Name: במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: למדו להעריך את יכולת הפגוציטוזה של מקרופאגים מח עצם עכבריים כלפי פסולת מיאלין מסומנת בפלורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל וחסכוני של תגובות מקרופאגים בתרבית לחקר נוירוטראומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות גלן סנגר-הודג'סון, מומחה בתקשורת במכללה לרפואה של בריה"מ לשעבר על כל העבודה הפקות וידאו, עריכה, ואת הקריינות.
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM100474 ו- R01GM072611).

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

ההליכים המתוארים כאן לנצל טרי מבודד פסולת המיאלין גולמי של CNS והן מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי. כדי לצמצם את ההוצאה על בעלי חיים, אנו ממליצים כי שני המוח, תאי מח העצם להיות שנקטפו כל עכבר בזמנו של הקרבה. שני החוקרים עובדים ביחד יכולים להכין שני חומרים בו זמנית. לחלופין, ניתן לאחסן את המוח ב- 80 ° C ב- PBS בתוספת אנטיביוטיקה לפני המיאלין פסולת בידוד. זה היה הניסיון שלנו זה המוח יכול להישמר בתנאים אלו במשך עד חודש ללא אובדן ניכר של המיאלין פסולת דור פוטנציאל.
CFSE משמש להוספת תווית המיאלין ...

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם חוליה חשובה בין מערכות החיסון מולדים, מסתגלת. כמו אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), הם יכולים לתקשר עם לימפוציטים באמצעות מצגת אנטיגן שני ולשחרר ציטוקין1,2,3. עם זאת, כמו המקצועי phagocytes, התפקיד העיקרי שלהם היא לנקות פתוגנים, תאים בגילאי ופסולת הסלולר1,4. בעקבות פגיעה בחוט השדרה (מדע), כמויות ניכרות של פסולת המיאלין נוצר מתוך oligodendrocytes גוסס, סוג התא אחראי על מערכת העצבים המרכזית האקסון myelination5. אנחנו ואחרים הראו כי סיווג של המיאלין פסולת הוא בראש ובראשונה באחריות שחדר BMDMs5,6,7. עם זאת, תוך פגיעה בחוט השדרה הוצע היבלעות באתרים של פסולת המיאלין להעביר תאים בדרך כלל אנטי דלקתיות אלה לכיוון מדינת פרו דלקתיים5,8,9. כמתווכים מרכזיים של נוירו-דלקת חוט השדרה נפגע, BMDMs הם מטרות קליני חשוב.
כדי לסייע לחקור את השפעת BMDMs בחוט השדרה הפגוע, פיתחנו מודל במבחנה ללמוד ישירות איך BMDMs להגיב המיאלין פסולת. כדי לשפר את הרלוונטיות ביולוגי, BMDMs מאתר ראשי ופסולת המיאלין מבודד טריים משמשים האלה החקירות. ככזה, השיטות המובאות כאן פירוט גם את הבידוד והתרבות של BMDMs מאתר ראשי, טכניקה הדרגתיות סוכרוז ששונה המשמשת כדי לבודד CNS מאתר נגזר המיאלין פסולת10,11,12. המיאלין פסולת יכול להיקרא בקלות עם תיוג הפלורסנט, אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כדי מעקב אחר שלה הפנמה מאת BMDMs. CFSE מתאים היטב עבור יישום זה כי זה הלא-ציטוטוקסיות, היתרים ספקטרום פלורסנט הצר שלה ריבוב עם פלורסנט אחרים רגשים13,14. בעקבות phagocytosis, המיאלין פסולת שומנים מועברים דרך lysosomes, כחבילה ליפידים נייטרלי לתוך השומנים תאיים טיפות5. כדי לכמת את הצטברות השומנים תאיים, נציג של שמן אדום O (אורו) צביעת שיטת ממוטבים לניתוח תמונה כמותית. שיטה מכתימים פשוטה זו מייצרת תוצאות לשחזור חזקים כימות15. שיטות אלה להקל על המחקר של המיאלין פסולת השמירה phagocytosis ו ליפיד עם ציוד מיוחד מוגבל.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין, נתרן פירובט</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Solution New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>ארצות הברית</td></tr><tr><td>מוצא NCTC שיבוט 929 [תא L, L-929, נגזרת של זן L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 קו תאים של הכנת מדיה מותנית</td></tr><tr><td>24 בארות צלחות תרבית תאים</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>פוליסטירין, ערכת ריבוי תאים CFSE 145/20 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO לקונסטרוקציה סיפקה</td></tr><tr><td>פלואורו-ג'ל עם Tris Buffer&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>326823</td><td>קיר דק, פוליפרופילן, 38.5 מ"ל, 25 x 89 מ"מ</td></tr><tr><td>SW 32 Ti רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti רוטור, דלי מתנדנד, טיטניום</td></tr><tr><td>כף יד הומוגנייזר סיבובי</td><td>פישר סיינס</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם לויקוציטים בוגרת לשרת תפקיד פיזיולוגי קריטיים כמו phagocytes מקצועי המסוגל סליקה מגוון של חלקיקים. בדרך כלל, BMDMs שנאסרת על מערכת העצבים המרכזית (CNS), אך בעקבות פציעה, הם בקלות יכולים לחדור. פעם אחת בתוך הרקמה הפצועים CNS, BMDMs הם סוג התא הראשי אחראי האישור של פציעה, נגזר הסלולר פסולת, כולל כמויות גדולות של פסולת המיאלין עשיר השומנים. ההשלכות neuropathological של BMDM חדירה של המיאלין פסולת phagocytosis בתוך מערכת העצבים הן מורכבות לא הבין היטב. הפרוטוקולים המתוארים כאן, לאפשר לחקר ישירה במבחנה BMDMs בהקשר של פגיעה CNS. אנחנו מכסים בידוד BMDM מאתר ואת התרבות המיאלין פסולת הכנה, מבחני להעריך BMDM מיאלין פסולת phagocytosis. טכניקות אלה לתוצאות לכימות חזקים ללא צורך משמעותי ציוד מיוחד או חומרים, עדיין ניתן בקלות להתאים אישית לצרכים של החוקרים.

