זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות מוטציות בתדירות נמוכה בגידול במחזור או ctDNA כדי לספק לרופאים קליניים כלי רב עוצמה לאבחון גידולים ולניטור דינמיקת הגידול בתגובה לטיפול. שיטת בדיקת ctDNA יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי סוגי המוטציות שמטופל נושא כגון וריאציה גרעינית בודדת, מחיקת הכנסה, וריאציה של מספר עותקים ושונות מבנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא רגישות וסגוליות גבוהות הנוגעות לזיהוי מדויק של מוטציות בתדר נמוך ב-ctDNA.

מי שתדגים את הנהלים תהיה יוליאנג יאנג, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, שאבו 10 מיליליטר של דם היקפי בצינור איסוף והפכו בעדינות את הצינור למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים כדי לערבב את התוכן. אחסן דגימות דם בצינורות האיסוף בטמפרטורה של שש עד 37 מעלות צלזיוס למשך עד 72 שעות.

צנטריפוגה את צינור האיסוף ב -1, 600 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן השתמש בפיפטה לסילוק כדי להעביר את הסופרנטנט או הפלזמה מהצינור לארבעה צינורות צנטריפוגה נקיים של שני מיליליטר המסומנים כראוי מבלי להפריע לגלולה. השתמש בפיפטה נקייה כדי להעביר מיליליטר אחד מהתאים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המסומן כראוי.

אחסן את התאים במינוס 20 מעלות צלזיוס או קר יותר לפני בידוד גנומי או gDNA. לאחר מכן, צנטריפוגה את הפלזמה ב -1, 600 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את הפלזמה לצינורות צנטריפוגה נקיים המסומנים כראוי כפלסמה, והשאירו כ-0.1 מיליליטר של נפח שיורי בתחתית כדי למנוע זיהום.

יש להימנע ממעיל הבאפי מהפלזמה במהלך תהליך ההפרדה. אחרת, מקטעי DNA גדולים המופקים מהתאים עלולים לדלל את ה-ctDNA ולהשפיע על רגישות הבדיקה. באמצעות ערכה זמינה מסחרית, בודד cfDNA משלושה מיליליטר מהפלזמה שנאספה בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן גם עם ערכה, בודד gDNA מ-200 מיקרוליטר של תאי דם לבנים בהתאם להוראות היצרן. כדי לפצל את דגימת הבקרה של gDNA על ידי סוניקציה, הכינו מיקרוגרם אחד של דגימת gDNA ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA בצינור סוניקציה נקי. הגדר את תוכנית הסוניקציה ל-30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי למשך 12 מחזורים למשך 12 דקות בסך הכל

לאחר אישור שהמוצר מכיל 200 עד 250 שברי זוגות בסיסים, העבירו את כל מוצרי הפיצול לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 150 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים ודגרו את הדגימה למשך חמש דקות כדי לבחור את השברים הנכונים. לאחר מכן, הניחו את הצינור על מתלה מגנטי למשך 30 שניות והסירו את הסופרנטנט. לאחר מכן, תוך כדי שמירה על הצינור על המתלה, הוסיפו 200 מיקרוליטר של אתנול 80% טרי שהוכן לשטיפת החרוזים.

דגרו על החרוזים למשך 30 שניות לפני הסרת הסופרנטנט וחזרו על הכביסה. שמור את הצינור על המתלה כשהמכסה פתוח לייבוש החרוזים באוויר. לאחר מכן הסירו את שברי ה-DNA על ידי הוספת 32 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Tris-HCL לחרוזים.

כדי לבצע את תגובת ההכנה הסופית בהתאם להוראות היצרן, לשפופרת סטרילית נטולת נוקלאז, הוסף שבעה מיקרוליטרים של מאגר תגובה, שלושה מיקרוליטרים מתערובת האנזימים, 30 ננוגרם cfDNA ומים מזוקקים כפולים לנפח כולל של 60 מיקרוליטר. בשפופרת נפרדת, הוסף את אותם רכיבים אך עם מיקרוגרם אחד של gDNA במקום cfDNA. דגרו את התערובת במחזור תרמי בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ללא חימום המכסה.

מיד לאחר הדגירה, הוסף 30 מיקרוליטר מתערובת מאסטר הקשירה, מיקרוליטר אחד של משפר הקשירה וארבעה מיקרוליטר של מתאם הרצף הייחודי לצינור. דגרו את התגובה במחזור התרמי בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ללא חימום המכסה. מערבולת כדי להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים ולהשאיר את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות.

