Name: מהדור גין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי גין שיבוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למדו שיטה מהירה וחסכונית ליצירת זני Streptococcus mutans עם הפרעת גנים באמצעות PCR וחשמול. השיטה מתאימה למינים חיידניים נוספים ומאיצה מחקר גנטי במיקרוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן הקידום של המדע [מספרים גרנט 16 K 15860 אל ט. מ ו- 15 K 15777 כדי N.H.].

1. פריימר עיצוב <ol><li>להתכונן תחל 2-שלב פיוז ' ן PCR ואימות של שיבוש גנטי. 
	הערה: טבלה 1 מציגה את רצפי פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. איור 1 מראה של איור סכמטי של שיטת ה-PCR 2-שלב פיוז ' ן המשמש ליצירת Δ ס mutans gtfC.
	<ol><li>תחל עיצוב עבור התחליף של אזור היעד הגנום עם ג'ין (spc r) ההתנגדות spectinomycin 7. פרוטוקול זה מחליף את כל האזור קידוד של הגן gtfC spc r.</li>
		<li>לכלול 15 בסיסים משלימים בקצוות העליונים והתחתונים של spc r ב- 5 &#39; מחוזות היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה. באופן דומה, כולל 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזורים איגוף במעלה הזרם של gtfC, בקצה העליון של האזורים איגוף במורד הזרם של gtfC-5 &#39; מחוזות spc r-קדימה ואת spc r -הפוך תחל בהתאמה ( איור 1 א'). 
		הערה: רצפים של היפוך למעלה, למטה-קדימה, spc r - קדימה, ו- spc r - הפוך תחל נקבעים באופן אוטומטי בהתאם אתר מסמכי התאגדות של הבונה הפרעה של.</li>
		<li>לעצב את תחל למעלה-קדימה, למטה-הפוך מעגנת &#62; 1-kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של הגן gtfC, בהתאמה. להגדיר את טמפרטורת ההיתוך (T m) של מעלה-קדימה, למטה-הפוך תחל בהתאם טמפרטורת ההיתוך של היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה ( איור 1 א'). 
		הערה: להפנות הנוסחה הבאה כדי לקבוע T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, היכן * N מייצג את מספר נוקלאוטידים תחל עם הזהות המצוינת (A, T, C או G)-</li>
		<li>עיצוב תחל מקוננים (N_up-קדימה ואת היפוך N_up) עבור 2 nd PCR ( איור 1B). 
		הערה: למרות הזוג תחל החיצוני (up-קדימה, למטה-אחורי) עשויה לשמש תחל 2 nd PCR, תחל מקוננים (N_up-קדימה ו- N_up-אחורי) עוצבו ב פרוטוקול זה. תחל מקוננים נדרשים לעתים קרובות עבור 2 nd PCR, כמפורט נציג תוצאות.</li>
		<li>תחל עיצוב ספציפי עבור spc r. תחל משמשים המושבה PCR למסך להפרעה gtfC.</li>
		הפרעה <li>תחל עיצוב עבור האימות של gtfC. 
		הערה: המוצרים PCR מוגבר באמצעות תחל אלה שנושקות לגבול בין gtfC או spc r במעלה או במורד הזרם איגוף מחוזות gtfC. ערכות פריימר &#39; gtfC up-קדימה ואת gtfC up-הפוך &#39;, &#39; gtfC למטה-קדימה, gtfC למטה-הפוך &#39; ספציפיות עבור gtfC, ו &#39; gtfC up-קדימה ו- spc r 2 -הפוך &#39;, &#39; spc r 2-קדימה ו- gtfC למטה-הפוך &#39; ספציפיות עבור spc r.</li>
	</ol></li></ol> 2. הפקת דנ א גנומי מ ס mutans <ol><li>המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר המוח אינפוזיה (BHI) הלב. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>צנטריפוגה התרבות תא החיידק למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS.</li>
	<li>לחלץ דנ א גנומי התליה באמצעות של חרוז-מכות-בסיס גנומי DNA ערכת חילוץ בהתאם להוראות היצרן-
	<ol><li>העברת ההשעיה מדגם 2.0-mL שפופרת המכילה חרוזי זכוכית (כלול בערכה). להוסיף µL 750 בפתרון פירוק (כלול בערכה) התליה תא.</li>
		<li>קאפ בחוזקה ולמקם הצינורות באופן סימטרי בעל שפופרת של מנגנון השיבוש חרוז-מכות. תהליך במהירות המרבית עבור 5 דקות. צנטריפוגה הוכה חרוז הדוגמאות עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' × להעביר את תגובת שיקוע המסנן ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב × 7,000 g .</li>
		<li>µL 1,200 להוסיף איגוד ה-DNA של מאגר (כלול בערכה) פילטרט. העברת µL 800 של התערובת לעמודה ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×</li>
