Name: וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו שיחזור אורגנואידים מתאי גזע Lgr5+ ותאי פאנת' ממוינים לניתוח פונקציונלי של נישת תאי הגזע במעי. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים וביוכימיים ספציפיים לסוג תא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה התאפשר על ידי מימון ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF; EMCR 2012-5473) את העולם סרטן מחקר קרנות הבינלאומי (WCRF; פרויקט מס ' 2014-1181)

כל ההליכים נעשו על פי חוקים לרווחת בעלי חיים מקומיים והנחיות.
1. הכנת כלי נגינה, תרבות המדיה ומנות
<ol><li>אוטוקלב 1 סט של מעיים מספריים, מספריים רגילה, מלקחיים במיכל סטרילי.</li>
	<li>מניחים צלחת 96-ובכן (בתחתית שטוח) בתוך אינקובטור ב 37 º C.</li>
	<li>הכינו 10 מ"ל של מדיום תרבות שלמה עם ריאגנטים המפורטים בטבלה של חומרים.</li>
	<li>דגירה המדיום מלאה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
	<li>הפשרת קרום המרתף משוקם על ידי הצבת זה דלי קרח. קרום המרתף משוקם יהפכו נוזליים ב 4 ° C.</li>
	<li>למלא 4 צלחות פטרי עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח או PBS מקוצר (4 ° C).</li>
</ol>2. בידוד של כוכים קטנים במעיים
<ol><li>מקריב על ידי שאיפת2 CO עכבר - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5על רקע C57BL6/J. לנתח את הצפק longitudinally עם מספריים.</li>
	<li>להחזיק את הבטן עם המלקחיים, עד לפיצוץ ערמוני.</li>
	<li>בעזרת המספריים מעיים מעכשיו, להוציא את המעי ולמקם אותו בצלוחית המכילה PBS. הערה: מספריים מעיים יש פנייה חדה, עצה בוטה. הקצה הקהה של גזרי נועד כדי לא לגרום נזק הארכיטקטורה קריפטה-סיסי בעת פתיחת המעי.</li>
	<li>להתחיל על ידי הצבת קצה קהה לתוך הקיבה ואקדם בעדינות השוער. המשך על ידי חיתוך עם המספריים ומושך עם המלקחיים.</li>
	<li>ברגע המעי הדק כל נפתח longitudinally, לשטוף אותה ב- PBS קר על ידי החזקתה עם המלקחיים, בעדינות לשטוף אותה עם הפתרון PBS בתנועות בצורת U.</li>
	<li>לאחר כל שאריות צואה נמחקים, להמשיך לשטח את המעי על קרש חיתוך, בצד luminal למעלה. הצד luminal הוא קל לזיהוי על ידי העדר של כלי דם ועל ידי מראה חיוור בהשוואה החלק החיצוני.</li>
	<li>עם זכוכית להסיר בעדינות את villi על ידי גירוד המעי שעברו שיטוח. לבצע שלב זה פעמיים לאורך כל הרקמה.</li>
	<li>לחתוך המעי הדק עם להב כירורגי סטרילי לחתיכות של 2-5 מ מ.</li>
	<li>הצב השברים במעיים קטן בצינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של PBS קר קרח.</li>
	<li>לנקות את השברים רקמות, הסרת כל הטומאות הנותרים על-ידי pipetting אותם מעלה ומטה ב-, טוב, מגניב. למחוק את תגובת שיקוע, חזור על שלב זה עד מגניב נקי לחלוטין.</li>
	<li>הוסף PBS קר 15 מ"ל, כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS 25 מ. להוסיף 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולאחר תקופת דגירה של 45 דקות על גלגלת ב 4 º C.</li>
	<li>למחוק את PBS/EDTA.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של PBS ולנתק את כוכים מאת בחומרה pipetting שברי רקמת למעלה ולמטה (לפחות שלוש פעמים). לאסוף את תגובת שיקוע.</li>
	<li>חזור על שלב 2.13 ארבע פעמים. להוסיף תרבות בינונית להגיע נפח סופי של 50 מ.</li>
