Name: זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למד לזהות מוטציות נדירות ב-ctDNA באמצעות שיטת ER-Seq עם תיקון שגיאות דו-כיווני. טכניקה זו מציעה רגישות וספציפיות גבוהות לאבחון סרטן ומעקב אחרי תגובה לטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על-ידי המכון Geneplus – בייג'ינג.

דגימות הגידול דגימות דם התקבלו על-פי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של האנשים אוניברסיטת פקינג &#39; s בית החולים. בכתב הסכמה מדעת הושג מן המטופלים להשתמש דוגמאות שלהם. המשתתפים הוקרנו על פי הקריטריונים הבאים: נקבה, מתקדמים סרטן ריאות תא חדרים-קטן, מוטציה p.L858R EGFR שצוין על-ידי רצף סנגר הקודם, התקדמות המחלה בעקבות מפגש שני של EGFR ממוקד טיפול עם טרסבה, ו ER-Seq שכיסה ctDNA כדי לנתח את סיבת ההתנגדות ולמצוא תרופות חדשות היעד.
 1. מיצוי DNA מהדם ההיקפי עבור cfDNA ו- DNA גנומי (gDNA) <ol><li>לאסוף 10 מ"ל של דם היקפיים בשפופרת איסוף, היפוך בעדינות למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים כדי לערבב. הימנע תא הטיה. ניתן לאחסן דגימות דם בצינור אוסף ב 6-37 מעלות צלזיוס עד 72 שעות.</li>
	<li>Centrifuge הצינור אוסף בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מהשעה 16:00 (±150) x ג</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע (פלזמה) מהצינור אוסף ארבעה mL 2 נקיים כראוי מתויג צנטריפוגה צינורות באמצעות pipet חד פעמיות מבלי להפריע השכבה גלולה (כדוריות דם לבנות).</li>
	<li>ML Transfer1 של התאים באמצעות pipet חד פעמיות נקי 2 מ ל כראוי מתויג צנטריפוגה שפופרת. התאים יכולים להיות מאוחסנים ב-20 ° C או קר לפני שלב 1.8.</li>
	<li>Centrifuge הפלזמה (מתוך שלב 1.3) 10 דקות ב 4 ° C, 16000 (±150) x ג</li>
	<li>העברת פלזמה לנקות צינורות צנטריפוגה מתויג כראוי כמו &#34; פלזמה &#34;, להשאיר ~0.1 מ"ל נפח שיורית בתחתית כדי למנוע זיהום. לאחסן הפלזמה ב-80 מעלות צלזיוס עד שלב 1.7.</li>
	<li>השתמש 3 מ"ל של פלסמה מהשלב 1.6 כדי לבודד cfDNA (ctDNA מכיל) באמצעות ערכת זמינים מסחרית, בעקבות היצרן &#39; הוראות s.</li>
	<li>µL 200 שימוש של כדוריות הדם הלבנות מהשלב 1.3 לבודד gDNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית, בעקבות היצרן &#39; הוראות s. 
	הערה: שניהם ניתן לאחסן ב-20 ° C לפני השימוש cfDNA, gDNA.</li>
	<li>להחיל פקדים איכות שונים עבור cfDNA ו- gDNA (טבלה 2). לבצע בקרת איכות על ידי שיטה סטנדרטית bioanalyzer לקבוע רמות של השפלה מדגם ו/או זיהום gDNA. ניתוח שיא של איכות cfDNA החילוץ אמור להופיע הדומה איור 1. 
	הערה: גודל השיא בבתים של cfDNA הוא בסביבות 170 bp. הערה כי להגדיל את כמות ה-DNA תגרום בספריה באיכות גבוהה עבור זיהוי יעיל של מוטציות נדירות cfDNA. אנו ממליצים על שימוש ng לפחות 30 cfDNA (30,000 עותקים).</li>
</ol> 2. ספריית הכנה הערה: ביחס לספריית הבסיס בניה על ה-DNA מפוצלים, cfDNA קיימת בקטעים עם שיא גודל ~ 170 שואלת, לפיכך אינו צריך להיות מקוטעת.
<ol><li>שבר הפקד מדגם (gDNA) על ידי sonication כדי לקבל 200-250 bp קטעים.
	<ol><li>µG 1 להכין מדגם gDNA ב µL 100 טריס-EDTA המאגר בצינור sonication נקי.</li>
		<li>להגדיר את התוכנית sonication 30 s s על ו-30 הנחה 12 מחזורים עבור סכום כולל של לפחות 12</li>
		<li>לאחר sonication, לאשר המוצר (5 µL) מכיל 200-250 bp קטעים על-ידי הפעלת ניתוח עם ג'ל agarose 2%-</li>
		<li>להעביר את כל המוצרים פיצול צינור 1.5 mL, דגירה עם 150 µL של beads מגנטי עבור 5 דקות לבחור השברים הנכון.</li>
		<li>להסיר את תגובת שיקוע על ידי לשים את הצינורית על מתלה מגנטי עבור 30 ס</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם 200 µL של 80% אתנול (הטרי) עם הצינורית נשאר על המדף מגנטי. תקופת דגירה של 30 s לפני הסרת את תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.</li>
		<li>אוויר יבש את החרוזים עם המכסה צינור פתוח כשהוא נשאר על המדף מגנטי. הימנע חרוזים overdried כדי לוודא כי המטרה דנ א משחזרת טוב. Elute שברי DNA החרוזים על-ידי הוספת µL 32 10 מ מ טריס-HCl (pH 8) החרוזים לפתרון שברי DNA ואחריו כמת על ידי ספקטרוסקופיה UV/Vis. 
		הערה: לפחות 200 ng יש צורך הניסויים הבאים.</li>
	</ol></li> <li>סיום ההכנה התגובה הערה: היצרן פעל &#39; s הוראה ולשנות כנדרש. שימוש 30 ננוגרם של cfDNA; µg 1 של gDNA של הפקד.
