במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים נוזלי-תא לצורך מעקב הרכבה עצמית של חלקיקים
16 באוקטובר 2017
כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים ניסיוני עבור הצפיה בזמן אמת תהליך הרכבה עצמית באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים תאים נוזל שידור.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקרופיה אלקטרונית להעברת תאים נוזליים כדי לחקור את תנועת הננו-חלקיקים בשלב התמיסה בזמן אמת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הננו-מדע, למשל, על האופן שבו ננו-חלקיקים יוצרים מבנים בהרכבה עצמית במהלך ייבוש ממס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקת תנועת ננו-חלקיקים במרחב האמיתי ובזמן אמת.
ההשלכות של טכניקת תאים נוזליים זו נוטות לעקוב אחר תנועות בודדות של ננו-חלקיקים שאינן מוצגות בשיטות קונבנציונליות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים, ניתן ליישם אותה גם במודלים אחרים, כגון הצמדה מכוונת של ננו-חלקיקים. כדי להתחיל בהליך, יש להניח בבקבוק תחתון עגול של 100 מיליליטר שלושה צווארים 17.75 מיליגרם אמוניום הקסכולורופלטינט, 3.72 מיליגרם אמוניום טטרה-כלורופלטינט ו-115.5 מיליגרם טטרמתילאמוניום ברומיד.
הוסף לבקבוק 109 מיליגרם פוליוויניל פירולידון ו -10 מיליליטר אתילן גליקול נטול מים. ציידו את הבקבוק במוט ערבוב, מחיצת גומי ומעבה ריפלוקס. הפעל את מנוע הערבוב ותוך כדי ערבוב ב-1000 סל"ד, הסר את בקבוק התגובה בוואקום למשך שעה.
לאחר מכן, תחת זרימה של ארגון, מחממים את תערובת התגובה ל -180 מעלות צלזיוס ב -10 מעלות לדקה. מערבבים את התערובת בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואז מניחים לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר. מעבירים את התערובת המצוננת לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.
הוסף לצינור 30 מיליליטר אצטון כדי לזרז את ננו-חלקיקי הפלטינה. צנטריפוגה את התערובת בחום של 2400 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ופזרו את המשקעים ב -10 מיליליטר אתנול.
השג פרוסת סיליקון בגודל 4 אינץ' 100 מיקרון מצופה בכ-25 ננומטר של סיליקון ניטריד. טען התנגדות לתמונות באמצעות ציפוי ספין. לאחר מכן השתמש בהתנגדות לצילום כדי להרכיב את הוופל הדק במיוחד על פרוסת סיליקון בעובי 500 מיקרון.
סובב את הוופל ב-10 מיליליטר של התנגדות פוטו חיובית ב-3000 סל"ד למשך 30 שניות. אופים את הוופל בחום של 85 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות. לאחר מכן מכסים את הוופל במסכת כרום וחושפים את הוופל לאור של 365 ננומטר למשך 10 שניות.
טבלו את הוופל ב -50 מיליליטר של תמיסת המפתחים המתאימה למשך 40 שניות ואז ב -50 מיליליטר מים נטולי יונים למשך דקה אחת. טבלו את הוופל ב-50 מיליליטר מים נטולי יונים למשך דקה אחת, ולאחר מכן הניחו את הוופל המעוצב בתחריט יונים תגובתי. חרטו את הסיליקון ניטריד החשוף למשך דקה אחת.
השתמש באמבט מים כדי לחמם באופן שווה מיכל של תמיסה מימית של 30 מיליגרם לליטר של אשלגן הידרוקסיד ל 85 מעלות צלזיוס. השרו את הוופל הדק במיוחד באשלגן הידרוקסיד החם למשך שעתיים כדי לחרוט את הסיליקון החשוף. כאשר נראה שהסיליקון החשוף נחרט לחלוטין, הסר בזהירות את הוופל מהתמיסה בזווית כדי למנוע קרע של חלון הסיליקון ניטריד.
חזור על תהליך זה עם מסכת הכרום השנייה כדי להשיג את השבבים העליונים והתחתונים. השתמש במסכת הכרום השלישית כדי לעצב מרווחי אינדיום על השבב התחתון. יישר את השבבים העליונים והתחתונים וחבר את השבבים יחד ב-100 מעלות צלזיוס.
העבירו 20 מיקרוליטר מפיזור הננו-חלקיקים המוכן לבקבוקון של חמישה מיליליטר. אפשר לממס להתאדות בתנאי הסביבה למשך 10 דקות. בדוק את התא הנוזלי תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לוודא שחלונות הסיליקון ניטריד שלמים.
