Name: ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למד שיטה ביוכימית ללא תאים למדידת תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation בליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. השיטה מספקת תוצאות מהירות ואמינות למחקר מחלות לב וכלי דם ומחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מאשר בתודה את העבודה של ד ר פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן Reddy סריניוואסה עבור שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. T.A.A. נתמך על ידי RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. AJ AH נתמכים על ידי מענק פרוייקט NHMRC 1108792. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # µL1TR000124.

כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו עם אתיקה אישור מהאוניברסיטה של קליפורניה בלוס אנג'לס, לוס אנג'לס, ועדת האתיקה האנושית של החולים אלפרד, מלבורן.
 הערה: ישנן וריאציות רבות של הפונקציה fluorochrome HDL Assay (ראה דיון) 32. להלן נתאר את פרוטוקול זה נותן תוצאות עקביות ביותר לשחזור. סקירה כללית של וזמינותו מוצגת באיור 2.
 1. עיבוד הדגימה <ol><li>שימוש בסרום טריים, ללא hemolyzed (יכול להיות שנאספו סרום מפריד צינורות) או ציטראט פלזמה שהושג לאחר 12-14 שעות צום. אם באמצעות דגימות cryopreserved, לכלול הפקד המתאים כמתואר פרוטוקול זה.</li>
</ol> 2. יום 0-הכנה וזמינותו <ol><li>הכן פריסת עבודה של ניסוי עם הפקדים המתאימים, דוגמאות ושכפול של. להפעיל כל מדגם לפחות triplicates. פריסה טוב נציג 96 מוצג באיור 3.</li>
	<li>לחשב את כל אמצעי האחסון של ריאגנטים שישמש עבור וזמינותו מבוסס על מספר דוגמאות ומשוכפלת. 
	הערה: כוללים אמצעי אחסון 10% נוספים במלאי כל עבודה ' כדי לוודא שאין מספיק נפח עבור כל ריאגנט לניסוי מסוים.</li>
	<li>תווית צינורות כל הנדרש עבור כל השלבים השונים של וזמינותו למשל לצורך הקמת מכשול ההפרדה של HDL, מדידה של ה-HDL-C (אופציונלי) את fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. יום 1-הכנה של פקדים <ol><li>הכנת בקרה במאגר המחקר הספציפיים <ol><li>צור דגימת הבקרה פלזמה במאגר או סרום של לימוד כל הדגימות. אם פועל 20 דגימות בצלחת כל דולר, לשלב 10 µL מן כל מדגם פקד µL 200 איחדו. תן aliquot נפרדים של פקד במאגר זה למעבדה קלינית כדי לקבוע את הערך ה-HDL-C של פקד זה. 
		הערה: השתמש בפקד במאגר זה כדי לתקנן וזמינותו ולהתחשב ידוע אפשרי (למשל סוג של מטריקס נסיוב נגד פלזמה, מחזורים ההקפאה-הפשרה, הקפאה קריוגנית) ו- confounders לא ידוע שעשויים להשפיע על השתנות ניסיוני 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>הכנה של בקרת איכות מעבדה ספציפי (QCs) <ol><li>להכין מלאי גדול של HDL במעבדה כל (לדוגמה HDL מבודד 5 מ ל פלסמה מתורמים בריאים 10), cryopreserve aliquots מספר על זה מניות כדי למזער מחזורים ההקפאה-הפשרה.</li>
		<li>שימוש לפחות 10 שונים משכפל מן המניה הזו כדי לקבוע את הערך הממוצע של HDLox. טווח מקובל HDLox נמדדו הערכים עבור כל דגימה QC כלולים כל assay נמצא במרחק &lt; 15% של המקדם של וריאציה של ערך ממוצע זה.</li>
		<li>Aliquot נפרדים של פקד במאגר זה לתת המעבדה הקלינית כדי לקבוע את הערך ה-HDL-C של פקד זה (למשל 40 מ"ג/ד"ל). 