	<ol><li>µL 7 להוסיף תגובה מאגר, 3 µL של התערובת אנזים 30 ננוגרם של cfDNA צינור ללא נוקלאז סטרילי, ולהוסיף ddH 2 O הנפח הכולל של 60 µL. בשפופרת נפרדים, להוסיף את הרכיבים הנ ל אבל עם µg 1 של gDNA במקום cfDNA.</li>
		<li>מיקס דגירה התערובת ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחריו 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב- thermocycler ללא המכסה מחומם. פנה/י מיד אל השלב הבא.</li>
	</ol></li> <li>מתאם מצדו <ol><li>להוסיף 30 µL של המיקס האב מצדו µL 1 של משפר מצדו, µL 4 המתאמים רצף ייחודי לתערובת מהשלב 2.2.</li>
		<li>Incubate ב- 20 ° C למשך 15 דקות thermocycler ללא המכסה מחומם.</li>
		<li>מערבולת resuspend את החרוזים מגנטי ולעזוב את החרוזים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות לפני השלב הבא.</li>
		<li>להוסיף µL 87 של חרוזים מגנטי resuspended לתערובת כאמור; לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק.</li>
		<li>שטיפת ואוויר יבש את החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
		<li>Elute המטרה הדנ א של החרוזים על-ידי הוספת 20 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>העשרה של DNA רסיסים מאתרים עם מתאם <ol><li>להוסיף 20 µL של ה-DNA מתאם מאתרים שברים, 5 µL של אינדקס פריימר/i7 (2.5 µL פריימר-P7 (מאי 10) ו- 2.5 µL של פריימר-P5 (10 בבוקר), למטרות רצף), 25µL של ספריית הגברה מיקס מאסטר, ו- ddH 2 O כדי הנפח הכולל של 50 µL-</li>
		<li>PCR להגביר את מתאם מאתרים הדנ א ואת המחזור התרמי כדלקמן: דנטורציה הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ואחריו 8 מחזורים (cfDNA) או 4 מחזורים (gDNA) של חישול ° C 15 s, 65 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s) , ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות 60 s, ואז מחזיקים את הטמפרטורה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>45 להוסיף µL של beads מגנטי על תנאי ל- DNA מועשרת PCR כדי לקבל שברי רכשה.</li>
		<li>Elute DNA קטעים עם מתאמי ב 30 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>בקרת איכות ספריית <ol><li>בצע היצרן &#39; פרוטוקול s עבור ערכת מסחרית למדוד את מתאם מאתרים ריכוז ה-DNA. להשתמש את bioanalyzer כדי לקבוע את איכות דנ א.</li>
	</ol></li></ol> 3. ממוקד לכידת דנ א הערה: היעד העשרה בוצעה באמצעות רצף מותאם אישית לכידת-בדיקה אשר תוכננה במיוחד עבור אזור היעד 1021 kb העשרה מכסה נהג סרטניים הקשורים ידוע מוטציות מ 12 סוגים שונים של גידולים. שינויים היצרן &#39; פרוטוקול s מפורטים השלבים הבאים-
<ol><li>חסימת <ol><li>µg להוסיף 1.5 של איגוד ספריות (המספר המרבי של ספריות למאגר עבור cfDNA הוא 6, gDNA בת 20) משלב 2, 8 µL P5 Block(100P), µL 8 של P7 Block(100P) ו µL 5 של עריסה-1 DNA (µg 1/µL) בצינור סטרילי. יבש את התוכן של הצינור באמצעות רכז ואקום להגדיר ב-60 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>Hybridize הלכידה DNA רגשים עם הספריה.
	<ol><li>להוסיף הרכיבים הבאים כדי ברכבת התחתית שלב 3.1: 8.5 µL של המאגר הכלאה X 2, µL 2.7 של הכלאה משפר, ו- 1.8 µL של ddH נטולת נוקלאז 2 O.</li>
		<li>מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה ב thermomixer ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות</li>
		<li>בעקבות דגירה, מיד להוסיף 4 µL של בדיקה התאמה אישית. דגירה דוגמאות הצנטרפוגה תרמי ב 65 & #176; C עם מכסה מחומם ל 75 ° C עבור 4 h.</li>
	</ol></li> <li>DNA קטעים לכידת <ol><li>דגירה המטרה hybridized DNA עם חרוזים streptavidin ואחריו לשטוף את החרוזים להסיר את ה-DNA לא מאוגד. להשתמש בערכה מסחרי על פי יצרן &#39; s הוראות להגיע µL 20 הסופי של חרוזים resuspended עם ה-DNA שנתפסו קטעים.</li>
	</ol></li> <li>הגברה של ה-DNA שנתפסו קטעים <ol><li>ה-PCR לבצע שימוש המסחרי קיט עם 2 מיקרומטר עמוד השדרה oligonucleotides, על פי היצרן &#39; הוראות s.</li>
		<li>כאשר PCR התגובה הושלמה, להוסיף µL 45 של חרוזים תלויים ישירות על המוצר PCR ולהעשיר את שברי DNA היעד מוגבר קשור החרוזים מאת • תנאי עם 30 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>לכמת שברי DNA עם ערכת כימות ספריה, לקבוע את אורך קטע הממוצע על ידי Bioanalyzer ( איור 2).</li></ol>