		<li>להשליך הזרימה דרך, להוסיף 200 µL מאגר קדם כביסה (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את המטריצה עמודה, ו צנטריפוגה עבור 1 דקות בג' 10,000 × להשליך הזרימה דרך, להוסיף 500 µL מאגר לשטוף (כלול בערכה) ספין עמודה כדי לשטוף את המטריצה עמודה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×</li>
		<li>למקם את העמודה ספין לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף 100 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה) אל המטריקס עמודה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב-30 s ב × 10,000 g כדי elute את הדנ א הגנומי. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR-הגברה <ol><li>בצע 1 סנט PCR באמצעות הגנום s WT המוטנטים לפני שהם י ס והגן סינתטי spc r כתבניות PCR (ראה טבלה 1). להגביר את האזור איגוף במעלה הזרם של הגן gtfC, אזור איגוף במורד הזרם של הגן gtfC, הגן spc r באמצעות שלושה זוגות תחל שתוארו לעיל ( איור 1 א'), לפי בטבלה 2 ו- 3 בטבלה. 
	הערה: תחל PCR, ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>Fractionate כל מוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1% ו בלו הלהקות המתאימים שימוש בחותך הלהקה ג'ל.</li>
	<li>לטהר כל מוצר ה-DNA מוגבר של ג'לים שימוש של ספין עמודה, סיליקה ג'ל המבוסס על רפידה ערכת חילוץ.
	<ol><li>העברת הפרוסות ג'ל כדי microcentrifuge נקי צינור ומערבבים עם 500 µL של איגוד מאגר (כלול בערכה). דגירה התערובת ב 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד הפרוסות ג'ל התפרקה לחלוטין.</li>
		<li>למקם את העמודה ספין (כלול בערכה) לתוך צינור אוסף (כלול בערכה) לטעון את הדגימה אל העמודה ספין, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g. למחוק את הזרימה דרך, להוסיף את µL 600 מאגר לשטוף (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את הקרום סיליקה, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g.</li>
		<li>להיפטר זרימה דרך של צנטריפוגה למשך 2 דקות ב × 11,000 g כדי לייבש את הקרום סיליקה.</li>
		<li>במקום העמודה ספין לתוך צינור microcentrifuge 1.5-mL החדש, להוסיף 50 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 11,000 × g כדי elute את ה-DNA מוגבר. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.</li>
	</ol></li> <li>לבצע 2 nd PCR של 2-שלב פיוז ' ן PCR באמצעות שלושה שברי כ equimolar כתבניות PCR, לפי בטבלה 2 < /stרונג > ו לטבלה 3. 
	הערה: קטעים אלה היו מוגבר, משולבים באמצעות תחל מקוננים על &#39; N_up-קדימה ואת היפוך N_down &#39; או את תחל החיצוני &#39; up-קדימה, למטה-הפוך &#39; ( איור 1B). PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>לטעון עשירית של תערובת התגובה PCR (5 µL) ב- 0.8% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים ( איור 1C).</li>
	<li>להתרכז המוצר PCR הסופי שנותרו על ידי משקעים אתנול ללא טיהור.
	<ol><li>µL להוסיף 55 של אולטרה טהור מים לתערובת PCR הנותרים כדי לכוונן את העוצמה הכוללת כדי 100 µL.Add נפח עשירית של 3 מ' סודיום אצטט (10 µL), pH 5.2, ואחריו 2.5 בנפחים של 100% אתנול (250 µL). לערבב ומקפיאים למשך 30 דקות ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>צנטריפוגה כעשרים דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, בדוק בגדר בתחתית של התחתית, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. מילה נהדרת בגדר כ 30 דקות, להמיס עם 10 µL של מים אולטרא טהורים.</li>
	</ol></li></ol> 4. הכנה תא המוסמכת וטרנספורמציה תא <ol><li>המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>להעביר 2 מ"ל של התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י 50 מ ל מרק BHI, תקופת דגירה של 6-8 h ב- 37 ° C עד צפיפות אופטית על 600 nm (OD 600) של 0.2-0.4 בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>Centrifuge התאים למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מ של קרח מים ואחריו 40 מיליליטר 10% גליצרול. 