		הערה: בגישה מפורט כיצד להשתמש דם בנקי דם כדי ליצור פקדים אלה קודם לכן כבר מתואר 27 , 28 , 32. השתמש QCs נוספים לפי הצורך (למשל אחד מתורם בריא ידוע תפקוד תקין של HDL ואחד מתורם ידוע פונקציית ה-HDL במידה רבה חריג.</li>
	</ol></li> <li>אופטימיזציה של האות רקע וערכים ריקים (אופציונלי) <ol><li>כדי למזער את הרקע, להוסיף את הכמות המתאימה של קטלאז (1-4 U/mL) המדיום הדגירה כדי להסיר במהירות את יצרו H 2 O 2 עקב חמצון אוויר ספונטני של מאגרי. 
		הערה: מאז הערכים מן הבארות ריק (אין HDL) הם להיות מופחתים לפי הערכים של הדגימות HDL, התוצאות מתבצעת דיווח ביחס פקד במאגר (הכלול באותה צלחת טוב 96), מצאנו כי שלב זה עושה לא ממש affec t התוצאות. לפיכך, אופטימיזציה של האות רקע עם קטלאז יכול להיות מושמט, במידת הצורך.</li>
	</ol></li></ol> 4. יום 1-הפרדה של כולסטרול HDL באמצעות ה-HDL משקעים הערה: השתמש זמינים מסחרית סטנדרטית כולסטרול HDL שיכלו ריאגנט כדי לבודד apoB דלה סרום לפי היצרן ' s הוראות. נוגדנים אלה נמצאים בשימוש נרחב מבחני ערכי צבע מוחלטים כדי לקבוע רמות הכולסטרול HDL-
<ol><li>להשתמש טרי (או להפשיר) מדגם פלזמה או סרום.</li>
	<li>לערבב נפחים שווים (למשל µL 80) של פלאזמה ו- HDL כולסטרול מאיצים ריאגנט (20% w/v פוליאתילן גליקול במאגר גליצין ב- pH 10.0 (25 ° C)).</li>
	<li>לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>צנטריפוגה 1000-2000 x g עבור 10 דקות</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע (HDL שבר).</li>
	<li>אידיאלי לשימוש באופן מיידי HDL מבודד fluorochromeassay של ה-HDL השומנים peroxidation. עם זאת, אם מספר דגימות מופעלים באותו יום השני צעדים כגון מדידת ריכוז כולסטרול HDL גם נעשים, אז לאחסן HDL מבודדים ב 4 ° C ולהשתמש בו למחרת עבור הפונקציה fluorochromeHDL Assay.</li>
</ol> 5. יום 1-קביעת ה-HDL-C ב- HDL המבודד הערה: פעולה זו היא אופציונלית אם הערך של ה-HDL-C מן המעבדה הקלינית משמש לנרמל את HDLox לפי כמות ה-HDL-C.
<ol><li>Quantify ה-HDL-כולסטרול מן פלזמה, באמצעות תקן ערכי צבע מוחלטים מבחני 27. מוסיפים 50 µL של כולסטרול ריאגנט מכל קידוח, לקבוע ריכוז הכולסטרול באמצעות קורא צלחת ערכי צבע מוחלטים כולסטרול הסטנדרטי שסופק בערכה לכל.</li>
</ol> 6. יום 2-הכנה של ריאגנטים <ol><li>פתרונות HRP להכין וכולסטרול בפתרון HRP 5 U/mL (טווח 1-10 U/mL).</li>
	<li>להכין 20 מ מ fluorochrome (למשל, Amplex אדום) פתרונות: הפשרת בקבוקון של ריאגנט fluorochrome, דימתיל סולפוקסיד לטמפרטורת החדר. לפני שימוש, להתמוסס ריאגנט fluorochrome (מ ג 1) ב- µL 200 של דימתיל סולפוקסיד. לאחסן פתרון מניות קפוא ב ≤-20 ° C, מוגן מפני אור.</li>
	<li>להכין פקדים חיובית ושלילית: שימוש 1 X ' התגובה מאגר ' ללא כולסטרול ו- 20 מ מ H 2 O 2 עובד פתרון פקד שליליים או חיוביים, בהתאמה.</li>
</ol> 7. יום 2-Fluorochrome Assay <ol><li>µL להוסיף 50 1 x תגובת מאגר כמו ריק (שליטה שלילי).</li>
	<li>אופציונלי: להוסיף 20 מ מ הפתרון עובד של 2 O H 2 כפקד חיובי בצלחת לכל.</li>
	<li>כדי למזער את השתנות ניסיוני ולהבטיח כי תוספת של ריאגנטים ודוגמאות נעשים באופן עקבי ולבצע מבעוד, כל התוספות של דגימות בצלחת נפרדת 96 טוב סיבוב למטה, ברור, פוליסטירן או פוליפרופילן (לוח 1). ואז להשתמש פיפטה רב-ערוצי להעביר אמצעי אחסון ספציפי לוחות 96-ובכן 3 (2-4 צלחות: פוליפרופילן, שטוח בוט. טום, שחור) (כי יש פריסה זהה) ( איור 2, איור 3).
