חולייתים, באופן הספציפי לרקמה ולשלב ההתפתחותי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה כמותית של עוצמת האות ודפוסי ההתפלגות בגרעינים.
- ערך ניבוי: תורם למיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים על הלוקליזציה של נגזרות מחומצנות של 5-methylcytosine שעשויות למלא תפקידים ספציפיים בתהליכים תאיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי יצירת תרשימי עוצמת אות דו-ממדיים-חלקית (2.5D) ופרופילי עוצמה עבור תאים מרובים.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה ושחזוריות של הבדיקה באמצעות הגדרות עקביות של הספק הלייזר וההגבר (gain) במהלך המיקרוסקופיה, מה שמאפשר השוואות ישירות בין דגימות.
- מוכנות לסריקה: מדגיש את יכולת ההרחבה ואת השימוש החוזר בפלטפורמה על ידי הדגמת ישימות לאפיטופים אחרים הניתנים לזיהוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות בחינה של שינויים בקו-לוקליזציה של אותים במהלך דיפרנציאציה בתאי hiPSCs ובקווי תאים של גידולי מוח פדיאטריים.
- קידום מותאם סיכון: מתאר כיצד כימות של רמות אות בתאי medulloblastoma מסוג Daoy ותאי ependymoma מסוג BXD תומך בקבלת החלטות בתיקוף פרה-קליני.
- הפחתת סיכון מכניסטית: מתמקד בערך ניבוי על ידי הדגמה של האופן שבו דפוסים מרחביים מובחנים של נגזרות מחומצנות עשויים לשקף חמצון תלוי-tap באזורי כרומטין ספציפיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מוביל, על ידי אספקת נתוני דימות כמותיים התומכים בבדיקת השערות ובבירור מסלולים במחקר אפיגנטיקה.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות ניתוח התפלגות מרחבית של מודיפיקציות ב-DNA המדוממות באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות פרופילי עוצמת אות ויצוא של טבלאות המאפשרים השוואה כמותית של עוצמת הצביעה בין תאים.
- אנליטיקה: מדגיש מקדמי קולוקליזציה ותרשימי פיזור המסייעים לצוותים להשוות בין תנאים ולהעריך קשרים בין מודיפיקציות שונות של DNA.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית באמצעות ניתוח שינויים באות במהלך דיפרנציאציה במודלים של תאי גזע וגידולי סרטן.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה ככשרון בר-שימוש חוזר על ידי ציון יישומה הנוסף לניתוח חישובי של אפיתופים אחרים הניתנים לזיהוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי בתיקוף המטרה באמצעות הערכה של לוקליזציה גרעינית ורמות יחסיות של מודיפיקציות ב-DNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות הגדרות דימות עקביות וטבלאות נתונים ניתנות לייצוא להשוואה בין קבוצות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה של ניסוי (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכת רמות מודיפיקציה של DNA בקבוצות ניסוייות שונות, כגון hiPSCs לא מובחנות לעומת מובחנות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תעדוף מותאם סיכון באמצעות כימות הבדלי אותים בין קווי תאים, כגון אותות נמוכים יותר בתאי BXD לעומת תאי Daoy.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית במיקרוסקופיה קונפוקלית ובצביעה אימונוהיסטוכימית למודיפיקציות של DNA.
- דרישות לתשתיות מכשירים ואנליזה כוללות את התוכנה Zen Blue לצורך ויזואליזציה ב-2.5D, ניתוח פרופילים וכלי קולוקליזציה.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים כוללות שמירה על הספק לייזר והגבר (gain) עקביים בעת השוואת פרופילי עוצמה בין דגימות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים נתמכים על ידי יישום השיטה בתאי פרוגניטורים המבדילים haphadic, מדולובלסטומה מסוג Daoy, אפנדימומה מסוג BXD ותאי hiPSCs.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך להימנע מחשיפה יתרה ולבדוק את אזורי הסריקה לאיתור בועות אוויר או טבילה לא מספקת שעלולות לגרום לאובדן פלורסצנציה מקומי.