	הערה: חומרים שיורית משפיע אלקטרופורציה עוקבות.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה פסטר כמו דבקותה של בגדר תא גליצרול 10% מצטמצם. Resuspend תאי 1 מ"ל של גליצרול 10% טרי, לוותר על 50 µL של ההשעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5-mL ו לאחסן ב- 80 ° C עד לפני שימוש.</li>
	<li>מערבבים את aliquot 50 µL של תאים המוסמכת קפואים עם 5 µL של הבונה הפרעה שתוארו לעיל בסעיף 3. להוסיף את התערובת אלקטרופורציה וואקום (עם מרחק 0.2 ס מ בין האלקטרודות). להעסיק את מצב Staphylococcus aureus (1.8 kV, 600 Ω, 10 µF, הדופק 1) על מנגנוני אלקטרופורציה כדי electroporate.</li>
	<li>להשעות את התאים µL 500 BHI מרק מיד לאחר אלקטרופורציה ולהוסיף 50 µL של ההשעיה ללוחות BHI-אגר המכילות spectinomycin. 
	הערה: הדגירה תוספת הזמן לאחר אלקטרופורציה אינה נדרשת. עם זאת, דגירה עבור h 1-2 לאחר אלקטרופורציה עשוי לשפר את יעילות טרנספורמציה.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת של 2-6 ימים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. 
	הערה: S. mutans Δ gtfB נבנה כמתואר לעיל. כל האזור קידוד של הגן gtfB מוחלף עם אריתרומיצין ההתנגדות ג'ין 8 ב Δ mutans ס gtfB. כל זן mutans ס הוא תרבותי ב- BHI מרק ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
</ol> 5. אימות של שיבוש גנטי ואחסון <ol><li>לאסוף מושבות אקראי ואת לחסן אותם לתוך התערובת PCR לבצע המושבה PCR לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>לטעון את תערובת התגובה PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר את ה-spc r-להקת ה-DNA ספציפיים.</li>
	<li>לבחור את המושבה חיובי באמצעות קיסם סטיריליים ותאים תת-תרבות ב 10 מ"ל של spectinomycin-המכילים BHI ציר 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>לאמת את הדור של ס' mutans Δ gtfC.
	<ol><li>לחלק התליה תא באותה מידה. לחלץ דנ א גנומי מתאי שתוארו לעיל (צעדים 2.3. כדי 2.5.5.). לבצע PCR עם ה-DNA גנומי כתבנית PCR, באמצעות תחל עבור האימות של שיבוש gtfC (טבלה 1) לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. 
		הערה: ה-PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
		<li>לטעון את התערובת PCR על 2% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים .</li>
		<li>Centrifuge התליה תא הנותרות למשך 15 דקות ב 2,000 × g ב- 4 מעלות צלזיוס Resuspend בגדר תא ב 5 מ של PBS.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב-4 ° C. Resuspend התא הצניפה ב- 1.5 מ ל מרק BHI המכיל 25% גליצרול ולאחסן ב-80 מעלות קור-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. ניתוח פנוטיפי <ol><li>פס כל המוטנטים לפני שהם י S. s זן על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך 2 מ ל מרק BHI עם או בלי אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>לחסן µL 20 של ההשעיה תרבות לילה לתוך 2 מ ל מרק BHI המכיל 1% או 5% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה במבחנה זכוכית; התרבות התאים עם מבחנה במצב נוטה ללון ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>מערבולת הכוס מבחנות 10 s ו decant תרבות המתלים. רחץ צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% Coomassie מבריק כחול (CBB) כתם biofilms על הקיר צינור ולאחר מכן תקופת דגירה של דק 1</li>
	<li>Decant הפתרון מוכתמים, רוחצים צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים, ומייבשים את המבחנות.</li>
	<li>להעריך את צפיפות הצבע והן הארכת CBB צבעונית-biofilm באופן חזותי כדי לקבוע את יכולת ניתוח פנוטיפי להיוות biofilm.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.
מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spcr-קדימה, ו- spcr-הפוך) בפרוטוקול זה באופן אוטומטי נקבעו בהתבסס על האתר של התאגדות של הבונה שיבוש. כל פריימר כולל 15 בסיסים משלימים לסוף התבנית PCR 2nd -האזור 5'. אתר איגוד יותר מאפשר ייצור יעיל יותר של הבו...

הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג'ין-הפרעה יש נעזרו ג'ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג'ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות1,2 על עיצוב האתר של ג'ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum3 ו- Synechocystis sp. PCC68034 . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג'ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ' ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.
היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג'ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5' אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5' אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז'ן. בשלב השני (2nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.
בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס' mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג'ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>זן מלאי במעבדה.</td><td></td><td>זן מסוג בר (זן UA159)</td></tr> <tr><td>ערכת מיצוי DNA גנומי</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>מנגנון שיבוש מכות חרוזים</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>גנים סינתטיים</td><td>Eurofins Genomics</td><td>גן עמיד לספקטינומיצין ואריתרומיצין</td><td>בהזמנה אישית</td></tr> פריימרים <tr><td>תרמיים</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>הזמנה אישית</td><td>של 35 בסיסים באורך</td></tr><tr><td>DNA פולימראז</td><td>Takara</td><td>R045A</td> ערכת מיצוי <td>ג'ל DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td></tr><tr><td></td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>מיצוי DNA מג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>חותך להקת ג'ל</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>בקמן קולטר</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>מרווח של 0.2 ס"מ</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>מיצובישי גז כימי</td><td>A-03</td><td>מערכת תרבית אנאירובית</td></tr><tr><td>מרק עירוי לב מוח</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>מדיה לתרבית חיידקים</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>אריתרומיצין</td><td>וואקו</td><td>057-07151</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>וואקו</td><td>196-00015</td><td>לפיתוח ביופילם</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>וואקו</td><td>031-17922</td><td>לצביעה ביופילם</td></tr></tbody></table>

