Name: בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד המוני של מיראצידיה מביצי Schistosoma mansoni וטיפוחם במבחנה. שיטה זו מסייעת בחקר בילהרציה ובהבנת מחזור החיים של הטפיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מומן בחלקו על ידי מענק-NIH RO1AI015503. עכברים נגועים schistosome נמסרו על ידי המרכז משאב NIAID בילהרציה מכון המחקר הביו-רפואי (Rockville, MD) דרך NIH-NIAID חוזה HHSN272201000005I להפצה באמצעות משאבים BEI.

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון תחת פרוטוקול אין. V005717. להלן כללי התנהגות כרוך עובד במתקן אבטחה ברמה 2 (BSL2) עבור האדם פתוגנים, אף אחד השלבים schistosome מצטיירת פרוטוקול זה אמנם זיהומיות בני אדם או יונקים אחרים. בצע את מדיניות מוסדית לטיפול פתוגנים האנושי הסיכון קבוצה 2 (RG2).
הערה: אנו משתמשים הנשי עכברים שוויצרי-וובסטר (6 - בן שבועיים) עקב הרגישות שלהם גבוה יותר זיהום10, ובכך מניב בנטל ביצה גדולה יותר. טאקר. et al. תאר את הפרוטוקולים זיהום עכבר וחילזון המשמשים את מערכת דגם11. טבלה של חומרים מפורטים כל ציוד ספציפי, חומרים, ריאגנטים, מקורות בעלי חיים צריכה לבצע פרוטוקול ניסיוני זה.
1. עיבוד של כבדי נגוע
<ol><li>המתת חסד עכברים, 6-7 שבועות לאחר הפגיעה, בעזרת CO2 (בשיעור של 10-30% נפח החדר לדקה). לפקח על עכברים על הפסקת נשימה, פעימות הלב. הערה: בדרך כלל, עד 20 עכברים יכול לעבד בזמן נתון.</li>
	<li>לאחר העברת עכברים לאללה אבטחה cabinet, במקום עכברים על גבם, לרסס משטחים הגחון שלהם עם 70% אתנול. תן משרים למשך 1 דקות.</li>
	<li>לצבוט למשוך את העור של הבטן התחתונה, חצו הבסיס של העור צבט הקרוב ביותר אל הבטן עם מספריים כירורגיים סטרילי. משוך את העור חתוך anteriorly (קרי, לכיוון הראש) כדי לחשוף את הכבד. שים לב לכך הכבד צריך להיות מוגדל מנומר עקב ביצה-induced גרגירומת ממושכת מענה (איור 2 א).</li>
	<li>להסיר את הכבד ומניחים אותו בתוך המכיל 200 מיליליטר סטרילי 1.2% NaCl פתרון המכיל עט/סטרפ.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 עם עכברים הנותרים. הערה: עכברים עשרים מעובדים בדרך כלל הקציר יחיד.</li>
	<li>מקם את הכבדים בצלחת פטרי סטריליות ולהסיר שומן שאינו כבד/ורקמות עם מלקחיים סטרילי.</li>
	<li>העברה כבדי חיתוך/לנקות בקבוק צנטריפוגה 250-mL סטרילי המכיל ~ 200 מ ל- 1.2% NaCl פתרון סטרילי עם עט/סטרפ.</li>
	<li>נמרצות לנער את הבקבוק המכיל את הכבדים ולהסיר, באמצעות פיפטה חד פעמי סטרילי, פני השטח עודף קצף צף פסולת. לאט לאט יוצקים את תמיסת מלח שנותרו לתוך מכולה או כיור המכיל 1% מלבין (מחטא).</li>
	<li>~ 200 מ"ל תמיסת טריים להוסיף הכבדים, חזור על שלב 1.8 שלוש פעמים נוספות.</li>
</ol>2. הכבד בידוד חילוץ ו- miracidial
<ol><li>מקם את הכבדים לתוך כוס בלנדר נירוסטה סטרילי קטן ולהוסיף ~ 2 מ"ל של 1.2% NaCl פתרון (איור 2B).</li>
	<li>לכסות את הספל עם רדיד, צלחת פטרי כדי למנוע נשפך, תערובת של 1 דקות, לסירוגין מהירות נמוך וגבוה (20 s מהירות נמוכה/10 s במהירות גבוהה; repeat) (איור 2C).</li>
	<li>פזר באופן שווה ההשעיה הכבד מעורב לתוך צנטריפוגה 250-mL סטרילי בקבוקים (עבור כבדי 20 להשתמש 4 בקבוקים).</li>
	<li>להוסיף מלח סטרילית עם אנטיביוטיקה ~ 200 מל סה כ נפח/בקבוק. שוקלים/איזון בקבוקים לפני צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה הכבדים מעורבב ב 290 x g למשך 15 דקות בבית 4 oC. בעדינות יוצקים את supernatants לתוך מיכל עם אקונומיקה לפני השלכת.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.4-2.5 פעם אחת. הקפד ביסודיות resuspend משקע כבד לפני צנטריפוגה.</li>
	<li>לאחר השמטת את תמיסת המלח האחרון לשטוף (שלב 2.6), להוסיף 200 מ ל מים בריכה סטרילית עם עט/דלקת רקמת הכבד pelleted, ללחוץ כדי resuspend משקעים, ולהעביר את המתלים מעוקר 1-L סטריליות זה כבר מכוסה לגמרי עם אלומיניום רדיד, למעט החלק העליון 3 ס מ של הצוואר (איור דו-ממדי). הערה: השתמש שני בקבוקים (= 10 כבדי) לכל 1-L את הבקבוק. אגם מים המדמה את הסביבה הטבעית מים מתוקים צריך לעורר miracidial הבקיעה מביצים.</li>