	<li>גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (300 גר' x עבור 5 דקות).</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של תרבות בינוני, גלולה של כוכים על ידי צנטריפוגה (80 g x במשך 3 דקות).</li>
</ol>3. תא ותא הכנה
<ol><li>למחוק את תגובת שיקוע של כוכים pelleted, resuspend אותם ב 1 מ"ל טריפסין כמו-אנזימים יחד עם 50 µL DNAse (50 µg/mL).</li>
	<li>דגירה התאים בתוך אמבט מים-32 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של תרבות בינוני. מביצועם של כוכים לתוך תאים בודדים על-ידי בחומרה pipetting למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים.</li>
	<li>לסנן את הפתרון דרך מסננת 40 µm (כדי למנוע גושים וזוהמה אחרים), גלולה את התאים ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
</ol>4. flow Cytometry, ציפוי
<ol><li>להכין 50 מ של תמיסת מלח במאגר של האנק x 1 או HBSS/2% פרה עוברית סרום (FCS) פתרון, resuspend בגדר ב 1 מ"ל עבור כל 106 תאים</li>
	<li>להוסיף תא ההשעיה לין BV421– (CD31, CD45, TER119)-ריכוז של בטחונות, ואת CD24-APC CD117-PE שני-ריכוז של נוגדנים 1:250 למשך 30 דקות.</li>
	<li>מיון Lgr5+ תאי גזע, תאי Paneth לנמוך נפרד מאגד צינורות. לפרטים על מיון פרוטוקולים עבור Lgr5+ , תאי Paneth, נא עיין רוט. et al. 7 ו. Schewe et al. 6<ol>
<li>צנטריפוגה בתאים ממוינים ב g 300 x עבור 5 דק Resuspend התאים 100 µL בינוני עם הרכיבים תיאר כמו 1.3 (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטיפול (למשל, על ידי שינוי כימי או גנטי) תאי Paneth (n = 2000) או תאי גזע Lgr5+ (n = 2000).<ol>
<li>כדי להתייחס תאים, להשתמש µL 5 של תרביות תאים בתיווך ליפוזום ריאגנט הנפח הכולל של 100 µL תרבות בינוני ו RNA מפריעות קטן (siRNA)-ריכוז של 100 ננומטר. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C עבור siRNA או הזמן הדרוש עבור השינוי שבחרת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף פעמיים בתאים 500 µL תרבות בינוני.</li>
	<li>צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend את התאים בינוני 10 של תרבות µL.</li>
	<li>מאגר הרכיבים הסלולר שני (Paneth או Lgr5+ תאים) µl הנפח הכולל 20 ו צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-RT.</li>
	<li>שיתוף דגירה של Paneth ו Lgr5+ תאים 10 דקות ב- RT.</li>
	<li>להסיר µL 10 של תגובת שיקוע ולהשאיר מניסקוס של נוזל כדי לוודא לרוקן לא בגדר התא.</li>
	<li>להוסיף 30 µL של קרום המרתף משוקם על התאים עבור הנפח הכולל של 40 µL, resuspend את התאים, צלחת בצלחת טוב 96 ומחוממת מראש. לאחר 10 דקות, הוסף 200 µL בינוני מלא (ראה את הטבלה של חומרים). שינוי בינוני כל 48 שעות.</li>
	<li>תא צורב Count ריבוי ביום 5.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

המחברים יש עניין כספי מתחרים או אינטרסים אחרים

אורה מאפשר ניתוח פונקציונלי מעודן של שני מרכיבים חיוניים של הגומחה תאי המעי, כלומר Lgr5+ ותאי Paneth. גישה זו כבר מועסקים בעבר עם שינויים קלים6,10,11מאת, ואחרים. כאן, אנו מציגים את ההליך אורה כפרוטוקול מעבדה מתוקננת הדירים. בנוסף, אנחנו מדווחים על ההשפעות של Apc downregulation בתאי גזע Lgr5+ , כדוגמה האפשרות של יישום גנטי (או ביוכימי6) שינויים מרכיבי התא המ...