	<ol><li>לדוגמה, להוסיף µL 160 של HDL מבודד לתוך כל טוב/מדגם של צלחת 1 ולאחר מכן עם השימוש של פיפטה רב-ערוצי להעביר 50 µL של HDL-כולסטרול מן כל טוב/מדגם לוחות שחורים 96-ובכן. לשנות טיפים בין כל שורה/עמודה ולהשתמש טיפים בלי פילטר של כל ההעברות.</li>
	</ol></li> <li>להשאיר דוגמאות הבארות. אל תמחק. ישנם שלבים שטיפת אין בין תוספת של ריאגנטים.</li>
	<li>µL להוסיף 50 בפתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) כדי מכל קידוח. 
	הערה: שימוש HRP לפני התוספת של הכימית fluorochrome.</li>
	<li>תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. אל תמחק קבצי דגימות לאחר דגירה (אין מדרגות שטיפת בין תוספות של ריאגנטים).</li>
	<li>להוסיף 50 µL של fluorochromereagent עבור ריכוז סופי של 300 מיקרומטר. בשלב זה, התגובה הכולל אחסון הוא 150 µL. לערבב היטב, להגן מפני אור.</li>
	<li>להעריך את המדידה פלורסנט (בחושך) כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים). 
	הערה: השתמש למרווח זמן קצר יותר 60 דקות עם דגימות טריות. מצאנו assay 120 דקות זה נותן יותר לשחזור נתונים עם השימוש של דגימות cryopreserved.</li>
	<li>להקליט נתונים באמצעות תוכנה מתאימה-</li>
</ol> 8. יום 3-נתונים ניתוח <ol><li>להקליט יחידות קרינה פלואורסצנטית (שרירותי יחידות) ב 120 דקות לאחר תוספת של fluorochrome מגיב על כל הדגימות לרבות בארות ריק וכל פקדי.</li>
	<li>לחשב את הערך הממוצע של יחידות קרינה פלואורסצנטית (בהתבסס על פחות triplicates) (HDL ox_sample). אל תקחו ליניאריים (&gt; 2 מרחביות מהערך הממוצע) תוך התחשבות.</li>
	<li>להפחית קרינה פלואורסצנטית על רקע באמצעות המשוואה הבאה: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>נורמליזציה עבור כמות כולסטרול ה-HDL (HDL-C): לנרמל את הערך peroxidation השומנים HDLox עבור כל דגימה (כולל את הפקד במאגר) על ידי ה-HDL-C) (מ"ג/ד"ל). לאורך כל המקטע תוצאות, מוצג HDL שור n (HDL-C) HDLox מידה כדי לשקף את ההתאמה עבור ה-HDL-C. להשתמש במשוואה הבאה: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>לתקנן את הביטוי של HDLox שומנים בדם peroxidation ערך של כל מדגם נגד הערך של פקד במאגר. לנרמל את n (HDL-C) HDLox השומנים peroxidation ערך עבור כל דגימה (מותאם HDL-C) מאת n (HDL-C) HDLox השומנים peroxidation ערך הפקד במאגר. לאורך כל המקטע תוצאות, HDL שור מוצגת כאמצעי שור nHDL כדי לשקף את ההתאמה עבור השתנות ניסיוני ו- HDL-C. להשתמש במשוואה הבאה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> הערה: גישה זו דומה גישות אחרות ניסיוני הוקמה כדי להפחית את השתנות ניסיוני של מדידות כגון הבינלאומי מנורמל יחס (INR) 44 , 45. גישה זו אומתה ב מחקרים קליניים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.</li> <li>לבצע בקרת איכות של תוצאות הניסוי באמצעות דגימות תקן בקרת איכות. בכל מעבדה צריך ליצור פקדים איכות משלהם (QCs). אידיאלי יש QC עבור nHDLox מתוך מדגם עם HDL ידוע לא מתפקדת, QC עבור nHDLox מתוך מדגם מתורמים בריאים [למשל שימוש במאגר מדגם מבוגרים צעירים אשר תורמים הקים בנק הדם ויש לא ידוע תחלואה נלווית, גורמי סיכון מחלות לב וכלי דם כולל עישון]. הפקד האחרון המשקלל תוצאות בין מעבדות שונות. הערכים הממוצע של אלה QCs הן הוקמה על בסיס לפחות 5 משכפל (בדרך כלל אנו משתמשים משכפל 10 בשלב זה חשוב).
