נפח גדול, תאורה בהתנהגותו רלוונטיות עבור Optogenetics אנושיות פרימטים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור מאיר רקמות בנפח גדול המתאים היטב למניפולציות אופטוגנטיות בפרימטים שאינם אנושיים. השיטה הזו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כמו למשל כיצד אוכלוסיות של תאי עצב באזורי מוח שונים תורמות להתנהגות, וכיצד דפוסי ירי עצביים ספציפיים בזמן באזור אחד יכולים להשפיע על אזור אחר? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת באור, ובכך מאפשרת מניפולציה אופטוגנטית של נפחי מוח גדולים רלוונטיים מבחינה התנהגותית עם נזק מינימלי לרקמות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על רפואה תרגומית בגלל הדמיון בין מוחות הפרימטים האנושיים והלא-אנושיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש קצת תרגול כדי להפעיל את כמות הלחץ הנכונה בעת משיכת סיבים אלה. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בזוג מספריים חדים כדי לחתוך קטע של סיב אופטי פלסטי בקוטר 250 מיקרומטר שאורכו לפחות 10 סנטימטרים מאורך התאורה הכולל הרצוי.

לאחר מכן, הסר 15 עד 20 סנטימטר של מעיל פוליאתילן מקצה אחד של הסיב האופטי הפלסטי באמצעות מסיר תיל בגודל 22. לאחר מכן, אבטח את שלושת עד חמישה הסנטימטרים הדיסטליים ביותר של הקצה המופשט של הסיב במהדק סגן שולחן. החזק את הקצה המעוטף של הסיבים מתוח ביד אחת, במשיכה יציבה מתמדת.

הסיב צריך להיות מקביל לרצפה, להתרחק מהסגן. שמור על מתח מתמיד זה על הסיב במהלך החימום והקירור, כך שהסיב יישאר ישר ומתוח בזמן שהוא מתדלדל. בעזרת ההגדרה הנמוכה ביותר של אקדח חום בטמפרטורה כפולה, מחממים את החלק המופשט של הסיב עד שהוא מדלל לקוטר של 60 עד 100 מיקרומטר, או בערך בקוטר של שערה אנושית.

שמור על המתח המתמיד על הסיב תוך מתן אפשרות להתקרר. אי שמירה על מתח או התחממות יתר של הסיב עלולה לגרום לסיב להתכרבל או להישבר. כדי לעזור לשמור על מתח מתמיד על הסיבים בזמן שאתה מחמם אותם, השתמש ביד הלא דומיננטית שלך כדי שלא תצטרך להרפות כשאתה משתמש באקדח החום.

כמו כן, אתה יכול לעטוף בעדינות את הסיבים סביב כף היד שלך כדי לקבל אחיזה טובה עוד יותר. לאחר שהסיב התקרר במלואו, והושג הקוטר הרצוי, צבט את הסיב שלושה סנטימטרים מהנקודה הצרה ביותר משני הצדדים. בעזרת משיכה חדה ומהירה לאורך ציר הסיב, הפרד את הצדדים ליצירת קצה מחודד.

לאחר מכן, בדוק את הקצה המחודד בהספק נמוך תחת מיקרוסקופ דיסקציה. אם הקצה מזלג או מסולסל, השליכו את הסיבים. אפילו עם הרבה תרגול, לכשליש מהסיבים יהיו קצוות מזלגים או מסולסלים.

אנחנו פשוט משליכים את הסיבים האלה במקום לנסות לתקן אותם, מכיוון שזה כל כך מהיר וזול למשוך עוד אחד. התכוננו לחרוט את הקצה המחודד על ידי הנחת פיסת סרט מעבדה ליד קצה הקצה, והשאירו את אורך הקצה הרצוי חשוף. כאן נחשפים חמשת המילימטרים האחרונים.

הסרט מגן על הסיב מפני חריטה מעל אורך פליטת האור הרצוי. לאחר מכן, קפלו ריבוע קטן של יריעת חיפוי סיליקון קרביד של חמישה מיקרומטר בין האגודל לאצבע. הניחו את קצה הסיב בין שני צידי יריעת החיפוי, וחרטו בעדינות את הסיב בתנועות סיבוביות קטנות.

סובב לעתים קרובות את הסיב כך שכל הצדדים ייחרטו באופן שווה. לאחר מכן, הסר כחמישה מילימטרים ממעיל הפוליאתילן מהקצה הנגדי של המאיר באמצעות מסיר תיל בגודל 22. לאחר מכן, חותכים את הקצה הנגדי שטוח בעזרת סכין חמה כדי להחליק את פני השטח.