טיפול של BMDMs עם CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אמור להניב ברור הפנמה (איור 2). בעוד זמן האינטראקציה 3 שעות מספיקה עבור BMDMs phagocytose מספיק פסולת המיאלין נוסף לגילוי במורד הזרם חזקים, הצטברות תאיים יכול להיות שנצפו עם מעט ככל 1 שעה של אינטראקציה. עם זאת, יש שרידים המיאלין עדיין ייתכן בהווה על פני התא לאחר הרחצה. זה יכול להיות בגלל כביסה לא מספיק, או לא להיות מלא הפנימו כבר בשלבים המוקדמים של phagocytosis חלקיקים.
בעוד BMDMs במהירות יכול להפנים את המיאלין פסולת, ע...

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך פגוציטוזיס מקרופאגים שמקורם במח עצם של פסולת מיאלין שמקורה במוח. פרוטוקול זה נועד לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוטראומה. היתרון של שיטה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח יעיל וחסכוני יחסית של תגובות מקרופאגים במבחנה, במיוחד היכולת הפגוציטית של מקרופאגים שמקורם במח עצם לפסולת מיאלין.ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי לחקור את ההשפעות של מודולטורים חיצוניים. לאחר שהרווינו את העכבר ב-70% אתנול, צרו פתח בעור הבטן. משוך את העור לאחור כדי לחשוף את הרגליים לדיסקציה.הקפד לא לנקב את חלל הצפק במהלך תהליך זה. לאחר החשיפה, הסר את הרגליים על ידי חיתוך בקרסול ובירך. הניחו את הרגליים ב-PBS קר כקרח בתוספת אנטיביוטיקה.יש לחזור על הפעולה עבור הרגל השנייה. יש לשטוף את הטישו ב-PBS טרי קר כקרח בתוספת אנטיביוטיקה כדי לעקור חלקיקים שעלולים להידבק לרקמה במהלך הדיסקציה. תנועת גירוד עדינה המופעלת לאורך השריר תעקור את רוב הרקמה הלא רצויה.בעזרת אזמל ופינצטה, שחרר את השוקה מהשריר ורקמת החיבור. לאחר השחרור, הסר את שני הקצוות כדי לחשוף את חלל מח העצם. חזור על תהליך זה עבור עצם הירך.הצמד מחט בקוטר 25 למזרק בקוטר 20 מילימטר מלא במצע מקרופאגים שמקורו במח עצם. ואז לשטוף את חלל מח העצם. העצם תיראה לבנה כאשר היא סמוקה מספיק.מערבב את מח העצם שנאסף עם מחט בגודל 18 למשך 30 עד 90 שניות על מנת להשיג תרחיף תא בודד. לאחר מכן העבירו את המתלה דרך מסננת תאים סטרילית בגודל 70 מיקרומטר. חלקו באופן שווה את תרחיפי התאים בכלי תרבית תאים בגודל 145 סנטימטר.כל עכבר יספיק לשלוש מנות בסך הכל. לאחר שבעה ימים של תרבית, מנות אלה יהיו בדרך כלל בין 70 ל-80% עם מקרופאגים בוגרים. כדי לבודד פסולת מיאלין גולמית מהמוח, מתבצעת סדרה של שלבי אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע סוכרוז.בתור התחלה, 10 עד 12 מוחות מנותחים מעכברים בגילאי שמונה עד עשרה שבועות. לאחר מכן המוחות הומוגניים בתמיסת סוכרוז מולרית של 0.32, ולאחר מכן מונחים על כרית תמיסת סוכרוז מולרית של 0.383 כדי ליצור שיפוע לא רציף. לאחר הצנטריפוגה, פסולת המיאלין הגולמית נמצאת בממשק בין השכבות.זה נאסף ומועבר לתמיסת חיץ Tris ומצנטריפוגה שוב כדי לגלול את פסולת המיאלין. הגלולה מושעה שוב בתמיסת חיץ Tris ומפוצלת בין שני צינורות לסנטריפוגה נוספת. כדי להתחיל, הסר את כל המוח והניח אותו בכלי עם תמיסת סוכרוז 0.32 טוחנת קרה כקרח.בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים, חתכו את המוחות שנאספו לחתיכות בגודל של כחמישה מילימטרים. שלב זה מסייע בתהליך ההומוגניזציה שלאחר מכן. אוספים את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר.בעזרת הומוגנייזר סיבובי, הומוגניזציה של הרקמה לתערובת חלקה. ודא שכל מוצקי המוח הגדולים הנראים לעין עברו הומוגניות יסודית. לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה המכיל 20 מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית 0.83, ליצור ולהומוגניזציה, תוך הקפדה על שמירה על ההפרדה.אזנו בזהירות כל שפופרת באמצעות תמיסת סוכרוז מולרית 0.32. לאחר שתסיים, העבירו את הצינורות לרוטור צנטריפוגה מתאים וסובבו במשך 45 דקות בכוח הכבידה פי 100, 000 פעמים כוח הכבידה, ארבע מעלות צלזיוס. ודא שההאצה וההאטה מוגדרות לערכי המינימום שלהן.לאחר השלמת הצנטריפוגה, פסולת המיאלין תהיה גלויה בין ממשק צפיפות הסוכרוז. אסוף בעדינות את שאריות המיאלין. לאחר האיסוף, הוסף מאגר טריס לפסולת המיאלין.הומוגניזציה שוב עם הומוגנייזר סיבובי. חלקו את ההומוגנאט בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה נקיים ואזנו את הצינורות לפי הצורך עם מאגר טריס נוסף. צנטריפוגה את פסולת המיאלין שנאספה שוב בכוח הכבידה פי 100,000, ארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כאשר התאוצה וההאטה מוגדרות לערכים המקסימליים שלהן.לאחר צנטריפוגה, המיאלין יעבור כדורים. בעזרת מאגר Tris, השעו מחדש את הגלולה. שלב שוב את המתלים והאולטרה-צנטריפוגה.לאחר הצנטריפוגה נוצרת גלולה ארוזה היטב. שפכו את הסופרנט. השעו מחדש את הגלולה ב-PBS סטרילי.חלקו באופן שווה את פסולת המיאלין המרחפת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה שקולים מראש. לאחר צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 22, 000, הסר את ה-PBS supernate. לאחר שקילת הגלולה, יש להשעות לריכוז של 100 מיליגרם למיליליטר בעזרת PBS.פסולת המיאלין הגולמית שנוצרה מתאימה כעת לחקר פגוציטוזיס. ניתן להשתמש בפסולת מיאלין לתיוג CFSE כדי לעקוב אחר הפנמה מוקדמת כמו גם סחר תוך תאי. פסולת מיאלין ללא תווית תואמת לצביעת שומנים Oil Red-O כדי להעריך את האחסון והמטבוליזם של השומנים המופנמים.אם אתה משתמש בפסולת מיאלין שאוחסנה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, תחילה תרצה להשעות מחדש עם מחט בגודל 29. השעו מחדש 10 מיליגרם של פסולת מיאלין ב-200 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת CFSE של חמישה מילי-מולריות.פיפטה לערבב. לאחר דגירה של 30 דקות, מוגנת מפני אור ושטיפה לאחר מכן, השעו מחדש את פסולת המיאלין ל-100 מיליגרם למיליליטר עם PBS. לאחר תרבית וקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד, הוסף 100% פרופילן גליקול לכל באר.לאחר הדגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו תמיסת צביעה Oil Red-O לכל באר. דגירה במשך שמונה דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. הטה בעדינות את הצלחת כדי לאפשר שאיפה מלאה של כתם השמן Red-O.לכל באר מוסיפים 85% פרופילן גליקול. לאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, שטפו בארות עם PBS ותאי כתמים עם צבע גרעיני לבחירתכם. תמונות מיקרוסקופ אור מייצגות של תאי מח עצם במהלך התרבית.24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, קיימים מעט תאים דבקים. עם זאת, בנוכחות גורם מגרה מושבת מקרופאגים, M-CSF, תאי מבשר לויקוציטים מתחילים לעבור התמיינות. לאחר שבעה ימים של תרבית בנוכחות M-CSF, תאי מבשר מתמיינים לחלוטין למקרופאגים בוגרים שמקורם במח עצם המסוגלים לפגוציטוזה.