שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

המטרה הכוללת של בדיקת גרורות ריאתיות זו היא לדמיין ולחקור ישירות את הצמיחה של תאי אוסטאוסרקומה גרורתיים ברקמת ריאה בת קיימא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באמת בתחום גרורות האוסטאוסרקומה. כגון, כיצד תאי אוסטאוסרקומה גרורתיים מסתגלים, שורדים ומתרבים בסביבת המיקרו של הריאות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של צמיחת תאי אוסטאוסרקומה גרורתית בסביבת מיקרו תלת מימדית רלוונטית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, בגלל השלבים המאתגרים מבחינה טכנית של קנולציה של קנה הנשימה ואינפלציה של הריאה. הזרקת וריד הזנב של תאי גידול והמתת חסד של עכברים נעשים על פי הנחיות מוסדיות סטנדרטיות.

לאחר חמש דקות, הניחו את העכבר שעבר המתת חסד בשכיבה גבית על כרית סטרילית במכסה זרימה למינרית, והשתמשו במספריים קטנים וסטריליים כדי לנתח בזהירות את עצם החזה, מעבר לכניסת בית החזה משני צידי קנה הנשימה, מבלי לנקב את הריאות. ניתוח כל השרירים ורקמות החיבור המקיפים את קנה הנשימה חיוני לקנולציה מוצלחת. לאחר מכן, השתמש בצנתר עירוי בגודל 20 כדי לזרוק בזהירות את קנה הנשימה והשתמש בתפר קטגוט סטרילי כדי לאבטח באופן רופף את הקטטר ואת קנה הנשימה.

חבר סט הארכת IV מהקטטר למזרק 10 מיליליטר של מכשיר שפע כבידה ושפך 37 מעלות צלזיוס נוזלי מעורבב עם תמיסה בינונית לתוך המזרק. מלאו את הריאות בתמיסת האגרוז עד שהן מתנפחות. לאחר מכן הסר את הצינורית וקשר היטב את התפר כדי למנוע דליפה של תמיסת האגרוז.

חשוב לשמור על הריאה שלמה במהלך האינפלציה. אינפלציה נכונה עם אגרוז וקירור המריטה לאחר מכן, תשמור על הריאה במצב מורחב. קצרו את המריטה, קנה הנשימה, הלב והריאה, והקפידו לא לנקב או לפגוע במשטח הריאה.

הניחו את הרקמות ב-30 מיליליטר של PBS מקורר מראש בתוספת אנטיביוטיקה, ואפשרו לאגרוז להתמצק. מניחים את המריטה על קרח למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, השתמש במספריים עדינים ובפינצטה כדי לחתוך את הריאה לחתיכות בגודל 3X1.5 מילימטר, ולהניח את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 6 בארות המכילה ספוגי ג'לטין בגודל 2X2 סנטימטר שהושרו מראש במדיום B.

ביום ההדמיה, העבירו בזהירות את פרוסות הריאה מצלחת 6 הבארות, לצלחת עגולה סטרילית מזכוכית 35 מילימטר בעמודים לפי קבוצת הניסוי שלהם. לאחר מכן, במיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב, בחר את המטרה פי 2.5 והגדר את פרמטרי ההדמיה כדי לספק את הניגודיות הטובה ביותר בין תאי הגידול הפלואורסצנטיים לרקמת הרקע הלא פלואורסצנטית בקבוצת דגימת רקמת הבקרה. דמיין את כל הדגימות תוך שימוש באותם פרמטרים כמו עבור רקמות הבקרה.

אם התוכנה אינה מכוילת בקנה מידה, דמיין מיקרומטר המשתמש באותה מטרה כמו רקמת הריאה על מנת לקבל התייחסות לקנה מידה, ושמור את כל התמונות כקבצי tif. לאחר שכל התמונות התקבלו, כדי לנתח את התמונות ב- ImageJ, פתח את הקובץ הראשון. השתמש בכלי בחירת המצולע כדי לשרטט את פרוסת הריאה כולה כדי לקבוע את השטח של פרוסת הריאה הכוללת.