 4. רצף <ol><li>רצף מרובב ספריות באמצעות 75 פועל מזווג-end bp על ברצף benchtop עבור נתונים הכולל 18 ח' המיוצר הוא עד 60 ג'יגה-בתים, 15 גר' נדרש עבור החולה מדגם cfDNA ו- 1G עבור שליטה דגימת gDNA.</li></ol>
 5. נתוני ניתוח זרימת הערה: איור 3 מציג את תהליך ניתוח עבודה כללית זרימה ונתונים. הפרמטרים לניתוח נתונים ופקודות מוצגים להלן.
<ol><li>לסנן באיכות נמוכה קריאות ולתקן שגיאות, מיסוך של ה-UID באמצעות NCfilter. 
	NCfilter(own) NCfilter לסנן -l 5 - q 0.5 -n 0.1 -T fastq1 - G-1 3-2 fastq2 realSeq(own) פייתון bin/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2 -o פלט הפקודה dir -p קידומת -u 4 -s 7 - מ' 3 -i uidFile-פ</li>
	<li>התייחסות הגנום hg19 (הגנום האנושי 19), אתר את התוצאות רצף תוך שימוש בזיכרון BWA (גירסה 0.7.12-r1039) ויישר מחדש עם הגנום ניתוח Toolkit (GATK) (גרסה 3.4-46-gbc02625). 
	bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-ידוע dbsnp &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - אני cancerBam-אני normalBam java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 IndelRealigner -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T-ידוע dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals מרווחי-אני cancerBam-אני normalBam</li>
	<li>אשכול את הכפילויות בהתאם ה-UID והמיקום של השברים תבנית, אשר לתקן את השגיאה בסיסים לראשונה על ידי ה-PCR/רצף ולשנות את איכות הבסיס. 
	realSeq(own) פייתון realSeq/bin/realSeq אשכול -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p קידומת -m 6</li> <li>ליישר מחדש את הכפילויות באשכולות על ידי BWA לזכור: 
	bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>לבצע את ההתכנסות המקומי ולאחריו ודרוש כיול מחדש של ציון איכות הבסיס באמצעות GATK (גרסה 3.4-46-gbc02625). 
	Loacal ההתכנסות: java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-ידוע dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 . אני cancerBam-אני normalBam java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 IndelRealigner -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T-ידוע dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals מרווחי זמן-אני cancerBam-אני normalBam למשובטים ניקוד איכות-הבסיס: java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - hg19 BaseRecalibrator -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites הקוסמי - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct... 10 - אני בום -o grp java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-ג'אר GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-אני בום - BQSR grp -o... outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>עבור SNV (משתנה נוקלאוטיד יחיד) וקורא ויאסין (קטן הוספות או מחיקות), הדיוק של מוטציות בתדר נמוך עוד יותר אושר על ידי GSR (תמיכה טובה קורא) עם שניהם סטרנד ואחורה לקרוא זוגות ולסינון באמצעות קבוצת הביקורת (germline מוטציות) ומסד הנתונים של תוכנית בסיסית- 
	realDcaller(own) פייתון realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30</li> <li>שתשמש בסיס דגימות פקד שהתקשרת CNV (עותק מספר וריאציות). 
	NCcnv(own) פייתון NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk</li> <li>Realigned לא ממופים, קליפים וקורא זוג צורמים להתקשר SV (וריאציות מבניות). 
	NCsv(own) פייתון NCsv tmpdir -t - r hg19 outputdir -o - x התעתיק -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol><li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li>
<li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences%3A+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Catherine_Alix-Panabieres/publication/51770394_Circulating_Tumor_Cells_and_Circulating_Tumor_DNA/links/00b4953b6621e29429000000.pdf">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li>
<li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li>
<li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li>
<li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

