מחקר בסיסי ברפואה פלזמה - הגישה של תפוקה של נוזלים תאים

המטרה הכוללת של מבחני רצף מרובי בארות אלה, היא להבין טוב יותר את ההשפעות של פלזמה פיזית קרה על מחמצנים, לתגובות ביולוגיות במבחנה, באמצעות ספקטרוסקופיה של פליטות אופטיות, ניתוח נוזלים ופעילות תאית, מיקרוסקופיה ומבחני ציטומטריית זרימה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת הפלזמה, במיוחד בכל הנוגע למיני הנחיה שמקורם בפלזמה, החשובים לאינדוקציה של מוות תאי סרטן אימונוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגישה החצי אוטומטית שלה.

הוא משתמש ב-96 לוחות באר, כדי להגביר את המהירות והפרודוקטיביות של המחקר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולי פלזמה עתידיים, כמו ברפואת עור או אונקולוגיה. ומכיוון שהם מספקים את האמצעים לזיהוי מיני ההנחיה שמקורם בפלזמה, הרלוונטיים לתגובות הביולוגיות.

מי שידגים את ההליך יהיה פליקס ניסנר, טכנאי מהמעבדה שלנו. לניטור מיני פלזמה, מקם סילון פלזמה אטמוספרי מול ספקטרופוטומטר פליטות אופטי, בניצב לציר הפלומה, והשתמש בתוכנה הייעודית כדי לתעד את פליטת הפוטו ואורך הגל של כל מצב גז, בשני ליטר סטנדרטיים לדקה שטף גז הזנה. לניתוח סופר אוקסיד שטופל בפלזמה, הגדר פרוטוקול סופי לטבלת XYZ, עם זמני הטיפול ומיקומי הבאר המתאימים.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טרייה שהוכנה לבארות של צלחת 96 בארות שקופה ושטוחה בשלוש עותקים, והשתמש בקורא צלחות מיקרו, כדי למדוד את הספיגה ב-550 ננומטר. כדי לנתח את ההשפעות של טיפול בפלזמה על תגובות מטבוליות בתאים, במכסה זרימה למינרית, זרע פעם אחת 10 לארבעת התאים המעניינים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים בתוספת מלאה, לכל באר, בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות, ודגירה למשך הלילה. לאחר תרבית לילה בחממת תרבית תאים, השתמש בטבלת XYZ כדי לטפל בבארות בפלזמה או בגז בלבד, על פי הניתוח הניסיוני, והחזיר את התאים לחממה למשך 20 שעות נוספות.

בתום הדגירה השנייה, הוסף לתאים 25 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים טרי, בתוספת 500 רזזורין מיקרו-מולרי, כמו גם לשלוש בארות בקרת הרקע של רזזורין בלבד. מחזירים את התאים לחממה, למשך שלוש שעות דגירה. לאחר מכן, מדוד את הקרינה בקורא מיקרו צלחות.

להדמיה של התאים שטופלו בפלזמה, לאחר קריאת הקרינה, החלף את הסופרנטנטים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים טריים, בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרופידיום יודיד. הנח את הצלחת על במת מיקרוסקופ ממונע, ובחר את המטרה פי 20 כדי לדמות את התאים. לאחר מכן, השתמש בתוכנת ניתוח התמונה הכמותית המתאימה כדי לקבוע את השטח הציטוזולי הכולל בתמונות ניגודיות פאזה דיגיטליות, של כל שדות הראייה המצולמים בכל באר.

לניתוח זרימה ציטומטרי של התאים המטופלים בפלזמה, לאחר ההדמיה, יש לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS, בתוספת סידן ומגנזיום לכל שטיפה, ולאחר מכן תיוג, עם 15 אנגרמות למיליליטר של נוגדן חד שבטי קלרטיקולין נגד עכברים, ב-50 מיקרוליטר PBS, בתוספת סידן ומגנזיום לבאר. לאחר 15 דקות בחממת תרבית התאים, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים שלם, והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים לכל באר למשך 20 דקות, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התנתקו, טען את הצלחת על ציטומטר הזרימה, ורכש מינימום של 1,000 אירועים באוכלוסיית הפיזור קדימה והצידית, הקשורים בדרך כלל לתאים ברי קיימא.

לאחר מכן, השתמש בתוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה המתאימה כדי לשער את אוכלוסיית העניין, וכדי לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת של ביטוי הקלרטיקולין. ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה של פליטות אופטיות כדי לעקוב אחר הפסגות המובהקות הקשורות לרכיבי פלזמה תגובתיים בתנאי גז הזנה שונים. לטיפול בפלזמה בנוזלים, האידוי הנגרם על ידי גז הארגון ופלזמת הארגון נקבע תחילה, כאשר התנאים מניבים תוצאות אידוי שונות, שכן לפלזמה יש גם השפעות על הטמפרטורה.

בדומה לתוצאות ספקטרוסקופיה של פליטות אופטיות עבור רדיקלים הידרוקסיליים, שקיעת מי חמצן פוחתת משמעותית עם תערובת חמצן או חנקן, אך עולה עם גז הזנה לח. יתרה מכך, תוספת חנקן לגז ההזנה מובילה לריכוזי חנקות גבוהים משמעותית, בהשוואה לנוזלים שטופלו בפלזמת ארגון. רוב תחמוצת העל מיוצרת בתנאי גז ארגון יבשים, כאשר תערובות חמצן ו/או חנקן מרוות באופן משמעותי את ייצור הסופר אוקסיד, למעט בנוכחות פלזמת חמצן ארגון לחה.

עוצמות הקרינה של תאים שטופלו ברזזורין ובפלזמה דומות לשינויים הפיזיים הנצפים חזותית בסופרנטנטים של תרביות התאים, מה שמאשר את ההשפעות הציטוטוקסיות של טיפול ממושך בפלזמה. ירידה בשטח התא הכולל נצפתה גם בבארות דגימת הטיפול בפלזמה, במיוחד בתנאי גז הזנה לחות, עם ויסות כללי של צביעת קלרטיקולין על תאי מלנומה של מירן, בתגובה לחשיפה קצרה יותר לטיפול בפלזמה. אם מבוצעים כראוי, ניתן להשלים את הבדיקות הסלולריות של mytoplex ואת הקריאה תוך מספר שעות בלבד.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון תרבית משותפת עם תאים חיסוניים, או ניתוח של סופרנטנטים של תרבית תאים. זה עוזר לענות על שאלות נוספות, על שחרור סכרים, לקוחות ציטו או חלבוני רדוקס, כמו גם זיהוי חיסוני של תאי מלנומה שטופלו בפלזמה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר נוסף על מחזורי מלנומה, למשל עם ספרואידים תלת מימדיים של גידול

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מחקר בסיסי ברפואת פלזמה, משלב גז הפלזמה, על מולקולות ונוזלים תגובתיים, ועד לתגובות ביולוגיות בתאי מלנומה.