ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להראות כיצד לייצר ולהשתמש בשבבים מיקרו-נוזליים עם אלקטרודות משולבות למדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותל או טרנס-אפיתל, או מדידות TEER. זה מודגם באמצעות מחסום דם-מוח בשבב המיקרו-נוזלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איברים על שבבים על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של תפקוד המחסום של, למשל, רקמת מחסום דם-מוח באמצעות אלקטרודות משולבות.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהאלקטרודות משתלבות בקלות במערכות איבר על שבב ושניתן להשוות את התוצאות של זה בין המערכות השונות. ההשלכות של טכנולוגיה זו משתרעות על הבנת תפקוד מחסום הדם-מוח בבריאות ומחלות, גילוי תרופות ורפואה מותאמת אישית. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי תפקוד מחסום הדם-מוח, ניתן להשתמש בה גם בהקשר של מערכות איבר-על-שבב אחרות כגון ריאה-על-צ'יפ ו-Gut-on-Chip.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לערבב היטב 27 גרם של חומר בסיס PDMS ו-2.7 גרם חומר ריפוי. לאחר מכן הסירו את התערובת במייבש למשך כ-45 דקות כדי להסיר בועות אוויר. בינתיים מכינים את התבנית לתערובת ה-PDMS הנוזלית על ידי הדבקת סרט שקוף סביב התבנית, או מניחים את התבנית במחזיק ופלים מתאים.

יוצקים את תערובת ה-PDMS הנטולת גז על התבנית. לאחר מכן, רפאו את תערובת ה-PDMS בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות והניחו לה להתקרר לאחר מכן. במכסה מנוע עם זרימה צולבת, משוך את ה-PDMS הנרפא מהתבנית.

חתוך את העתק ה-PDMS לחלקי שבב עליונים ותחתונים נפרדים באמצעות קווי חיתוך ב-PDMS. לאחר מכן, נקב ארבעה חורים בחלקים העליונים באמצעות אגרוף ביופסיה חד בקוטר מילימטר אחד ליצירת כניסות ויציאות. אגרוף מבפנים לחוץ כדי למנוע הצטברות של פסולת PDMS בשבב.

לאחר מכן, כסו את חלקי השבב בסרט שקוף כדי להגן עליהם מפני אבק. לאחר מכן, חותכים את ממברנות הפוליקרבונט מתוספות טרנסוול לריבועים של כשלושה על שלושה מילימטרים רבועים. לאחר מכן, הרכיבו קרום נקבובי ללא דליפה בין שני חלקי PDMS על מנת להרכיב מכשיר דו-שכבתי המתממשק עם קרום נקבובי.

לשם כך, הכינו טיט טולואן PDMS באמצעות 0.7 גרם חומר בסיס PDMS, 07 גרם חומר ריפוי ו-540 מיקרוליטר טולואן. מערבל את המרגמה ביסודיות, ולאחר מכן סובב 200 מיקרוליטר של טיט על כיסוי זכוכית ב-1500 סל"ד למשך 60 שניות כדי לקבל שכבה דקה ואחידה של טיט. לאחר מכן, העבירו שכבה דקה של טיט מהכיסויהחלקה על החלק התחתון של השבב בעזרת גלגלת דיו.

הכניסו את החלק התחתון לכלי בטוח לתנור ולאחר מכן העבירו את המרגמה לחלק העליון של השבב. בעזרת סט פינצטה, טובלים את שולי הממברנה במרגמה המצופה ומניחים אותה בזהירות באמצע החלק התחתון. לאחר מכן, הנח בזהירות את החלק העליון על החלק התחתון תוך שימת לב ליישור.

מכסים את כניסות הצ'יפס בנייר דבק שקוף כדי למנוע כניסת אבק לשבב ואופים אותם בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. זהירות חשובה מאוד בשלב זה. אין להפעיל לחץ על השבב ואל תחליק את החלק העליון על החלק התחתון, כדי למנוע כניסת טיט לתעלות וסתימת הממברנה.

כדי לשלב אלקטרודות בתעלות הצדדיות, חותכים חוט פלטינה לחתיכות באורך שני סנטימטרים. לאחר מכן, טבלו אותם באצטון למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו אותם במים ואתנול והניחו להם להתייבש.

במכסה המנוע הצולב, הניחו שבב על צלחת פלסטיק. הכנס ארבעה חוטי פלטינה לתעלות האלקטרודות של השבב באמצעות זוג פינצטה, וכופף אותם על צלחת הפלסטיק כדי לאפשר קיבוע לצלחת בשלב הבא. הכנס את החוטים של 0.7 עד מילימטר אחד לתעלת התרבות מעבר לצומת התעלה בצורת T.

לאחר מכן, מרחו טיפה של דבק הניתן לריפוי UV בכניסה לתעלת האלקטרודה ואפשרו לדבק למלא את התעלה בכוחות נימיים. לאחר מכן, הפעל את ה-UV ורפא את הדבק כשהוא מגיע לקצה תעלת האלקטרודה. קיבע את ארבע האלקטרודות המשולבות לצלחת הפלסטיק בעזרת דבק אפוקסי דו-רכיבי.