קיומה של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) התגלה לפני יותר מ-30 שנה, אולם היישום של ניתוחים ctDNA הוא עדיין אינו שגרתי בפרקטיקה הקלינית. עניין היישום המעשי של שיטות ctDNA גדל עם התפתחות טכנולוגיות ctDNA זיהוי, ניתוח. הגידול ניטור עם ctDNA מציעה גישה מינימלית פולשנית להערכה של מחלה שיורית מיקרוסקופית, בתגובה טיפול ופרופילים הגידול מולקולרית תחת הרקע של גידול אבולוציה ו intratumoral הטרוגניות13, 14. שיפורים רגישות וסגוליות של ניתוח יקל על כל אלה יישומים1...

הדור הבא רצפי (הגדרות), כלי רב עוצמה כדי לחקור את המסתורין של הגנום, יכול לספק כמות גדולה של מידע, אשר עלול לגלות שינויים גנטיים. היישום של המיתרים ניתוח במרפאה הפך נפוץ יותר, במיוחד עבור רפואה אישית. אחת המגבלות הגדול ביותר של המיתרים, אולם, הוא שיעור שגיאה גבוהה. למרות הוא סבור כי מתאים לומד מוטציות תורשתיות, הניתוח של מוטציות נדירות היא מוגבלת מאוד1,2, במיוחד כאשר ניתוח DNA המתקבל "ביופסיה נוזלי".
במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא ה-DNA ללא תא (cfDNA) הדם ישפך מתאי הגידול. ברוב המקרים, הכמות של ctDNA הוא נמוך ביותר, בו לבצע זיהוי וניתוח שלה מאוד מאתגר. עם זאת, ctDNA יש תכונות אטרקטיביות רבות: הניתוק הוא פולשנית, שניתן יהיה לזהותו בשלבים המוקדמים של הגידול, רמת ctDNA משקף יעילות טיפולית, ctDNA מכיל DNA מוטציות נמצאו בנגעים הראשי והן גרורתי 3 , 4 , 5. לפיכך, לאור ההתפתחות המהירה של המיתרים טכניקה, ניתוח, היישום של זיהוי ctDNA הפך אטרקטיבי יותר.
גישות שונות רצף מקביל בנפט כבר נעזרו ctDNA זיהוי אבל אף אחד גישות אלה התקבלו לשימוש שגרתית במרפאות בשל המגבלות שלהם: נמוך רגישות, חוסר צדדיות, ועלות גבוהה יחסית6 7, ,8. לדוגמה, רצף דופלקס, בהתבסס על תג המזהה הייחודי (UID), שוב ושוב מתקנת שגיאות ההכפלה קונצנזוס, ומתקן שגיאות רצף רוב. אולם, הכדאיות של שיטה זו הוא לאיבוד בשל העלות הגבוהה שלה נתונים נמוכה ניצול9,10. באופן דומה, קאפ-Seq שלה איטראציה משופרת,11,קאפ-אידו12, יש המעשיות גדול בזיהוי cfDNA, למרות הדיוק ואת אוניברסאליות של שיטות אלה זקוקים לשיפור.
כדי לענות על הצורך הנוכחי ctDNA מדויק זיהוי, ניתוח, פיתחנו אסטרטגיה חדשה להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). גישה זו משלבת את הדברים הבאים: רצף ייחודי מתאמי ביעילות לשחזר מולקולות ctDNA, עם תיקון שגיאות דו-כיוונית ואת היכולת להבחין בין מוטציה יחידה מתוך &#62; נוקלאוטידים פראי-סוג 1 × 107 ; הגששים 1021 kb אשר להעשיר מדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות גידול של 12 גידולים, כולל סרטן הריאות, סרטן המעי הגס, סרטן הקיבה, סרטן השד, סרטן הכליה, סרטן הלבלב, סרטן הכבד, סרטן בלוטת התריס, סרטן צוואר הרחם, סרטן הוושט, סרטן רירית הרחם (טבלה 1); וסינון מסד נתונים בסיסי שהופך אותו יעיל וקל לזיהוי מוטציות נדירות בדיוק ב- ctDNA.
כדי לבנות מסד נתונים של תוכנית בסיסית, למצוא כל מוטציות מאת ER-Seq ממספר אותו סוג של דגימות (~ 1000 בהתחלה). מוטציות אלה אמיתית יש לאמת על ידי מספר שיטות זיהוי אמין וניתוח אחרים. בשלב הבא, לסכם את התבנית של מוטציות שווא, אשכול כל מוטציות שווא כדי לבנות את מסד הנתונים של התוכנית הבסיסית הראשונית. המשך להוסיף מוטציות שווא למצוא מן הניסויים הבאים רצף מסד נתונים זה. לכן, מסד נתונים בסיסית זה הופך מסד נתונים מורחב דינאמי, אשר משפר באופן משמעותי את רצף דיוק.
לעודד התקדמות הגידול אבחון וניטור, נציג אר-Seq, שיטה בעלות נמוכה האפשריים לצורך רכישת נתונים אוניברסלי. נציג חקר מקרה שגם עברה ניתוח ER-Seq, הממחיש את רמת הדיוק שלה לזיהוי מוטציות נדירות, היתכנות לשימוש במרפאה.