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג'ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג'ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג'ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ' ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

איור 2 מציג את הגודל של כל מוצר מ- 1סנט PCR, כפי שנצפה על הג'ל 1% agarose, היה הסכם טוב עם חזה בגודל של 1 kb. איור 3 מראה ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של המוצרים של 2nd PCR. איור 4 מראה המושבות ס mutans טרנספורמציה עם הבונה שיבושים, ניתוח ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR המושבה. Amplicons של כל המושבות היו של גודל החזוי. איור 5 מצ...

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור זני סטרפטוקוקוס מוטנס ממוקדים באמצעות PCR היתוך דו-שלבי ואלקטרופורציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה כמו כיצד פועל גן מעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלא נדרשת תגובה אנזימטית מלבד PCR והכנת תאים מוכשרת לאלקטרופורציה היא די פשוטה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טכניקת שיבוש הגנים של Streptococcus mutans, ניתן ליישם אותה גם על מינים מיקרוביאליים אחרים כגון Staphylococcus aureus. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם אינם מכירים את היעילות של פריימרים מקוננים עבור ה-PCR השני. תדגים את ההליך ד"ר איאקו אוקאדה, מדריכת מחקר מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, יש לפספס מלאי S.mutans UA159 על צלחת עירוי לב מוח או צלחת אגר BHI ולדגור את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. למחרת, השתמשו בקיסם מעוקר כדי לבחור מושבה אחת ולחסן אותה לחמישה מיליליטר של מרק BHI. דגרו על תרבית S.mutans למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התרבות ב -2000 פעמים G למשך 15 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר PBS. צנטריפוגה שוב ב -2000 פעמים G למשך 15 דקות. השעו מחדש את גלולת התא המתקבלת ב -200 מיקרוליטר של PBS. חלץ DNA גנומי מהתרחיף באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מבוססת הכאת חרוזים. ראשית העבירו את תרחיף התא לצינור דגימה של שני מיליליטר המכיל חרוזי זכוכית. לאחר מכן הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת ליזה לתרחיף התאים. כסו את הצינורות בחוזקה והניחו אותם בצורה סימטרית במחזיק הצינור של מנגנון השיבוש של הכאת החרוזים. מעבדים במהירות המרבית במשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימות מוכות החרוזים ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת. העבירו את הסופרנטנט לעמוד ספין בצינור איסוף של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב-7000 פעמים G למשך דקה אחת. הוסף 1200 מיקרוליטר של מאגר קושר DNA לסינון והעביר 800 מיקרוליטר מהתערובת לעמוד הסיבוב בצינור איסוף של שני מיליליטר. צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G למשך דקה אחת. השליכו את הזרימה. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפה מוקדמת לעמוד הסיבוב כדי לשטוף את מטריצת העמודים והצנטריפוגה של פי 10, 000 G למשך דקה אחת. השלך את הזרימה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד הסיבוב כדי לשטוף שוב את מטריצת העמודים והצנטריפוגה. הנח כל עמוד ספין לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה למטריצת העמודה. צנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 30 שניות כדי לחסל את ה-DNA הגנומי. להעריך את ריכוז ה-DNA וטוהר ה-DNA על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. ה-PCR הראשון מבוצע באמצעות הגנום מסוג הבר S.mutans וגן העמידות לסטרפטומיצין הסינתטי כתבניות PCR. שלוש קבוצות של פריימרים משמשות להגברה בהתאמה, אזור האגף במעלה הזרם של הגן glycosyltransferase C או gtfC, אזור האגף במורד הזרם של הגן gtfC וגן העמידות לספקטינומיצין. יש לחלק כל מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1%. הגודל של כל מוצר מה-PCR הראשון צריך להיות בערך KB אחד. השתמש בחותך רצועת ג'ל כדי להוציא את הרצועות המתאימות ולטהר כל מוצר DNA מוגבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השלב הבא הוא להשתמש בשלושת השברים הטוחנים השווים בערך כתבניות PCR לביצוע ה-PCR השני. שברים אלה מוגברים ומחוברים באמצעות פריימרים מתאימים כדי לייצר את מבנה השיבוש. מכיוון שהצלחת הליך זה תלויה בהגברה של מבנה השיבוש על ידי PCR שני, חשוב לאשר את תוצר ה-PCR השני על ידי אלקטרופורזה. טען 1/10 מתערובת תגובת ה-PCR על ג'ל אגרוז של 0.8% כדי לאשר שלאמפליקון שנוצר יש את גודל הרצועה החזוי. בדוגמה זו, פריימרים מקוננים נתנו הגברה טובה בהרבה. העבירו את תערובת ה-PCR הנותרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והוסיפו 55 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי להתאים את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר. הוסף 1/10 נפח של שלושה נתרן אצטט מולארי pH 5.2, ואחריו 2.5 נפחים של 100% אתנול וערבב.מקפיאים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בסיום הצנטריפוגה, בדוק אם יש את הגלולה בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה עם מיליליטר אחד של 70% אתנול וצנטריפוגה ב -15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הגלולה באוויר למשך כ-30 דקות. לבסוף, ממיסים את הגלולה עם 10 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. תאי S.mutans UA159 מוכשרים הוכנו בעבר ואוחסנו כ-50 מיקרוליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.מערבבים כל 50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים קרים בקרח עם חמישה מיקרוליטרים של מבנה השיבוש. מוסיפים את התערובת לקובטות אלקטרופורציה עם מרחק של 0.2 סנטימטר בין אלקטרודות. בצע אלקטרופורציה באמצעות מצב Staphylococcus aureus של מנגנון האלקטרופורציה. מיד לאחר האלקטרופורציה, השעו את התאים ב -500 מיקרוליטר מרק BHI והוסיפו 50 מיקרוליטר מהתרחיף לצלחות אגר BHI המכילות ספקטינומיצין. דגרו את הצלחות במשך יומיים עד שישה ימים ב -37

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה...

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

מקור: Lea-Smith, D. J., et al. יצירת מוטציות מסומנות וחסרות סמן במינים ציאנובקטריאליים מודלים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה ליצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה. הפרוטוקול מתחיל בתרבית ציאנובקטריה, ואחריו צנטריפוגה ושלבי שטיפה המשמרים את פני השטח. לאחר מכן מוצג פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה המוקף ברצפים הומולוגיים. במהלך הדגירה, הפלסמיד מופנם באמצעות פילי ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. בחירת אנטיביוטיקה וריסוק משמשים לבידוד וטיהור הזן המוטנטי.

יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

הכנסת שינויים גנומיים מרובים לציאנובקטריה היא כלי חיוני בפיתוח זנים למטרות מחקר תעשייתי ובסיסי. אנו מתארים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני המודל הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC6803 ומוטציות מסומנות ב-Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

למדו שיטה מהירה וחסכונית ליצירת זני Streptococcus mutans עם הפרעת גנים באמצעות PCR וחשמול. השיטה מתאימה למינים חיידניים נוספים ומאיצה מחקר גנטי במיקרוביולוגיה.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

גלה סרטונים נוספים