בשיטה זו, עכבר שחור C57 6J יחיד בן שמונה עד 10 שבועות יניב בדרך כלל 18 עד 24 מיליון מקרופאגים של מח עצם. כדי להמחיש את ההפנמה, פסולת מיאלין המסומנת ב-CFSE מתווספת לתרביות מקרופאגים שמקורן במח העצם. התאים טופלו בפסולת מיאלין של מיליגרם אחד למיליליטר CFSE במשך שעה אחת לפני שטיפה וקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד.ניתן לדמיין פסולת מיאלין מופנמת באמצעות ערכות מסנני GFP סטנדרטיות במיקרוסקופ בעל יכולת אפיפלואורסצנטית. כדי להדגים כיצד הצטברות שומני מיאלין משתנה עם הזמן, מקרופאגים טופלו בפסולת מיאלין ללא תווית במשך 90 דקות, ולאחר מכן נשטפו וקובעו בנקודות זמן שונות. מיד לאחר הכביסה נראות מעט טיפות שומנים.עם זאת, ככל שהזמן מתקדם, טיפות שומן נוספות נראות ומגיעות למקסימום כ-24 שעות לאחר הכביסה. מקרופאגים יתחילו לעבור חילוף חומרים לפליטה למאגרי שומנים, מה שיפחית את מספר הטיפות המוכתמות. כדי לכמת צביעת שמן Red-O, חמש תמונות שהתקבלו באקראי מכל דגימת נקודת זמן התקבלו באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת אפיפלואורסצנטית.האזור המוכתם באדום נפט נקבע עבור כל באר באמצעות תמונות שצולמו בערוץ DsRed. מספר התאים הכולל נקבע על ידי ספירת מספר הגרעינים הקיימים בכל שדה. גרף זה מציג את הכימות המתקבל.עלייה מתמדת באות החיובי של שמן Red-O היא אופיינית, שכן המקרופאגים שמקורם במח העצם ממירים שומני מיאלין מופנמים לשומנים ניטרליים. ירידה באות החיובי של שמן אדום-O מגיעה לאחר השיא ב-24 שעות כאשר מקרופאגים מתחילים לעכל או להוציא את השומנים. לאחר שצפיתם בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד לבודד ולתרבת מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח העצם, כמו גם כיצד לחקור את האינטראקציה שלהם עם פסולת מיאלין שמקורה במוח מבודד טרי.החלק החשוב ביותר בהליכים אלה הוא תחזוקה נכונה של טכניקה אספטית בכל עת. מכיוון שמקרופאגים יכולים להגיב בעוצמה לכמויות קטנות של מולקולות הקשורות לפתוגן, זה קריטי למזער כל אינטראקציה פוטנציאלית שיכולה להטות את התוצאות. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהן מייצרות לנו תאים ראשוניים רלוונטיים מבחינה ביולוגית ופסולת מיאלין טרייה, תוך ביטול כמות הציוד המיוחד הדרוש.בנוסף, עם אופטימיזציה מסוימת של המשתמש, ניתן להתאים את השיטות הללו בקלות כדי לענות על מגוון רחב של שאלות הנוגעות לתגובה של מקרופאגים שמקורם במח העצם לפסולת מיאלין. על ידי שימוש הן בפסולת מיאלין המסומנת בפלורסנט והן בצביעה של שמן Red-O של מקרופאגים מיאליניים, ניתן לחקור התערבויות טיפוליות פוטנציאליות לחולים הסובלים ממגוון נוירוטראומה. המטרה הכוללת של עבודה כזו היא פינוי פסולת תאית מרחוק בתיווך מקרופאגים כדי לקדם את פתרון הדלקת.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.

חזותי exocytosis ללא ממס של Neoformans קריפטוקוקוס מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

הפרוטוקול הנוכחי תוכנן כדי להעריך את ההשפעה של גירוי מגנטי חוזר על יכולתה של מיקרוגליה לפגוציטוזה של פסולת מיאלין. מערכת תרבית משותפת של מיקרוגליה ופסולת מיאלין במבחנה הוקמה לשם כך.

הערכת פגוציטוזיס מיקרוגליאלי של פסולת מיאלין במבחנה תחת גירוי מגנטי חוזר

למדו להעריך את יכולת הפגוציטוזה של מקרופאגים מח עצם עכבריים כלפי פסולת מיאלין מסומנת בפלורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל וחסכוני של תגובות מקרופאגים בתרבית לחקר נוירוטראומה.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

גלה סרטונים נוספים