	<ol><li>הסימון אם QCs נמדד בכל assay יש ערכים בתוך טווח הערכים הצפויים. בהנחה של השתנות מקובל ניסיוני מרבי של 15%, כל הערכים ניסיוני נמדד אמור ליפול בתוך 15% ממוצע הערכים הידועים של QC הוקמה. להשתמש את המשוואות הבאות: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> הערה: אם באחת בקרת האיכות כלול דוגמאות ( רגיל לעומת HDL לא מתפקדת) נותן HDLox ערכים מחוץ לטווח הצפוי (שהוקמה בשנת בכל מעבדה) ולאחר מכן לחזור על הניסוי.</li>
	</ol></li> <li>לבצע בקרת איכות של תוצאות הניסוי באמצעות המקדם של וריאציה (CV) לכמת השתנות ניסיוני: חזור על כל הדגימות עם CV % &gt; 15%. להשתמש במשוואה הבאה: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> הערה: אופייניות אינטרה-assay (בתוך באותה הצלחת) ולשינויים ניסיוני assay אינטר (בין לוחות שונים) הוא &lt; 15%-2) טיפוסי אינטרה-assay CV היא בין 1-7% interassay טיפוסי CV הוא בין 3-10%.</li>
</ol>

זה הפרוטוקול ואת וזמינותו הרלוונטיים הפטנטים PCT/US2015/018147.

הפרוטוקול המתואר כאן מציע כלי חזקים כדי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL טרשת עורקים, מחלות אנושיות. וזמינותו מכמת את ה-HDL השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C באמצעות הגברה אנזימטי (HRP). גישה זו מונע המגבלות המוכרות של מבחני תפקוד HDL מוקדמת (למשל וזמינותו בזרימת כולסטרול) כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים טריגליצרידים7,15,32. קביעת הבי...

מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי רמות נמוכות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) המשויכים בדרך כלל הפוך הסיכון להתפתחות טרשת עורקים1,2. למרות מספר מחקרים תומכים תפקיד atheroprotective עבור ה-HDL1,2, המנגנון שבאמצעותו HDL נחלש החניכה, ההתקדמות של טרשת עורקים הוא מורכב 3,4. לפיכך, הוצע כי מורכבות המבנה והתפקוד של HDL ולא רמה מוחלטת עלולה יותר לחזות במדויק טרשת עורקים 5,6,7,8. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. אלו i) להפחית את פוטנציאל בזרימת 9שלה כולסטרול, ii) ירידה אנטי דלקתיות, ולהגביר את ה-HDL-הקשורים חלבונים פרו דלקתיים 6,7, של רמות פקטור של ירידה iii) נוגד חמצון ופעילות ו HDLs היכולת לעכב את חמצון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLox)10 ו- iv) להגדיל את השומנים hydroperoxide התוכן של חמצון-חיזור פעילות (HDLox)9,11. מבחני חזקים להעריך את הפונקציות pleotropic של ה-HDL (כגון כולסטרול בזרימת, נוגד חמצון פונקציה) ייתכן משלימים נחישות של HDL-HDL-C במרפאה.