הצמד מחבר בקצה התאורה מול הקצה החרוט. זה מאפשר לתאורה להתחבר לכבל אופטי או לייזר. לאחר מכן, יש ללטש את הקצה הנגדי שטוח עם יריעות חיתוך עדינות יותר ברצף.

לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי השטוח לתוך טבעת נירוסטה בקוטר פנימי של 260 מיקרומטר עד שהוא סומק עם קצה הטבעת. אשר חזותית כי הקצה הנגדי מלוטש בצורה חלקה ואחידה בעזרת מיקרוסקופ סיבים. הדביקו את הטבעת אנכית על קצה השולחן כשהפתח הקטן יותר של הטבעת פונה כלפי מטה.

לאחר מכן, מלאו מזרק מיליליטר אחד באפוקסי פלסטיק והצמידו למזרק, מחט קהה בגודל 18. לאחר מכן, השתמש במחט כדי למרוח אפוקסי לתוך הטבעת. מלאו את הטבעת לחלוטין באפוקסי.

הכנס סיבים לטבעת כך שהוא יהיה סומק עם תחתית הטבעת. במידת הצורך, נגב את כל עודפי האפוקסי מהמשטח המלוטש של הסיב עם מגבון רטוב ללא מוך לפני הייבוש. בשלב זה, הכן מיקרו-כונן מגדל לפני כל מפגש בדיקה.

לאחר מכן הצמד צינור מנחה בגודל 25 עם קצה משופע למהדק התחתון בכונן. אבטח את תאורת הנפח הגדולה בחלק העליון clamp באותו כונן. מהדק זה מחובר למנוע ההנעה.

לאחר מכן, השחילו את תאורת הנפח הגדול דרך צינור ההנחיה במלואו, וודאו שקצה התאורה משתרע מעבר לקצה צינור המנחה. לחלופין, ניתן למרוח סרט מעבדה על הסיב כך שהסרט, ולא הסיב עצמו, מהודק, כדי להגן על הסיב. לאחר מכן, יש להשרות את צינור ההנחיה והתאורה בתמיסה חיטוי לעיקור.

הנח רשת מעוקרת בהתאמה אישית עם מרווח חור מילימטר אחד בתוך החדר הנקי, ואבטח אותה בכיוון מוגדר מראש עם הבורג בצד החדר. החזר את התאורה המעוקרת מצינור ההנחיה על ידי משיכת התאורה כלפי מעלה באמצעות מלקחיים קהים סטריליים. קצה המאיר צריך להיות חמישה עד 10 מילימטרים מעל קצה צינור המנחה.

הצמד את המיקרו-כונן למחזיק והנח את צינור ההנחיה לתוך חור רשת היעד. לאחר מכן, הורד את שלב המיקרו-כונן עד שצינור ההנחיה נמצא ממש דרך מפלס הדורה. במקביל, הורד את התאורה באופן ידני בעזרת מלקחיים סטריליים.

אם יש התנגדות כלשהי, משוך את התאורה חמישה עד 10 מילימטרים, המתן 10 דקות ונסה שוב. אם עדיין יש התנגדות בניסיון השני, החזר את קצה התאורה לתוך צינור המדריך, הורד את צינור ההנחיה 0.25 מילימטרים ונסה שוב. חבר את הטבעת בקצה השני של התאורה למערך האופטי הגדול יותר או ללייזר.

נתון זה מראה כי שיעורי השגיאות עלו משמעותית עם התאורה. ותרשימי הרסטר כאן מראים את העיכוב של תאי עצב המשתרעים על פני עובי של 2.5 מילימטר של קליפת המוח. ופוטנציאל השדה המקומי המראה את חפץ האור המשתרע על פני 4.5 מילימטרים.

לאחר השליטה, ניתן לבנות תאורה בנפח גדול בטכניקה זו תוך 10 עד 15 דקות, בתוספת זמן ייבוש אפוקסי. הכיול מוסיף עוד חצי שעה בערך, כך שכדי למקסם את היעילות, אנו בדרך כלל מייצרים מספר תאורה בבת אחת. בזמן השתתפות בהליך זה, חשוב לזכור שרבים מהתאורה לא יעמדו בתקני בקרת איכות.

זה בסדר. אם הם נכשלים בבדיקת הטיפים, אנו משליכים אותם. אבל אם הם נכשלים בכיול, אנו בדרך כלל מלטשים אותם מחדש וחוזרים על הכיול.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סייעה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח להשתמש באופטוגנטיקה כדי לדכא ירי עצבי ולווסת התנהגות אצל פרימטים שאינם אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות מאיר רקמות בנפח גדול.