לאחר מכן הוסף 87 מיקרוליטר של החרוזים המגנטיים התלויים לתגובת הקשירה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ולאחר מכן מדגרים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שטיפה וייבוש אוויר של החרוזים, יש לסלק את מטרת ה-DNA מהחרוזים על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Tris-HCL.

הוסף 20 מיקרוליטר של שברי DNA קשורים במתאם, חמישה מיקרוליטר של פריימר אינדקס i7, 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר להגברת ספרייה, ומים מזוקקים כפולים עד לנפח כולל של 50 מיקרוליטר. PCR מגביר את המתאם cfDNA או gDNA קשור. לאחר מכן הוסף 45 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים תלויים ל-DNA המועשר ב-PCR.

מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ומדגרים אותה למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט ושטיפת החרוזים, השתמש ב-30 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Tris-HCL כדי לסלק את שברי ה-DNA בעזרת מתאמים. כדי לבצע לכידת DNA ממוקדת, בצינור סטרילי, חסום את הדגימה על ידי הוספת 1.5 מיקרוגרם של ספריות איגום, שמונה מיקרוליטר כל אחד של בלוק P5 100P ו-P7 בלוק 100P, וחמישה מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד לכל זין מיקרוליטר DNA אחד.

יבש את תכולת הצינור באמצעות רכז ואקום המוגדר על 60 מעלות צלזיוס. הכלאה של בדיקות לכידת ה-DNA עם הספרייה על ידי הוספת 8.5 מיקרוליטר של מאגר הכלאה פי 2, 2.7 מיקרוליטר של משפר הכלאה ו-1.8 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים ללא נוקלאז. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודוגרים במיקסר התרמי בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן הוסף מיד ארבעה מיקרוליטר של הגשושית המותאמת אישית. דגרו את הדגימות במערבל תרמי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כשהמכסה מחומם ל-75 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. דגרו את ה-DNA ההיברידי עם חרוזי סטרפטווידין ואז שטפו את החרוזים כדי להסיר DNA לא קשור.

השתמש בערכה המסחרית בהתאם להוראות היצרן כדי לקבל 20 מיקרוליטר אחרונים של חרוזים תלויים עם שברי DNA שנלכדו. שלב הכביסה של DNA לא קשור מחרוזי סטרפטווידין אמור להיות מהיר. אחרת, יעילות הלכידה של ה-DNA הממוקד עלולה להיות מושפעת.

הגבירו את שברי ה-DNA שנלכדו על ידי ביצוע PCR באמצעות ערכה מסחרית עם שני אוליגונוקלאוטידים של עמוד השדרה המיקרו-מולרי בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, הוסף 45 מיקרוליטר של חרוזים תלויים ישירות לתוצר ה-PCR והעשיר את שברי ה-DNA המוגברים הקשורים לחרוזים על ידי פליטה ב-30 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Tris-HCL. לכמת את הקטעים ולבצע ריצוף וניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

טבלה זו מתארת כיצד ER-seq משפר את עומק הכיסוי ב-23% בהשוואה לשיטה המסורתית. זאת בשל התאוששותו היעילה של מולקולות cfDNA, ובכך משפר מאוד את הניתוח של מוטציות נדירות. כמו כן, ברור כי מתאמי הריצוף הייחודיים המשמשים ב-ER-seq מאפשרים בידול קל של כפילויות טבעיות ו-PCR.

כפי שמפורט בטבלה זו על תוצאות השיחות, ניתוח המבוסס על ER-seq היה עקבי ב-100% עבור זיהוי EGFR pL858R ותדירות הזיהוי הייתה מעט גבוהה יותר בהשוואה לניתוח מסורתי. חשוב לציין, ניתוח ER-seq איפשר זיהוי של מוטציות אחרות בתדר נמוך יחסית כולל EGFR pT790M שלא זוהה על ידי ניתוח מסורתי עקב רעשי רקע גבוהים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מאובדן כמות נמוכה מאוד של cfDNA במהלך מיצוי, הכנת ספרייה ושטיפת חרוזים לאחר הכלאה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ctDNA מהמטופל נאסף, הוכן וממוקד על סמך זיהוי ייחודי לריצוף. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופסיה הנוזלית לחקור שיטות עבודה טובות יותר בקבלת החלטות קליניות.