<table><tbody><tr><td>ערכת חומצות גרעין במחזור QIAamp</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>מיצוי DNA מדם היקפי עבור cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA ערכת מיני דם</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>מיצוי DNA מדם היקפי עבור gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>מדידת ריכוז cfDNA</td></tr><tr><td>ערכת בדיקה Quant-iT dsDNA BR</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>מדידה ריכוז ספרייה</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 ריאגנטים</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>מדידת cfDNA ושברי ספרייה</td></tr><tr><td>ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA NEBNext UltraII עבור הכנת</td><td>ספריית</td>Illumina <td>NEB</td><td>E7645L</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagent</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>סינון וטיהור שברי DNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 מ"מ, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>פירוק</td></tr><tr><td>בדיקות נעילה של xGen</td><td>IDT</td><td>&mdash; &mdash;</td><td>בדיקה מותאמת אישית של xGen</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>לכידת DNA ממוקדת</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>לכידת DNA ממוקדת</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagents</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>לכידת DNA ממוקדת</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>ספריות העשרה PCR לאחר לכידה</td></tr><tr><td>ערכת כימות ספריית KAPA</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>מדידת ריכוז ספרייה</td></tr><tr><td>NextSeq 500 ערכת תפוקה גבוהה v2 ((150 מחזורים)</td> <td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה רצף 5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>מדידת ריכוז gDNA</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>דגירה 16</td></tr><tr><td>צינורות DynaMagTM-2 מגנט</td><td>חיים</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>רכז פלוס</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>הבאSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של מוטציות נדירות ctdna באמצעות רצף הדור הבא