לאחר מכן מפזרים את הננו-חלקיקים בתערובת של מיליליטר אחד של אורתודיכלורבנזן, 250 מיקרוליטר של פנטדקאן ו-10 מיקרוליטר של אולילמין. עם התא הנוזלי מתחת למיקרוסקופ האופטי השתמש במזרק עם נימי דק במיוחד כדי לטעון 100 ננוליטר מהפיזור למאגרי התאים הנוזליים. השתמש בנייר סינון כדי לספוג את הפיזור העודף מחוץ למאגרים.
אפשר לתא לשבת באוויר הסביבה במשך 10 דקות כדי לאדות את האורתודיכלורבנזן. לאחר מכן מרחו גריז ואקום על צד אחד של רשת צמצם נחושת של שני מילימטר עם חור של 600 מיקרון. כסו בזהירות את התא הנוזלי ברשת, והקפידו ליישר את הצמצם עם חלון התא הנוזלי.
התקן את התא במחזיק TEM סטנדרטי וטען את התא לתוך המכשיר. רכוש תמונות במצב רכישת תמונה רציף כשהממס מתייבש. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לחשב את פונקציית ההתפלגות הרדיאלית עבור החלקיקים בכל תמונה נרכשת.
תמונות TEM של תרחיף ננו-חלקיקי פלטינה מתייבש בתא נוזלי סיליקון ניטריד הראו את הננו-חלקיקים נמשכים פנימה על ידי חזית הממס הנסוגה. התנהגות זו יוחסה לכוחות הנימים החזקים של השכבה הדקה של הממס ולאנרגיה החופשית המופחתת של הננו-חלקיקים בממשק הממס. הננו-חלקיקים יצרו בתחילה אגרומרטים רב-שכבתיים אמורפיים כשהם נמשכו יחד.
כאשר הממס התייבש, הצברים השתטחו לשכבה חד-שכבתית מסודרת. סדר זה בא לידי ביטוי בפונקציות ההתפלגות הרדיאליות הנגזרות מתמונות TEM. פונקציית ההתפלגות הרדיאלית של התמונה שצולמה לאחר 90 שניות הגיעה לשיא גדול של 8.3 ננומטר.
ננו-חלקיקי הפלטינה המצופים באולילאמין הם בקוטר של כ-8.3 ננומטר, מה שמרמז על כך שמספר משמעותי של חלקיקים הורכבו קרוב ככל האפשר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שייצור ועבודה עם התא הנוזלי דורשים רמות שונות של אופטימיזציה עבור ננו-חלקיקים שונים או הרכבי תאים נוזליים.
בעת ניסיון הליך זה, זכור להגן על חלונות התא הנוזלי מפני שבירה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפעלת מתחים על התא הנוזלי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים בנוכחות כוחות חיצוניים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הננו-מדע לחקור את תהליך ההרכבה של ננו-חלקיקים במנגנון היבש הכולל.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאים נוזליים ולמדוד את תנועותיהם של ננו-חלקיקים בניסוי TEM. אל תשכח שעבודה עם סוכן KUH יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי בטיחות בעת ביצוע ניסוי זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים ניסיוניים לצפייה בהרכבה עצמית של ננו-חלקיקים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) בתא נוזלי. שיטה חדשנית זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר תנועות של ננו-חלקיקים בודדים שאינן נראות בטכניקות קונבנציונליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ננו-מדע
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
- תהליכי הרכבה עצמית
רקע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת עם תא נוזלי מאפשרת תצפית בזמן אמת על ננוחלקיקים.
- טכניקה זו נותנת מענה לשאלות מפתח בנוגע להתנהגות ננוחלקיקים במהלך ייבוש הממס.
- שיטות קונבנציונליות נכשלות לעיתים קרובות בלכידת הדינמיקה של ננוחלקיקים בודדים.
- ניתן ליישם את השיטה גם על תופעות אחרות, כגון חיבור מכוון (oriented attachment) של ננוחלקיקים.
מטרת המחקר
- בחינת תנועת ננו-חלקיקים במוף תמיסה.
- מתן תובנות לגבי הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים.
- שיפור ההבנה של אינטראקציות בין ננו-חלקיקים במהלך תהליכי ייבוש.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות ננו-חלקיקים בבאלחית עגולה בעלת שלושה פיות.
- שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור (TEM) עם תא נוזלי לצפייה בזמן אמת.
- מעקב אחר תנועות של ננו-חלקיקים בודדים.
- ניתוח של תהליכי הרכבה עצמית (self-assembly) והצמדה מכוונת (oriented attachment).
תוצאות עיקריות
- הושגה בהצלחה מעקב בזמן אמת אחר תנועת ננו-חלקיקים.
- התקבלו תובנות לגבי תהליך ההרכבה העצמית של ננו-חלקיקים.