לאחר מכן, מכסים את הצ'יפס בנייר דבק שקוף ואופים אותם בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הניחו להם להתקרר ולאחסן ללא אבק עד לשימוש. כדי לצפות את השבבים כדי לקדם את הצמדת התאים, מלאו תחילה את שני הערוצים ב-PBS לפני הכנסת ריאגנטים.

בדוק במיקרוסקופ אם יש בועות אוויר בערוצים. אם כן, הסר אותם על ידי שטיפה עם PBS נוסף. לאחר מכן, מלאו את שני הערוצים ב-30 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין אנושי ב-PBS.

דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן שטפו את השבבים במצע גידול אנדותל ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, מדוד את TEER של השבבים הריקים כדי לוודא שכל האלקטרודות נמצאות במגע ישיר עם נוזל בתעלות.

לשם כך, קחו שבב מהחממה והניחו לו להגיע לטמפרטורת החדר למשך עשר דקות לפחות. הסר כל נוזל מצלחת הפלסטיק סביב האלקטרודות כדי למנוע גישור חשמלי מחוץ לשבב. לאחר מכן, קח את ספקטרום העכבה מ-200 הרץ למגה-הרץ אחד עבור כל שילוב של שתי אלקטרודות וכתוצאה מכך שישה ספקטרום עכבה לכל שבב בחמש עד עשר דקות, שממנו ניתן לקבוע ישירות את ה-TEER.

בדוק אם לספקטרום העכבה יש את הגדלים והצורות הצפויים כדי לאמת את מדידת ה-TEER. כעת, הכינו תרחיף תאים שיושב בתעלה העליונה על ידי הסרת מדיום התרבית מבקבוק תרבית עם חד-שכבת קונפלואנט של תאי hcMEC/D3. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS.

הסר את ה-PBS ולאחר מכן הוסף שני מיליליטר של 05 אחוז טריפסין EDTA ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות עד שהתאים מתנתקים מבקבוק התרבית. לאחר מכן, השביתו את הטריפסין עם מדיום תרבית בתוספת 20 אחוז FBS. ספור את התאים וחשב את מספרם הכולל בהשעיה.

בינתיים, צנטריפוגה את תאי hcMEC/D3 ב-390 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בנפח המתאים של מצע הגידול האנדותלי כדי לגרום לריכוז של חמישה מיליון תאים למיליליטר המתאים לצפיפות זריעה של 200 אלף תאים לסנטימטר רבוע בשבב. לאחר מכן, פיפטה לאט 30 מיקרוליטר ממתלה התאים המעורבב היטב לתעלה העליונה והסר את הפיפטה מהכניסה בתנועה שוטפת תוך הפעלת לחץ.

בדוק את צפיפות הזריעה במיקרוסקופ. יש להשיג פיזור אחיד של תאים בכל הערוץ העליון. לאחר מכן דגרו את השבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך שעה לפחות.

לאחר מכן, שטפו את כל התאים שאינם מחוברים עם מדיום תרבית אנדותל. זכור כי TEER מנוטר במהלך תקופת התרבית. אלו הם ספקטרום העכבה הסכמטי האופייני המציג גודל עכבה ושינוי פאזה לעומת תדר עבור ספקטרוסקופיה של עכבה חשמלית על שבבים ללא תאים ועם תאים.

ישנם ארבעה אזורים עיקריים הנשלטים על ידי הקיבול הדו-שכבתי באלקטרודות, התנגדות מדיום התרבית, התנגדות מחסום התא או קיבול קרום התא. אזור העניין מציין היכן ניתן לכמת את תרומת שכבת התא. וזו הנוסחה לחישוב TEER מההתנגדויות הנמדדות בין כל ששת השילובים של ארבע אלקטרודות.

מוצג כאן ה-TEER הממוצע של ארבעה BBBs על שבבים במהלך תקופת התרבית של שלושה ימים ומגיע לרמה של 22 פלוס מינוס 1.3 אוהם סנטימטר מרובע. לשם השוואה, נכללים נתונים של שבבים ריקים, המראים שונות שולית וסטייה מסנטימטר רבוע של אפס אוהם באותה תקופה בהשוואה לשונות בערך TEER של שבבים עם תאים. המיקרו-קופי הקרינה של גרעינים מוכתמים חשף שכבה חד-שכבתית רציפה של אנדותל הן על PDMS והן על הממברנה במיקום המצוין בכניסה.

אימונופלואורסצנציה חשפה נוכחות של חסימת חלבון צומת הדוק, אחת המצביעה על כך שצמתים הדוקים ספציפיים ל-BBB בין התאים מולידים את ה-TEER הנמדד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את הייצור והשימוש בשבבים עם אלקטרודות משולבות למדידות TEER באיברים על שבבים. ניתן להשתמש בטכניקה זו בתחום חקר מחסום דם-מוח כדי לחקור את ההעברה הישירה ומאפייני המחלה במחלת אלצהיימר, למשל.

בעקבות הליך זה, ניתן לנטר גם את תפקוד המחסום של אנדותל המוח המובחן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בבני אדם ליישומים ברפואה מותאמת אישית.