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

הניתוח של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) באמצעות הדור הבא רצפי (הגדרות) הפך להיות כלי רב ערך עבור הפיתוח לאונקולוגיה קלינית. עם זאת, היישום של שיטה זו הוא מאתגר עקב רגישות נמוכה שלה בניתוח הסכום עקבות של ctDNA בדם. יתר על כן, שיטת עשויה ליצור תוצאות false חיוביות ושליליות בניתוח רצף וזו שלאחריה. כדי לשפר את כדאיות והאמינות של זיהוי ctDNA במרפאה, כאן אנו מציגים טכניקה אשר מעשיר מוטציות נדירות עבור רצף, להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). ER-Seq יכולים להבחין מוטציה יחידה מחוץ נוקלאוטידים פראי-סוג של7 עונה 1 פרק 10, אשר הופכת כלי מבטיח כדי לזהות שינויים גנטיים בתדר נמוך מאוד, וכך יהיה שימושי מאוד בלימוד מחלת heterogenicity. בזכות מצדו של המתאם רצף ייחודי, שיטה זו מאפשרת שחזור יעיל של מולקולות ctDNA, בעוד בלתקן באותו זמן עבור שגיאות ההכפלה (antisense על תבונה). הבחירה שלנו של הגששים 1021 kb מעשיר את המדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות הגידול הנהג בגידולים 12. שיטה חסכונית ואוניברסלית זו מאפשרת הצטברות מוצלח באופן ייחודי של מידע גנטי. לאחר ביעילות סינון רקע שגיאה, ER-seq בדיוק לזהות מוטציות נדירות. באמצעות חקר מקרה, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט הוכחת בדיקה, בניית ספרייה, ועיצוב יעד ה-DNA לכידת מתודולוגיות, כולל ניתוח נתונים זרימת העבודה. כדי לבצע את שיטה זו בדרך כלל לוקח 1-2 ימים.

הגששים 1021 kb היעד מועשר אזורים המשמשים ER-Seq מוצגים בטבלה 1, המכסה מעל 95% של מוטציות 12 גידולים נפוצים. מגוון רחב של רגשים אלו הופך תהליך זה החלים רוב חולי סרטן. בנוסף, מתאמי רצף ייחודי ואת ההקרנה מסד הנתונים הבסיסית שלנו מאפשרים לזהות מוטציות נדירות בדיוק.
בשל מאפיינים שונים של gDNA ו- cfDNA מופק דם היקפיים, יש מגוון רחב של איכות הנתונים, אשר נקבע על ידי מכשירים שונים ועל פקדים איכות שמוצג...

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות מוטציות בתדירות נמוכה בגידול במחזור או ctDNA כדי לספק לרופאים קליניים כלי רב עוצמה לאבחון גידולים ולניטור דינמיקת הגידול בתגובה לטיפול. שיטת בדיקת ctDNA יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי סוגי המוטציות שמטופל נושא כגון וריאציה גרעינית בודדת, מחיקת הכנסה, וריאציה של מספר עותקים ושונות מבנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא רגישות וסגוליות גבוהות הנוגעות לזיהוי מדויק של מוטציות בתדר נמוך ב-ctDNA.מי שתדגים את הנהלים תהיה יוליאנג יאנג, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, שאבו 10 מיליליטר של דם היקפי בצינור איסוף והפכו בעדינות את הצינור למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים כדי לערבב את התוכן. אחסן דגימות דם בצינורות האיסוף בטמפרטורה של שש עד 37 מעלות צלזיוס למשך עד 72 שעות.צנטריפוגה את צינור האיסוף ב -1, 600 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן השתמש בפיפטה לסילוק כדי להעביר את הסופרנטנט או הפלזמה מהצינור לארבעה צינורות צנטריפוגה נקיים של שני מיליליטר המסומנים כראוי מבלי להפריע לגלולה. השתמש בפיפטה נקייה כדי להעביר מיליליטר אחד מהתאים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המסומן כראוי.אחסן את התאים במינוס 20 מעלות צלזיוס או קר יותר לפני בידוד גנומי או gDNA. לאחר מכן, צנטריפוגה את הפלזמה ב -1, 600 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).

זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא

למד לזהות מוטציות נדירות ב-ctDNA באמצעות שיטת ER-Seq עם תיקון שגיאות דו-כיווני. טכניקה זו מציעה רגישות וספציפיות גבוהות לאבחון סרטן ומעקב אחרי תגובה לטיפול.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

גלה סרטונים נוספים