פונקציית ה-HDL הוא בדרך כלל לאומדן מבוססת תא שיטות כגון כולסטרול בזרימת assay8,12,13,14. שיטות אלה יש מגבלות הגדולות כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים של טריגליצרידים 7,15. מחסרונות אלה מהווים קשיים על מחקרים קליניים גדולים16. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. בזרימת כולסטרול הוא אחד התפקידים החשובים ביותר של ה-HDL, אך זה יכול להיקבע רק על ידי מבחני מבוססת-תא. גישות אחרות כדי לקבוע את פונקציית ה-HDL כגון פרוטאומיקס17,18,19,20,21,22,23, 24 , מונוציט מבוססת תא מבחני כימוטקסיס של HDL פונקציה 17,22,25 לא סטנדרטית ואין אפשרות להשתמש במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול.
HDL יש נוגד חמצון משמעותית atheroprotective אפקט5,6,7,8. הפונקציה נוגד חמצון של HDL נקבע בנוכחות LDL לתא הקודם חינם מבחני fluorometric 26. השיטות fluorometric הביוכימי של HDL נוגד חמצון פונקציה פותחו במקור מאת פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן, הקולגות שלהם26. למרות מחקרים בבני אדם רבים השתמשו בשיטות אלה כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 17,18,19,20,21,22,23 ,24, השומנים (HDL)-שומנים בדם (LDL) ואינטראקציות השומנים-fluorochrome עלולה להגביל הפארמצבטית של אלה תא חינם-אנזימטי הביוכימי מבחני של HDL פונקציה27,28.
הריבית האחרונות התמקדה ההשלכות פונקציונלי של חמצון ה-HDL, שהוא התוצאה של חמצון של שומנים וחלבונים בתוך ה-HDL 27,29,30. מחקרים קודמים הראו כי חמצון של HDL פוגע HDL פונקציה 27,29,30. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. ובכך HDL השומנים חמצן תוכן שניתן להשתמש כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 9,17,20,31 ו נתן את המגבלות המוכרות של מבחני מוקדמת של HDL פונקציה7, 15,27,32, פיתחנו שיטה חלופית fluorometric זה מכמת HDL השומנים תוכן חמצן (HDLox) 32. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C 32. עקרון וזמינותו הביוכימי מוצג באיור1. אנחנו הראו כי גישה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אין המגבלות של27,מבחני תפקוד HDL מוקדמת28. יש כבר מעודן, סטנדרטית במעבדה שלנו כך זה יכול לשמש באופן אמין במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול, אפילו עם פלזמה cryopreserved 32,33,34, עוד יותר assay הזה 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. readout assay זו מזוהה עם המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך פנוטיפים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. כאן, אנו מתארים שיטה זו פשוטה, עדיין חזקים כדי למדוד את ה-HDL השומנים חמצן תוכן (HDLox). Assay הזה יכול לשמש ככלי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים)32.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים ניסיוניים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (פוליאתילן גליקול) מגיב משקע</td><td>פוינט מדעי</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>מגיב אדום אמפלקס.</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני</td></tr><tr><td>DMSO קל.</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני</td></tr><tr><td>צנון סוס קל פרוקסידאז (HRP)</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני</td></tr><tr><td>כולסטרול אסטראז קל.</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני</td></tr><tr><td>כולסטרול קל תקן</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני אור</td></tr><tr><td>Resorufin fluorescense תקן ייחוס</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני</td></tr><tr><td>מאגר תגובה קל פי 5.</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>A12216</td><td>ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. &bull; &le; &ndash; 20&deg; סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני אור</td></tr><tr><td>HDL כולסטרול אוטומטי ריאגנט</td><td>ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות (פוליפרופילן, תחתית שטוחה, שקוף).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות (פוליפרופילן, תחתית שטוחה, שחור).