וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

המטרה הכוללת של בדיקת הבנייה מחדש של האורגנואידים היא ניתוח פונקציונלי של שני המרכיבים העיקריים של נישת תאי הגזע במעי Lgr5 חיובי בתאי Paneth באמצעות השינוי הגנטי או הביוכימי שלהם ואחריו בנייה מחדש לאורגנואידים המתחדשים מעצמם. שיטה זו מאפשרת לענות על שאלות מפתח ספציפיות בתחום תאי הגזע של המעי כגון שינוי גנטי או ביוכימי בתאי גזע ונישה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבניגוד לבדיקות אחרות המשתמשות בקריפטה שלמה, היא משתמשת בתאי גזע ונישה ממוינים ובכך מאפשרת ניתוח ספציפי לסוג התא.

הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית במיוחד כשמדובר בשלבי דיסוציאציה של רקמות וטיפול בתאים. אם לא יבוצעו כראוי, צעדים אלה יובילו לכדאיות תאים ירודה במיוחד לאחר מיון עובדות. התחל הליך זה בהכנת חומרים והקרבה של עכבר Lgr5 על רקע C57BL/6J כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

נתח את הצפק לאורך בעזרת מספריים. החזיקו את הבטן עם המלקחיים וחתכו אותה לרוחב לשניים בעזרת מספריים מעיים מנקודה זו ואילך. שולפים את המעי ומניחים אותו בצלחת פטרי המכילה PBS.

התחל בהנחת הקצה הקהה לתוך הבטן ודחף אותו בעדינות דרך הפילורוס. המשך בחיתוך עם המספריים ומשיכה בעזרת המלקחיים. לאחר פתיחת המעי הדק כולו לאורך, שטפו אותו ב-PBS קר על ידי החזקתו עם המלקחיים ושטיפה עדינה בתמיסת PBS בתנועות בצורת U.

לאחר ניקוי כל שאריות הצואה, המשך לשטח את המעי על קרש חיתוך, כשהצד הלומנלי כלפי מעלה. ניתן לזהות בקלות את הצד הלומנלי על ידי היעדר כלי דם ועל ידי מראהו החיוור בהשוואה לחלק החיצוני. בעזרת שקופית זכוכית, הסר בעדינות את הווילי על ידי גירוד המעי השטוח.

בצע את הצעד פעמיים לכל אורך הרקמה. לאחר מכן, חותכים את המעי הדק בעזרת להב כירורגי סטרילי לשניים עד חמישה מילימטרים. מניחים את שברי המעי הדק בצינור של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS קר כקרח.

נקה את שברי הרקמה והסר את כל הזיהומים שנותרו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ב-PBS. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על השלב עד שה-PBS צלול לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר PBS קר כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS ל-25 מיליליטר.

הוסיפו שני מילי-מולרי EDTA ודגרו במשך 45 דקות על רולר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת ה-PBS EDTA, הוסף 10 מיליליטר PBS ונתק את הקריפטות על ידי פיפטינג קשה של שברי הרקמה למעלה ולמטה. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט.

חזור על שלב זה ארבע פעמים. הוסף מדיום תרבית כדי להגיע לנפח סופי של 50 מיליליטר. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה.

לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית לפני גלולת הקריפטות על ידי צנטריפוגה. להכנת תא בודד, השליכו תחילה את הסופרנטנט של הקריפטות הגלוליות והשעו אותם מחדש במיליליטר אחד של אנזימים דמויי טריפסין יחד עם 50 מיקרוליטר של DNase. דגרו את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

לאחר הוספת 10 מיליליטר של מדיום תרבית, פרק את הקריפטות לתאים בודדים על ידי פיפטינג קשה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים. סנן את התמיסה דרך מסננת 40 מיקרון כדי לחסל גושים וזיהומים אחרים. לאחר מכן, גלולה את התאים הבודדים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות.

עבור ציטומטריית זרימה, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת מלח חוצצת אחת של X Hank עם סרום פרה עוברי של 2% לכל מיליון תאים. לתרחיף התאים, הוסף נוגדנים עם תווית Brilliant Violet 421 לסמן השושלת CD31, CD45 ו-Ter119 בריכוז של 1 ל-100. כמו כן, הוסף אנטי-CD24 APC ואנטי-CD117 PE בריכוז של 1 עד 250.

לאחר 30 דקות, מיין תאי גזע חיוביים Lgr5 ותאי Paneth לצינורות נפרדים בעלי קשירה נמוכה. צנטריפוגה של התאים הממוינים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום עם הרכיבים המתוארים בפרוטוקול הטקסט.

כדי לטפל בתאים, השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה בתיווך ליפוזום בנפח כולל של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית ו-RNA מפריע קטן בריכוז של 100 ננו-מולר. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עבור RNA מפריע קטן, או למשך הזמן הדרוש לשינוי הנבחר. שוטפים את התאים פעמיים ב -500 מיקרוליטר של מדיום תרבית.

לאחר צנטריפוגה של התאים בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות, יש להשעות אותם מחדש ב -10 מיקרוליטר של מדיום תרבית. לאחר מכן, אסוף את שני הרכיבים התאיים בנפח כולל של 20 מיקרוליטר לפני צנטריפוגה פי 300 מכוח הכבידה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. דגירה משותפת של התאים החיוביים Paneth ו-Lgr5 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט והשאיר אותם במגלשיים של נוזל כדי להימנע משאיבת כדורית התא. לאחר מכן, הוסף לתאים 30 מיקרוליטר של קרום מרתף משוחזר לנפח כולל של 40 מיקרוליטר. השעו מחדש את התאים וצלחו אותם בצלחת מחוממת מראש של 96 בארות.

לאחר 10 דקות מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום שלם. החלף את המדיום כל 48 שעות. לבסוף, ספרו את ריבוי האורגנואידים ביום החמישי.

RNA מפריע קטן תיווך נוקדאון של גן APC העכברי בתאי גזע חיוביים ל-Lgr5 וההפעלה הנובעת מכך של מסלול האיתות הקנוני Wnt/beta-catenin משפיעים באופן חיובי על ריבוי האורגנואידים בהשוואה לעמיתיהם הלא מטופלים או לבקרת הרצף המקושקשת. ההרכב של הפעלת Wnt מציל גם את הדרישה לתאי Paneth כפי שדווח בעבר. יתר על כן, אורגנואידים אלה מופיעים ככדורים חלולים, פנוטיפ מתואר היטב עבור אורגנואידים מוטנטיים APC או מגורים Wnt בהשוואה למורפולוגיה של אלה המתקבלים מכפילי תאים Paneth-Lgr5.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון טכניקה זו, חשוב לבצע את כל השלבים וזמני הדגירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ קריפטה של מעיים, להכין תקציר של תא בודד ולבנות מחדש תאי נישה וגזע ליצירת אורגנואידים.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי הגזע של המעי לנתח את ההשפעות הספציפיות של תאי הגזע או תאי הנישה במעי הדק או במעי הגס של העכבר. למרות ששיטה זו הוקמה לניתוח פונקציונלי של נישת תאי הגזע במעי, ניתן ליישם אותה גם על נישות אחרות של תאי גזע סומטיים כמו בלוטת החלב או זקיק השערה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים לניתוח ביטוי חלבון הגנום באורגנואידים כגון QPCR או Western Blotting.