מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור זני סטרפטוקוקוס מוטנס ממוקדים באמצעות PCR היתוך דו-שלבי ואלקטרופורציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה כמו כיצד פועל גן מעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלא נדרשת תגובה אנזימטית מלבד PCR והכנת תאים מוכשרת לאלקטרופורציה היא די פשוטה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טכניקת שיבוש הגנים של Streptococcus mutans, ניתן ליישם אותה גם על מינים מיקרוביאליים אחרים כגון Staphylococcus aureus. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם אינם מכירים את היעילות של פריימרים מקוננים עבור ה-PCR השני. תדגים את ההליך ד"ר איאקו אוקאדה, מדריכת מחקר מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, יש לפספס מלאי S.mutans UA159 על צלחת עירוי לב מוח או צלחת אגר BHI ולדגור את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. למחרת, השתמשו בקיסם מעוקר כדי לבחור מושבה אחת ולחסן אותה לחמישה מיליליטר של מרק BHI. דגרו על תרבית S.mutans למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התרבות ב -2000 פעמים G למשך 15 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר PBS. צנטריפוגה שוב ב -2000 פעמים G למשך 15 דקות. השעו מחדש את גלולת התא המתקבלת ב -200 מיקרוליטר של PBS. חלץ DNA גנומי מהתרחיף באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מבוססת הכאת חרוזים. ראשית העבירו את תרחיף התא לצינור דגימה של שני מיליליטר המכיל חרוזי זכוכית. לאחר מכן הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת ליזה לתרחיף התאים. כסו את הצינורות בחוזקה והניחו אותם בצורה סימטרית במחזיק הצינור של מנגנון השיבוש של הכאת החרוזים. מעבדים במהירות המרבית במשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימות מוכות החרוזים ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת. העבירו את הסופרנטנט לעמוד ספין בצינור איסוף של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב-7000 פעמים G למשך דקה אחת. הוסף 1200 מיקרוליטר של מאגר קושר DNA לסינון והעביר 800 מיקרוליטר מהתערובת לעמוד הסיבוב בצינור איסוף של שני מיליליטר. צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G למשך דקה אחת. השליכו את הזרימה. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפה מוקדמת לעמוד הסיבוב כדי לשטוף את מטריצת העמודים והצנטריפוגה של פי 10, 000 G למשך דקה אחת. השלך את הזרימה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד הסיבוב כדי לשטוף שוב את מטריצת העמודים והצנטריפוגה. הנח כל עמוד ספין לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה למטריצת העמודה. צנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 30 שניות כדי לחסל את ה-DNA הגנומי. להעריך את ריכוז ה-DNA וטוהר ה-DNA על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. ה-PCR הראשון מבוצע באמצעות הגנום מסוג הבר S.mutans וגן העמידות לסטרפטומיצין הסינתטי כתבניות PCR. שלוש קבוצות של פריימרים משמשות להגברה בהתאמה, אזור האגף במעלה הזרם של הגן glycosyltransferase C או gtfC, אזור האגף במורד הזרם של הגן gtfC וגן העמידות לספקטינומיצין. יש לחלק כל מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1%. הגודל של כל מוצר מה-PCR הראשון צריך להיות בערך KB אחד. השתמש בחותך רצועת ג'ל כדי להוציא את הרצועות המתאימות ולטהר כל מוצר DNA מוגבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השלב הבא הוא להשתמש בשלושת השברים הטוחנים השווים בערך כתבניות PCR לביצוע ה-PCR השני. שברים אלה מוגברים ומחוברים באמצעות פריימרים מתאימים כדי לייצר את מבנה השיבוש. מכיוון שהצלחת הליך זה תלויה בהגברה של מבנה השיבוש על ידי PCR שני, חשוב לאשר את תוצר ה-PCR השני על ידי אלקטרופורזה. טען 1/10 מתערובת תגובת ה-PCR על ג'ל אגרוז של 0.8% כדי לאשר שלאמפליקון שנוצר יש את גודל הרצועה החזוי. בדוגמה זו, פריימרים מקוננים נתנו הגברה טובה בהרבה. העבירו את תערובת ה-PCR הנותרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והוסיפו 55 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי להתאים את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר. הוסף 1/10 נפח של שלושה נתרן אצטט מולארי pH 5.2, ואחריו 2.5 נפחים של 100% אתנול וערבב.מקפיאים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בסיום הצנטריפוגה, בדוק אם יש את הגלולה בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה עם מיליליטר אחד של 70% אתנול וצנטריפוגה ב -15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הגלולה באוויר למשך כ-30 דקות. לבסוף, ממיסים את הגלולה עם 10 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. תאי S.mutans UA159 מוכשרים הוכנו בעבר ואוחסנו כ-50 מיקרוליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.מערבבים כל 50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים קרים בקרח עם חמישה מיקרוליטרים של מבנה השיבוש. מוסיפים את התערובת לקובטות אלקטרופורציה עם מרחק של 0.2 סנטימטר בין אלקטרודות. בצע אלקטרופורציה באמצעות מצב Staphylococcus aureus של מנגנון האלקטרופורציה. מיד לאחר האלקטרופורציה, השעו את התאים ב -500 מיקרוליטר מרק BHI והוסיפו 50 מיקרוליטר מהתרחיף לצלחות אגר BHI המכילות ספקטינומיצין. דגרו את הצלחות במשך יומיים עד שישה ימים ב -37