האפיתל במעי הוא הרקמה ביותר במהירות עצמי המתחדש בגוף יונקים ו, בתור שכזה, היה מושא שפע של מחקרים שמטרתם זיהוי ואפיון פונקציונאלי של תאי גזע בוגרים המתגוררים בחלק התחתון של התת-קרקעי המופרש, תגייס לביטוי של הגן Lgr5 ותלוי ונ ט הקנוני אותות1. ראוי לציין, תאי גזע Lgr5+ מוקף, נתמך על ידי תאים נישה מיוחדים, קרי Paneth תאים, אשר גם תלוי ונ ט איתות שלהם התבגרות2. יחד, מסוגי התאים שני ביסוד התחדשות עצמית של רירית אפיתל המעי, לשמר את האיזון homeostatic יומי: Lgr5+ תאי גזע במהירות לחלק, להצמיח קדמון, יותר והתמחה מעיים אפיתל תאים; תאי Paneth לספק נישה חיוני גורמים (למשל, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ גזע תאים2. הקיבולת של מעיים כוכים כאשר מצופה ex-vivo כדי ליצור מבנים מאורגנים עצמי המתחדש שנקרא organoids, או "מיני-אומץ", נוצלה ככלי ניסיוני כדי לספק תובנות תהליכים כגון התחדשות עצמית, בידול בתנאים נורמליים ופתולוגיים כולל סרטן4. תא צורב תרבויות הוקמו מתוך מספר רקמות, לרבות המעי, הלבלב, הכבד, הכליה, העכבר והן דוגמאות האנושי4. שיטת החילוץ של גורמי גדילה המועסקים לפתח תרבויות תא צורב אלה הם רקמות ספציפיות נועד כונן מרובה שושלת היוחסין בידול ואת לחקות ככל האפשר את גומחת תאי גזע המקורי ויוו. Organoids ייתכן יישומים אפשריים כולל הטיפול של מחלות גנטיות, להערכת יעילות טיפולית בסרטן, הניתוח של רעילות התרופה או המחקר של organogenesis במבחנה5.
הכולל, המגבלה העיקרית של תרבויות תא צורב כאשר נוצרו מדגימות רקמה הוא חוסר תא-ירידה לפרטים. לדוגמה, מעיים organoids נוצרו מכוכים מעיים כל אינם מאפשרים הניתוח של רכיבים בודדים הסלולר הקיף בתוך המקור רקמות (למשל, מכילים כוכים כל Lgr5+, Paneth, ו ובתאים).
כאן, אנו מתארים שיטה, המכונה אורה, המשלבת את היתרונות של תרבויות תא צורב מעיים עם ניתוח תפקודי של מרכיביו הבסיסיים ביותר, כלומר גזע (Lgr5+) ותאים נישה (Paneth). זו מושגת באמצעות היכולת הייחודית של Paneth, Lgr5+ תאים לשיוך פיזית עם אחד לשני כאשר שיתוף מודגרות להצמיח organoids2,6,10. אנו ניצלו תכונה זו, טרום טיפול בנפרד את סוגי תאים שני מתנים את אותם צריך להשרות organoids. תוך כדי כל רכיב תא תיחשף כל נתון סמים, פקטורי גדילה, מעכב הביוכימי, ההנדסה הגנטית או טיפול כימי לפני שיחזור ויצירת תא צורב. לכן, שימוש וזמינותו אורה יאפשר הקביעה של הטיפול בתרופה מסוימת או ההנדסה הגנטית יש אפקט מסוים על תאי גזע או עמיתו הנישה שלהם.