בחר תהליך והחסר רקע. קבעו את רדיוס הכדור המתגלגל לערך התחלתי של 50 פיקסלים. ערך זה יהיה תלוי במידת הקרינה ברקע ויש לבצע אופטימיזציה עבור כל ערכת נתונים.

הקפד לבטל את הסימון של הרקע הבהיר. בחר תמונה וסוג, 8 סיביות, ואז תמונה ומאפיינים, הזן פיקסלים. תחת יחידת אורך, הזינו 1 לרוחב הפיקסלים, לגובה הפיקסלים ולעומק הווקסל.

לאחר מכן, סמן את הגלובלי כדי להחיל פרמטרים אלה על כל התמונות הבאות. לאחר מכן, בחר תמונה, לאחר מכן התאם ולאחר מכן סף. הדגש ברירת מחדל ושחור-לבן, והשתמש במחוון כדי לסף את התמונה כך שרוב תאי הגידול יודגשו במדויק.

לחץ על Apply פעם אחת כדי להפוך את הריאה לשחורה ואת הנגעים הפלואורסצנטיים ללבנים. לאחר מכן, לחץ על החל פעם נוספת כדי להפוך את התמונה כך שכל המבנים הפלואורסצנטיים יהפכו לשחורים. כדי לכמת את מספר הנגעים וצורתם, בחר נתח והגדר מדידות ובדוק אזור.

בטל את הסימון של כל התיבות האחרות. לאחר מכן, בחר נתח חלקיקים ובשדה הגודל השתמש באזור של הנגע הקטן ביותר שנקבע כתא בודד על ידי ImageJ, כדי להגדיר את טווח הצורות שהתוכנית תספור. השתמש בתמונה מקבוצת הרכב של יום האפס כדי לבחור את האזור הקטן ביותר שנחשב לתא גידול בודד.

לאחר הגדרת המגבלה התחתונה, לחץ על אישור. יופיע חלון תוצאות המכיל את כל הצורות שנמנו ואת מידות השטח. לאחר מכן, העתק והדבק את הנתונים מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני, והשתמש בפונקציית הסכום המתמטית כדי להוסיף את כל האזורים של הנגעים הגרורתיים עבור אותה פרוסת ריאה מסוימת.

הנטיות הגרורתית לקווי תאים גרורתיים גבוהים ונמוכים ניכרות ויזואלית בנקודות זמן פרוגרסיביות. ליתר דיוק, תמונות מיקרוסקופיה אלה מראות כיצד תאים גרורתיים מסוגלים ליישב את הריאה בצורה יעילה יותר מאשר קווי תאים גרורתיים נמוכים. ניתוח תמונה, כימות וניתוח סטטיסטי של נתוני התמונה מאשרים שתאי גידול גרורתיים מאוד יכולים ליישב ביעילות את רקמת הריאה.

ואילו תאים גרורתיים נמוכים אינם יכולים לגדול כלל. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית בהגדלה גבוהה מאפשרת הדמיה של תאי הפרנכימה של הריאה בפירוט מרחבי רב בהשוואה לתאי גידול המבטאים EGFP. כמו גם מקל על ניתוח מבנים תת-תאיים, כמו מיטוכונדריה אלה.

בהתאם למספר העכברים המשמשים, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לעבוד עם ציוד כירורגי נקי וסטרילי. לאחר פיתוחה, הטכניקה סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור את התקדמות הגרורות בריאות של עכברים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות תרבית תאים במבחנה וכתמים מערביים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההשפעות של הפלת גנים או טיפול תרופתי על תאים סרטניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת גרורות ריאתיות. אל תשכח שעבודה עם תאי סרטן אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במעבדה בטיחותית ברמה ביולוגית שנייה, בעת ביצוע הליך זה.