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל Eppendorf</td><td></td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, סטרילי</td><td>ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות רב-ערוציות תרמו סיינטיפיק, 8 ערוצים, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב.</td><td>&nbsp; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 תוכנה</td><td>Biotek, ורמונט, ארה"ב</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td> חברה</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 קורא צלחות</td><td>Biotek, ורמונט, ארה"ב</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ללא תא הביוכימי fluorometric assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

רמות הכולסטרול (HDL-C) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נמוך הם אחד החזקים ביותר מנבאות שלילי עצמאית של מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD). המבנה והתפקוד של HDL יותר מאשר ה-HDL-C אולי יותר לחזות במדויק טרשת עורקים. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. פונקציית ה-HDL נקבעת בדרך כלל לפי תא מבוסס מבחני כגון כולסטרול בזרימת assay אבל אלה מבחני יש חסרונות רבים, היעדר סטנדרטיזציה. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. HDL חמצון פוגע פונקציית ה-HDL. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. השומנים-בדיקה אינטראקציות להתייחס כאשר מבחני הנמצאות לפרש את התוצאות של זריחה אנזימטי למדידת מצב חמצון השומנים. זה הניע אותנו לפתח שיטה אנזימטי ללא תא ביוכימי כדי להעריך את ה-HDL חמצן תוכן שומני (HDLox) אשר תורם בתפקוד ה-HDL. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C. פרוטוקול זה קביעת describedfor peroxidation HDL-השומנים באמצעות הכימית fluorochrome. השתנות assay יכול להיות מופחת על ידי סטנדרטיזציה קפדנית של תנאי הניסוי. ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. Readout assay זו משויכת המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית אמצעים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית פנוטיפים סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך. גישה טכנית זו היא שיטה חזקה כדי להעריך פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים).

50 µL של כל מדגם ה-HDL מתווספים כל טוב כמו שלב 7.3. µL 50 של פתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.5. דוגמאות מודגרת למשך 30 דקות ב 37 ° C כמו שלב 7.6. µL 50 של ריאגנט fluorochrome יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.7 (הריכוז הסופי של 300 מיקרומטר). המדידה פלורסנט (בחושך) ואז שקובעת כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים). קרינה פלואורסצנטית נציג נתונים לשליטה ריק, במאגר, לדוגמה עם HDL לקוי ידוע ודגימת עם HDL נורמלי מוצגים <strong class="...

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

המטרה הכוללת של שיטה ניסיונית זו היא לקבוע את תפקודו של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה באמצעות בדיקה ביוכימית נטולת תאים המודדת את תכולת מי החמצן של כמות מסוימת של HDL. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במספר תחומי רפואה, כגון תפקידו של תפקוד HDL בהפרעות מטבוליות של מחלות לב וכלי דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה ביוכימית נטולת תאים שניתן להשתמש בה כדי לקבוע באופן אמין את תפקוד ה- HDL.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקידו של תפקוד HDL במחלות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים של מחלות, כגון מחלות דלקתיות. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את פריסת העבודה עבור לוח 96 הבארות, כולל הפקדים, הדגימות והשכפולים המתאימים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חשב את נפח הריאגנטים הדרושים על סמך מספר הדגימות והשכפולים.בעזרת טוש קבוע, סמן צינורות לכל שלב בבדיקה. לאחר מכן, שלב 10 מיקרוליטר מכל דגימה כדי ליצור דגימת בקרה מאוחדת. צור דגימת בקרה מאוגדת שנייה עבור המעבדה הקלינית, על מנת לקבוע את ערך ה-HDL-C.לאחר הכנת מלאי גדול של HDL, שמור בהקפאה מספר אליקוטים כדי למזער את מחזורי ההפשרה בהקפאה. אגד לפחות 10 שכפולים שונים כדי ליצור בקרת איכות במאגר. לאחר מכן, קבע את הערך הממוצע של HDLox כמתואר בפרוטוקול הטקסט.