- הטכניקה חשפה תנועות בודדות שאינן ניתנות לצפייה בשיטות מסורתיות.
- זוהו יישומים פוטנציאליים להתנהגויות אחרות של ננו-חלקיקים.
מסקנות
- מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת בתא נוזלי היא כלי רב-עוצמה לחקר דינמיקה של ננו-חלקיקים.
- שיטה זו מספקת הבנה מעמיקה יותר של תהליכי הרכבה עצמית.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את היישומים של טכניקה זו בננו-מדע.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) בתא נוזלי מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר הרכבה עצמית של ננו-חלקיקים, ובכך מספקת תובנות מכניסטיות לגבי תהליכי אגרגציה המונעים על ידי הממס. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ברפואת ננו על ידי הבהרת האופן שבו פרמטרים פיזיקו-כימיים משפיעים על היווצרות ננו-מבנים. השיטה מגבירה את הביטחון החיזוי בעיצוב ננו-חומרים בשלבים מוקדמים, על ידי חשיפת הזדמנויות להפחתת סיכונים הקשורות למסלולי ההרכבה וכוחות בין-פנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את המניעים התרמודינמיים של אגרגציה של ננוחלקיקים כדי להבהיר את הקשרים בין מבנה לתכונות.
- ערך תפעולי: מאפשר תצפית ישירה על השפעות גבול הממס על תנועת חלקיקים, ובכך מספק מידע להערכות יציבות של פורמולציות.
- ערך חיזוי: מזהה תנאים המובילים למקבצים אמורפיים לעומת מסודרים, ובכך תומך בתכנון רציונלי של נשאים ננומטריים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של פונקציית התפלגות רדיאלית לאפיון המרווחים בין החלקיקים במהלך הייבוש.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ייצור תאי נוזלים לצורך ניתוח הדיפוזיה של ננו-חלקיקים בצורה הדירה.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגים שונים של ננו-חלקיקים (למשל, פלטינה, עיסן סלניד) והרכבים שונים של תאי נוזלים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין תצפיות הרכבה בזמן אמת לבין ביצועים פונקציונליים במערכות ביולוגיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהירה את תפקיד כוחות הנימיות והאנרגיה הבין-פסית בהתפתחות הננו-מבנה, ובכך מפחיתה עמימות בפרשנות הפרה-קלינית.
- תמיכה בקבלת החלטות: מספקת ראיות ויזואליות וכמותיות עבור קריטריוני go/no-go בקידום ננו-חומרים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות בננו-מדע ועד להערכה פרה-קלינית של טיפולים ננו-מבניים, בייחוד כאשר התנהגות ההרכבה משפיעה על הזמינות הביולוגית או על הטיות המטרה.
- ביולוגיה של הגילוי: בחינת השערות לגבי מנגנוני הרכבה עצמית המתווכים על ידי ממס באמצעות ויזואליזציה ישירה.
- סריקה: אספקת תאי נוזל סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה להערכת יציבות פיזור של ננו-חלקיקים תחת התאדות מבוקרת.
- אנליטיקה: שימוש בניתוח פונקציית התפלגות רדיאלית לכימות ארגון בקנה מידה ננומטרי וזיהוי מעברים ממצבים לא מאורגנים למצבים מאורגנים.
- מחקר תרגומי: קישור תובנות על נתיבי הרכבה לרצף פרה-קליני על ידי חיבור בין מורפולוגיית הננו-מבנה לבין אינטראקציות ביולוגיות פוטנציאליות.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת התנהגות של ננו-חומרים על פני פורמולציות ליבה ומערכות ממסים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהרכבה עצמית של ננו-חלקיקים באמצעות לכידה של דינמיקה בזמן אמת שאינה נראית בשיטות מדידה של תמיסות (bulk techniques).
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים מפורטים של מיקרו-פבריקציה וטעינה, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות חזותיות מוקדמות לסיכוני הרכבה שעלולים לפגוע בביצועי הננו-רפואה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים לחומרים ננומטריים מותאם-סיכון, בהתבסס על נתיבי הרכבה צפויים ויציבות בין-ממשקית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסינתזה של ננו-חומרים, ייצור התקני מיקרופלואידיקה ותפעול TEM.
- תלוי בגישה למחזיקי תאים נוזליים ל-TEM, מערכות ואקום ותוכנות לעיבוד תמונות לצורך ניתוח התפלגות רדיאלית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי אידוי ממסים ונהלי טיפול בחלונות למניעת ארטיפקטים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לחומרי ליבה שונים של ננו-חלקיקים, ליגנדים או עוביים שונים של חלונות התא הנוזלי.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שבירות של חלונות סיליקון ניטריד וקצבי אידוי של ממסים המשפיעים על חלונות התצפית.
