במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך פגוציטוזיס מקרופאגים שמקורם במח עצם של פסולת מיאלין שמקורה במוח. פרוטוקול זה נועד לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוטראומה. היתרון של שיטה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח יעיל וחסכוני יחסית של תגובות מקרופאגים במבחנה, במיוחד היכולת הפגוציטית של מקרופאגים שמקורם במח עצם לפסולת מיאלין.

ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי לחקור את ההשפעות של מודולטורים חיצוניים. לאחר שהרווינו את העכבר ב-70% אתנול, צרו פתח בעור הבטן. משוך את העור לאחור כדי לחשוף את הרגליים לדיסקציה.

הקפד לא לנקב את חלל הצפק במהלך תהליך זה. לאחר החשיפה, הסר את הרגליים על ידי חיתוך בקרסול ובירך. הניחו את הרגליים ב-PBS קר כקרח בתוספת אנטיביוטיקה.

יש לחזור על הפעולה עבור הרגל השנייה. יש לשטוף את הטישו ב-PBS טרי קר כקרח בתוספת אנטיביוטיקה כדי לעקור חלקיקים שעלולים להידבק לרקמה במהלך הדיסקציה. תנועת גירוד עדינה המופעלת לאורך השריר תעקור את רוב הרקמה הלא רצויה.

בעזרת אזמל ופינצטה, שחרר את השוקה מהשריר ורקמת החיבור. לאחר השחרור, הסר את שני הקצוות כדי לחשוף את חלל מח העצם. חזור על תהליך זה עבור עצם הירך.

הצמד מחט בקוטר 25 למזרק בקוטר 20 מילימטר מלא במצע מקרופאגים שמקורו במח עצם. ואז לשטוף את חלל מח העצם. העצם תיראה לבנה כאשר היא סמוקה מספיק.

מערבב את מח העצם שנאסף עם מחט בגודל 18 למשך 30 עד 90 שניות על מנת להשיג תרחיף תא בודד. לאחר מכן העבירו את המתלה דרך מסננת תאים סטרילית בגודל 70 מיקרומטר. חלקו באופן שווה את תרחיפי התאים בכלי תרבית תאים בגודל 145 סנטימטר.

כל עכבר יספיק לשלוש מנות בסך הכל. לאחר שבעה ימים של תרבית, מנות אלה יהיו בדרך כלל בין 70 ל-80% עם מקרופאגים בוגרים. כדי לבודד פסולת מיאלין גולמית מהמוח, מתבצעת סדרה של שלבי אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע סוכרוז.

בתור התחלה, 10 עד 12 מוחות מנותחים מעכברים בגילאי שמונה עד עשרה שבועות. לאחר מכן המוחות הומוגניים בתמיסת סוכרוז מולרית של 0.32, ולאחר מכן מונחים על כרית תמיסת סוכרוז מולרית של 0.383 כדי ליצור שיפוע לא רציף. לאחר הצנטריפוגה, פסולת המיאלין הגולמית נמצאת בממשק בין השכבות.

זה נאסף ומועבר לתמיסת חיץ Tris ומצנטריפוגה שוב כדי לגלול את פסולת המיאלין. הגלולה מושעה שוב בתמיסת חיץ Tris ומפוצלת בין שני צינורות לסנטריפוגה נוספת. כדי להתחיל, הסר את כל המוח והניח אותו בכלי עם תמיסת סוכרוז 0.32 טוחנת קרה כקרח.

בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים, חתכו את המוחות שנאספו לחתיכות בגודל של כחמישה מילימטרים. שלב זה מסייע בתהליך ההומוגניזציה שלאחר מכן. אוספים את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר.

בעזרת הומוגנייזר סיבובי, הומוגניזציה של הרקמה לתערובת חלקה. ודא שכל מוצקי המוח הגדולים הנראים לעין עברו הומוגניות יסודית. לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה המכיל 20 מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית 0.83, ליצור ולהומוגניזציה, תוך הקפדה על שמירה על ההפרדה.

אזנו בזהירות כל שפופרת באמצעות תמיסת סוכרוז מולרית 0.32. לאחר שתסיים, העבירו את הצינורות לרוטור צנטריפוגה מתאים וסובבו במשך 45 דקות בכוח הכבידה פי 100, 000 פעמים כוח הכבידה, ארבע מעלות צלזיוס. ודא שההאצה וההאטה מוגדרות לערכי המינימום שלהן.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, פסולת המיאלין תהיה גלויה בין ממשק צפיפות הסוכרוז. אסוף בעדינות את שאריות המיאלין. לאחר האיסוף, הוסף מאגר טריס לפסולת המיאלין.

הומוגניזציה שוב עם הומוגנייזר סיבובי. חלקו את ההומוגנאט בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה נקיים ואזנו את הצינורות לפי הצורך עם מאגר טריס נוסף. צנטריפוגה את פסולת המיאלין שנאספה שוב בכוח הכבידה פי 100,000, ארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כאשר התאוצה וההאטה מוגדרות לערכים המקסימליים שלהן.

לאחר צנטריפוגה, המיאלין יעבור כדורים. בעזרת מאגר Tris, השעו מחדש את הגלולה. שלב שוב את המתלים והאולטרה-צנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה נוצרת גלולה ארוזה היטב. שפכו את הסופרנט. השעו מחדש את הגלולה ב-PBS סטרילי.

חלקו באופן שווה את פסולת המיאלין המרחפת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה שקולים מראש. לאחר צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 22, 000, הסר את ה-PBS supernate. לאחר שקילת הגלולה, יש להשעות לריכוז של 100 מיליגרם למיליליטר בעזרת PBS.