<table><tbody><tr><td>DMEM F12 מתקדם *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>ריכוז סופי: 10 מ"מ</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>ריכוז סופי: 1%</td></tr> <tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>ריכוז סופי: 10 מ"מ</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>ריכוז סופי: 50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים נוגין *</td><td>פפרוטק</td><td>250-38</td><td>ריכוז סופי: 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>סיגמא</td><td>Y0503</td><td>ריכוז סופי: 10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>ריכוז סופי: 1 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים R-spondin *</td><td>R& D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>ריכוז סופי: 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת גן Flexitube siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>ריכוז סופי: 100 ננומטר</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קשירה נמוכים</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>קורנינג</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* השילוב של ריאגנטים אלה מהווה את מדיום</td><td></td><td></td><td></td> התרבות השלם</tr></tbody></table>

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

האפיתל במעי מאופיין על ידי שיעור תחלופה מהירה בצורה קיצונית. ביונקים, הציפוי אפיתל כולו מתחדש תוך 4-5 ימים. תאי גזע בוגרים מעיים שוכנים בתחתית המופרש אמורים לעבור על ידי ביטוי של הגן Lgr5 , לשמור על הומאוסטזיס באמצעות שלהם האופיינית בקצב גבוה proliferative1. לאורך כל המעי הדק, Lgr5+ תאי גזע שנטוו עם תאים הפרשה מיוחדים הנקראים תאי Paneth. תאי Paneth מפרישים חומרים אנטי בקטריאליים (קרי, ליזוזים ו cryptdins/defensins) ולעשות מאמץ תפקיד השליטה על הפלורה במעיים. לאחרונה, פונקציה הרומן התגלה עבור תאי Paneth, כלומר היכולת שלהם לספק תמיכה נישה לתאי גזע Lgr5+ דרך מספר ליגנדים מפתח Wnt3, EGF ו- Dll12.
כאשר מבודדים לשעבר vivo ותרבותית בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית, כוכים מעיים כל להצמיח מאריכים וקרא עצמית חידוש מבנים תלת-ממד organoids המזכירים מאוד את הקריפטה-סיסי ארכיטקטורה האפיתל של המעי הדק למבוגרים3. תא צורב תרבויות, כאשר הוקמה מתוך כל כוכים, לאפשר המחקר של התחדשות עצמית ובידול של הגומחה תאי המעי, אך ללא התייחסות התרומה של מרכיבים בודדים, כלומר Lgr5+ , תאי Paneth.
כאן, אנו מתארים את הגישה של הרומן וזמינותו תא צורב כי מנצל היכולת של Paneth ו Lgr5+ תאים כדי לשייך ויוצרים organoids כאשר ותרבותית משותפת. גישה זו, המכונים כאן "תא צורב שיחזור assay" (אורה), מאפשרת שינוי גנטי וביוכימי של Paneth או Lgr5+ תאי גזע, ואחריו שיחזור לתוך organoids. ככזו, היא מאפשרת ניתוח תפקודי של שני מרכיביה העיקריים של גומחת תאי גזע מעיים.

תא צורב שיחזור וזמינותו מאפשר ניתוח פונקציונלי נפרדים של הרכיבים החיוניים נישה, תאי גזע של האפיתל במעי, הפגינו כאן על ידי RNA מפריעות קטן (siRNA) של הגן Apc .
כדי להשיג מטרה זו, אנו קודם מנוצל פלורסנט תא מופעל מיון (FACS) כדי להפריד בין 8000 Lgr5+ תאים ותאים Paneth 6000 לבין עכברים C57BL6/J המפגרים. ב- איור 1a, מתואר בתרשים זרימה של אורה וזמינותו. תא צורב שיחזור קיבולת ה...

תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5+), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

המטרה הכוללת של בדיקת הבנייה מחדש של האורגנואידים היא ניתוח פונקציונלי של שני המרכיבים העיקריים של נישת תאי הגזע במעי Lgr5 חיובי בתאי Paneth באמצעות השינוי הגנטי או הביוכימי שלהם ואחריו בנייה מחדש לאורגנואידים המתחדשים מעצמם. שיטה זו מאפשרת לענות על שאלות מפתח ספציפיות בתחום תאי הגזע של המעי כגון שינוי גנטי או ביוכימי בתאי גזע ונישה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבניגוד לבדיקות אחרות המשתמשות בקריפטה שלמה, היא משתמשת בתאי גזע ונישה ממוינים ובכך מאפשרת ניתוח ספציפי לסוג התא.הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית במיוחד כשמדובר בשלבי דיסוציאציה של רקמות וטיפול בתאים. אם לא יבוצעו כראוי, צעדים אלה יובילו לכדאיות תאים ירודה במיוחד לאחר מיון עובדות. התחל הליך זה בהכנת חומרים והקרבה של עכבר Lgr5 על רקע C57BL/6J כמתואר בפרוטוקול הטקסט.נתח את הצפק לאורך בעזרת מספריים. החזיקו את הבטן עם המלקחיים וחתכו אותה לרוחב לשניים בעזרת מספריים מעיים מנקודה זו ואילך. שולפים את המעי ומניחים אותו בצלחת פטרי המכילה PBS.התחל בהנחת הקצה הקהה לתוך הבטן ודחף אותו בעדינות דרך הפילורוס. המשך בחיתוך עם המספריים ומשיכה בעזרת המלקחיים. לאחר פתיחת המעי הדק כולו לאורך, שטפו אותו ב-PBS קר על ידי החזקתו עם המלקחיים ושטיפה עדינה בתמיסת PBS בתנועות בצורת U.לאחר ניקוי כל שאריות הצואה, המשך לשטח את המעי על קרש חיתוך, כשהצד הלומנלי כלפי מעלה. ניתן לזהות בקלות את הצד הלומנלי על ידי היעדר כלי דם ועל ידי מראהו החיוור בהשוואה לחלק החיצוני. בעזרת שקופית זכוכית, הסר בעדינות את הווילי על ידי גירוד המעי השטוח.בצע את הצעד פעמיים לכל אורך הרקמה. לאחר מכן, חותכים את המעי הדק בעזרת להב כירורגי סטרילי לשניים עד חמישה מילימטרים. מניחים את שברי המעי הדק בצינור של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS קר כקרח.נקה את שברי הרקמה והסר את כל הזיהומים שנותרו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ב-PBS. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על השלב עד שה-PBS צלול לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר PBS קר כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS ל-25 מיליליטר.הוסיפו שני מילי-מולרי EDTA ודגרו במשך 45 דקות על רולר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת ה-PBS EDTA, הוסף 10 מיליליטר PBS ונתק את הקריפטות על ידי פיפטינג קשה של שברי הרקמה למעלה ולמטה. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט.חזור על שלב זה ארבע פעמים. הוסף מדיום תרבית כדי להגיע לנפח סופי של 50 מיליליטר. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה.לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית לפני גלולת הקריפטות על ידי צנטריפוגה. להכנת תא בודד, השליכו תחילה את הסופרנטנט של הקריפטות הגלוליות והשעו אותם מחדש במיליליטר אחד של אנזימים דמויי טריפסין יחד עם 50 מיקרוליטר של DNase. דגרו את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.לאחר הוספת 10 מיליליטר של מדיום תרבית, פרק את הקריפטות לתאים בודדים על ידי פיפטינג קשה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים. סנן את התמיסה דרך מסננת 40 מיקרון כדי לחסל גושים וזיהומים אחרים. לאחר מכן, גלולה את התאים הבודדים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות.עבור ציטומטריית זרימה, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת מלח חוצצת אחת של X Hank עם סרום פרה עוברי של 2% לכל מיליון תאים. לתרחיף התאים, הוסף נוגדנים עם תווית Brilliant Violet 421 לסמן השושלת CD31, CD45 ו-Ter119 בריכוז של 1 ל-100. כמו כן, הוסף אנטי-CD24 APC ואנטי-CD117 PE בריכוז של 1 עד 250.לאחר 30 דקות, מיין תאי גזע חיוביים Lgr5 ותאי Paneth לצינורות נפרדים בעלי קשירה נמוכה. צנטריפוגה של התאים הממוינים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום עם הרכיבים המתוארים בפרוטוקול הטקסט.כדי לטפל בתאים, השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה בתיווך ליפוזום בנפח כולל של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית ו-RNA מפריע קטן בריכוז של 100 ננו-מולר. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עבור RNA מפריע קטן, או למשך הזמן הדרוש לשינוי הנבחר. שוטפים את התאים פעמיים ב -500 מיקרוליטר של מדיום תרבית.לאחר צנטריפוגה של התאים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות, יש להשעות אותם מחדש ב -10 מיקרוליטר של מדיום תרבית. לאחר מכן, אסוף את שני הרכיבים התאיים בנפח כולל של 20 מיקרוליטר לפני צנטריפוגה פי 300 מכוח הכבידה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. דגירה משותפת של התאים החיוביים Paneth ו-Lgr5 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הסר 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט והשאיר אותם במגלשיים של נוזל כדי להימנע משאיבת כדורית התא. לאחר מכן, הוסף לתאים 30 מיקרוליטר של קרום מרתף משוחזר לנפח כולל של 40 מיקרוליטר. השעו מחדש את התאים וצלחו אותם בצלחת מחוממת מראש של 96 בארות.לאחר 10 דקות מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום שלם. החלף את המדיום כל 48 שעות. לבסוף, ספרו את ריבוי האורגנואידים ביום החמישי.RNA מפריע קטן תיווך נוקדאון של גן APC העכברי בתאי גזע חיוביים ל-Lgr5 וההפעלה הנובעת מכך של מסלול האיתות הקנוני Wnt/beta-catenin משפיעים באופן חיובי על ריבוי האורגנואידים בהשוואה לעמיתיהם הלא מטופלים או לבקרת הרצף המקושקשת. ההרכב של הפעלת Wnt מציל גם את הדרישה לתאי Paneth כפי שדווח בעבר. יתר על כן, אורגנואידים אלה מופיעים ככדורים חלולים, פנוטיפ מתואר היטב עבור אורגנואידים מוטנטיים APC או מגורים Wnt בהשוואה למורפולוגיה של אלה המתקבלים מכפילי תאים Paneth-Lgr5.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון טכניקה זו, חשוב לבצע את כל השלבים וזמני הדגירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ קריפטה של מעיים, להכין תקציר של תא בודד ולבנות מחדש תאי נישה וגזע ליצירת אורגנואידים.טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי הגזע של המעי לנתח את ההשפעות הספציפיות של תאי הגזע או תאי הנישה במעי הדק או במעי הגס של העכבר. למרות ששיטה זו הוקמה לניתוח פונקציונלי של נישת תאי הגזע במעי, ניתן ליישם אותה גם על נישות אחרות של תאי גזע סומטיים כמו בלוטת החלב או זקיק השערה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים לניתוח ביטוי חלבון הגנום באורגנואידים כגון QPCR או Western Blotting.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

אורגנואידים במעיים שמקורם בביופסיה וטכנולוגיות של איברים על שבבים משולבים בפלטפורמה מיקרופיזיולוגית כדי לשחזר את פונקציונליות המעי הספציפית לאזור.

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות...

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

למדו שיחזור אורגנואידים מתאי גזע Lgr5+ ותאי פאנת' ממוינים לניתוח פונקציונלי של נישת תאי הגזע במעי. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים וביוכימיים ספציפיים לסוג תא.

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

גלה סרטונים נוספים