צור בקרת איכות משותפת שנייה עבור המעבדה הקלינית, על מנת לקבוע את ערך ה-HDL-C. כדי להתחיל, יש להפשיר דגימת פלזמה או סרום טרייה. מערבבים יחד כמויות שוות של פלזמה ומגיב מזרז כולסטרול HDL.פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב היטב. צנטריפוגה במהירות שבין 1000 ל -2000 פעמים G למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט.אחסן את ה-HDL המבודד בארבע מעלות צלזיוס עד שמוכן לבצע את בדיקת פונקציית ה-HDL של הפלואורוכרום. אם נעשה שימוש בערך HDL-C של המעבדה הקלינית כדי לנרמל את HDLox, כמת את ה-HDL-C מפלזמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, מערבבים כולסטרול ו- HRP, כך שהתמיסות המוכנות מכילות חמש יחידות למיליליטר HRP.להפשיר בקבוקון של ריאגנט פלואורוכרום ובקבוקון של DMSO לטמפרטורת החדר. לאחר הפשרתם, ממיסים מיליגרם אחד של מגיב פלואורוכרום ב -200 מיקרוליטר של DMSO. אחסן תמיסה זו בטמפרטורה מתחת למינוס 20 מעלות צלזיוס, תוך הגנה מפני אור.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר תגובה 1X לצלחת הדגימה כבקרה שלילית. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מי חמצן של 20 מילי-מולרי כבקרה חיובית. לאחר מכן, הניחו צלחת תחתונה עגולה טרייה עם 96 בארות שתשמש כצלחת ההכנה.הוסף 200 מיקרוליטר של HDL מבודד לכל באר של צלחת הכנה זו. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, העבירו 50 מיקרוליטר של HDL מלוח ההכנה ללוחות הניסוי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, כאשר מספר לוחות הניסוי שווה למספר השכפולים בבדיקה. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת HRP מוכנה לכל באר.דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר מגיב פלואורוכרום לכל באר, לנפח כולל של 150 מיקרוליטר לבאר. יש לערבב היטב ולהגן מפני אור. באמצעות קורא לוחות פלורסנט, הערך את קריאת הפלואורסצנט ב-37 מעלות צלזיוס, בחושך, כל דקה למשך 120 דקות.רשום את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה, ולאחר מכן חשב את הערך הממוצע של יחידות הקרינה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, פותחה בדיקה פלואורומטרית ביוכימית נטולת תאים כדי לכמת את תכולת מי החמצן של שומני HDL למיליגרם של HDL-C. זה מושג על ידי הגברה אנזימטית באמצעות HRP.לאחר מכן משתמשים בקורא לוחות פלואורסצנטיים כדי למדוד את הקרינה בחושך, כל דקה, למשך 120 דקות. נתונים מייצגים עבור מטופל הידוע כבעל HDL לא מתפקד מוצגים כאן, בהשוואה לבקרה המאוחדת. נראה כי ל-HDL הלא מתפקד יש רמות מי חמצן גבוהות פי שניים מאלו שנראו ב-HDL המצורף ממשתתפים בריאים.לאחר מכן, ה-HDL מבודד ו-HDLox נקבע ב-50 נבדקים בריאים ו-100 חולים נגועים ב-HIV. נראה כי לחולים הנגועים ב-HIV יש בממוצע תכולת HDL מי חמצן גבוהה ב-60% למיליגרם HDL-C מאשר לנבדקים הבריאים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משש שעות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את כל הריאגנטים והבקרות מראש, להיות עקביים, מדויקים ולכלול תמיד את הבקרה הניסיונית המתאימה בכל צלחת ניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את ה- HDL, לקבוע את תכולת מי החמצן השומנים של כמות מסוימת של HDL ולפגוע בתפקוד ה- HDL שלנו. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

אנו מתארים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית למדידת ערבול פוספוליפידים בליפוזומים חד-צדדיים גדולים שהורכבו מחדש עם אופסין.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים למדידת כמות הפוספוליפיד הפלואורסצנטי שהוסר במיוחד מחלקיקי תורם שומנים על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הקיים בפלזמה או בסרום אנושי שלם. הראינו שמדד זה של פונקציונליות HDL מנבא מחלות לב וכלי דם אירועיות.

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

למד שיטה ביוכימית ללא תאים למדידת תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation בליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. השיטה מספקת תוצאות מהירות ואמינות למחקר מחלות לב וכלי דם ומחלות דלקתיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

גלה סרטונים נוספים