פסולת המיאלין הגולמית שנוצרה מתאימה כעת לחקר פגוציטוזיס. ניתן להשתמש בפסולת מיאלין לתיוג CFSE כדי לעקוב אחר הפנמה מוקדמת כמו גם סחר תוך תאי. פסולת מיאלין ללא תווית תואמת לצביעת שומנים Oil Red-O כדי להעריך את האחסון והמטבוליזם של השומנים המופנמים.

אם אתה משתמש בפסולת מיאלין שאוחסנה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, תחילה תרצה להשעות מחדש עם מחט בגודל 29. השעו מחדש 10 מיליגרם של פסולת מיאלין ב-200 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת CFSE של חמישה מילי-מולריות.

פיפטה לערבב. לאחר דגירה של 30 דקות, מוגנת מפני אור ושטיפה לאחר מכן, השעו מחדש את פסולת המיאלין ל-100 מיליגרם למיליליטר עם PBS. לאחר תרבית וקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד, הוסף 100% פרופילן גליקול לכל באר.

לאחר הדגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו תמיסת צביעה Oil Red-O לכל באר. דגירה במשך שמונה דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. הטה בעדינות את הצלחת כדי לאפשר שאיפה מלאה של כתם השמן Red-O.

לכל באר מוסיפים 85% פרופילן גליקול. לאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, שטפו בארות עם PBS ותאי כתמים עם צבע גרעיני לבחירתכם. תמונות מיקרוסקופ אור מייצגות של תאי מח עצם במהלך התרבית.

24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, קיימים מעט תאים דבקים. עם זאת, בנוכחות גורם מגרה מושבת מקרופאגים, M-CSF, תאי מבשר לויקוציטים מתחילים לעבור התמיינות. לאחר שבעה ימים של תרבית בנוכחות M-CSF, תאי מבשר מתמיינים לחלוטין למקרופאגים בוגרים שמקורם במח עצם המסוגלים לפגוציטוזה.

בשיטה זו, עכבר שחור C57 6J יחיד בן שמונה עד 10 שבועות יניב בדרך כלל 18 עד 24 מיליון מקרופאגים של מח עצם. כדי להמחיש את ההפנמה, פסולת מיאלין המסומנת ב-CFSE מתווספת לתרביות מקרופאגים שמקורן במח העצם. התאים טופלו בפסולת מיאלין של מיליגרם אחד למיליליטר CFSE במשך שעה אחת לפני שטיפה וקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד.

ניתן לדמיין פסולת מיאלין מופנמת באמצעות ערכות מסנני GFP סטנדרטיות במיקרוסקופ בעל יכולת אפיפלואורסצנטית. כדי להדגים כיצד הצטברות שומני מיאלין משתנה עם הזמן, מקרופאגים טופלו בפסולת מיאלין ללא תווית במשך 90 דקות, ולאחר מכן נשטפו וקובעו בנקודות זמן שונות. מיד לאחר הכביסה נראות מעט טיפות שומנים.

עם זאת, ככל שהזמן מתקדם, טיפות שומן נוספות נראות ומגיעות למקסימום כ-24 שעות לאחר הכביסה. מקרופאגים יתחילו לעבור חילוף חומרים לפליטה למאגרי שומנים, מה שיפחית את מספר הטיפות המוכתמות. כדי לכמת צביעת שמן Red-O, חמש תמונות שהתקבלו באקראי מכל דגימת נקודת זמן התקבלו באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת אפיפלואורסצנטית.

האזור המוכתם באדום נפט נקבע עבור כל באר באמצעות תמונות שצולמו בערוץ DsRed. מספר התאים הכולל נקבע על ידי ספירת מספר הגרעינים הקיימים בכל שדה. גרף זה מציג את הכימות המתקבל.

עלייה מתמדת באות החיובי של שמן Red-O היא אופיינית, שכן המקרופאגים שמקורם במח העצם ממירים שומני מיאלין מופנמים לשומנים ניטרליים. ירידה באות החיובי של שמן אדום-O מגיעה לאחר השיא ב-24 שעות כאשר מקרופאגים מתחילים לעכל או להוציא את השומנים. לאחר שצפיתם בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד לבודד ולתרבת מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח העצם, כמו גם כיצד לחקור את האינטראקציה שלהם עם פסולת מיאלין שמקורה במוח מבודד טרי.

החלק החשוב ביותר בהליכים אלה הוא תחזוקה נכונה של טכניקה אספטית בכל עת. מכיוון שמקרופאגים יכולים להגיב בעוצמה לכמויות קטנות של מולקולות הקשורות לפתוגן, זה קריטי למזער כל אינטראקציה פוטנציאלית שיכולה להטות את התוצאות. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהן מייצרות לנו תאים ראשוניים רלוונטיים מבחינה ביולוגית ופסולת מיאלין טרייה, תוך ביטול כמות הציוד המיוחד הדרוש

בנוסף, עם אופטימיזציה מסוימת של המשתמש, ניתן להתאים את השיטות הללו בקלות כדי לענות על מגוון רחב של שאלות הנוגעות לתגובה של מקרופאגים שמקורם במח העצם לפסולת מיאלין. על ידי שימוש הן בפסולת מיאלין המסומנת בפלורסנט והן בצביעה של שמן Red-O של מקרופאגים מיאליניים, ניתן לחקור התערבויות טיפוליות פוטנציאליות לחולים הסובלים ממגוון נוירוטראומה. המטרה הכוללת של עבודה כזו היא פינוי פסולת תאית מרחוק בתיווך מקרופאגים כדי לקדם את פתרון הדלקת.