	<li>באמצעות מים בריכה סטרילית, למלא את הבקבוק כדי כ- 3 ס מ מעל רדיד האלומיניום מכסה על הצוואר. ואז, ללא דיחוי (כפי miracidia בקרוב מתחילות לבקוע), להסיר קצף שיורית ואת רקמת הכבד צפים אל פני השטח על ידי מהר pipetting למעלה ~ 12 מ ל מים בריכה המכילים פסולת וזורקים השמטת את זה לתוך נפרדת שפופרת. להחליף מים טריים בריכה סטרילית.</li>
	<li>חזור על 2.8 שלב הניקוי, עוד שלוש פעמים, בדיקת נוכחות של miracidia בצינור להשליך. להפסיק את החזרה על ניקוי שלב אם miracidia מופיע בהפתרון לשטוף.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה לאט להוסיף ~ 12 מ ל מים חמים בריכה סטרילית (טרום התחמם עד 30 oC) ליצירת מעבר צבע הטמפרטורה במים חמים נקי, סטרילי על העליונה. הערה: זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי לאט מתרוקנת מים לאורך צדי בצוואר הבקבוק כדי למנוע ערבוב.</li>
	<li>הצב כיסוי פטרי קטן מעל הפתח הבקבוק והשכם אור בהיר לרוחב החלק העליון של הבקבוק מעל השער בנייר כסף כדי להאיר את המשטח העליון של מים. הערה: בדרך כלל, בתוך 5-10 דקות, לשחות miracidia, נמשך אל האור, נתמקד במספר גדול בתוך הראשונה 2-3 ס מ של אגם המים (איור 3 א).</li>
</ol>3. Miracidial קציר והטיפוח -תרגול
<ol><li>כאשר miracidia צבר על פני השטח לאחר 10 דקות, באמצעות pipet של העברת סטרילי, להסיר ~ 8 מ של אגם מים, העברת שפופרת צנטרפוגה 15-mL סטרילי. מקם את הצינור המכיל miracidia על הקרח.</li>
	<li>להוסיף גב 8 מ ל מים חמים בריכה סטרילית לאורך החלק הפנימי של סטריליות ולא לחכות עוד 10 דקות.</li>
	<li>באמצעות צינורות חדשים בכל פעם, חזור על שלבים 3.1 ו- 3.2 שלוש פעמים נוספות. לאחר לאוסףה 4, לשמור את הצינור הסופי על קרח למשך 10 דקות לאפשר את miracidia להתיישב. קבוצה זו של צינורות כוללת הקציר הראשון.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות המכיל miracidia ב g x 290 דקות 1-4 oC ומפרידה בקירור טרום מקורר.</li>
	<li>להסיר לאלתר את רוב תגובת שיקוע (~ 7 מ"ל) נזהר שלא להפריע בגדר טפיל (איור 3B).</li>
	<li>בריכה כל miracidia מ זה הקציר הראשון לתוך אחד צינור, ואז לשטוף את כל הצינורות המקוריים עם בריכה סטרילית ~ 1 מ"ל מים ולהוסיף הצינור"במאגר".</li>
	<li>לאפשר טפילים להתיישב על קרח ~ 5 דקות, שוב centrifuge הטפילים ב g x 290 דקות 1-4 oC.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והוסף שמאוזן טשערנין סטרילי של 6-8 מ ל תמיסת מלח (CBSS +; ראה טבלה של חומרים) המכיל עט/סטרפ.</li>
	<li>בעדינות להשעות את miracidia ואת aliquot אותם לתוך צלחת 24-ובכן התרבות (1 מ"ל לכל טוב), ואחריו שטיפה הצינור ב- 6-8 מ ל CBSS + הוספת 1 מ"ל של שטיפה מכל קידוח. דגירה טפילים-26 oC בתנאים normoxic. ריכוזי miracidia מבודדים משתנים, אך בדרך כלל יהיה בממוצע ~ 7000/mL.</li>
	<li>אם טפילים עדיין מתרכז ב מקור האור, חזור על השלבים 3.1 ל 3.9 להמשיך לקצור מאוחר-הבקיעה miracidia אך להגדיל את מרווח הזמן בין אוספי ל 15-20 דקות. הערה: זו קבוצה חדשה של צינורות מייצג את הקציר השני. עם זאת, כי miracidial מספרים נמוכים בדרך כלל, הזחלים משפופרות כל בדרך כלל הם איחדו לתוך תרבות טוב המכיל 2 מ"ל CBSS +.</li>
	<li>24 שעות לאחר הקציר, טיפוח, בעדינות resuspend sporocysts בבארות שלהם על-ידי pipetting.</li>
	<li>המתן מספר דקות כדי לאפשר טפילים להתיישב לתחתית הבארות. ברגע שהם התיישבו, הסר בזהירות את תגובת שיקוע (~1.5 מ"ל), אשר יכיל רוב ciliated באפידרמיס הצלחות לשפוך על ידי miracidia במהלך טרנספורמציה זחל. זה "שינוי" supernatant עשויים שנמחקו או שולבו מחקרי מעקב של מוצרים הפרשה זחל.</li>
	<li>להוסיף 1.5 מ של CBSS טריים + כל טוב, בעדינות פיפטה כדי resuspend sporocysts. חזור על שלב 3.12 אם עוד כביסה או שינוי למדיום אחר רצוי.</li>
</ol>

<ol><li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)61949-2/abstract">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+worldwide+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly.+Epidemiol.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li>
<li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. <a target="_blank" href="https://www.routledge.com/Schistosoma-Biology-Pathology-and-Control/Jamieson/p/book/9781498744256">Schistosoma: biology, pathology and control</a>. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).</li>
<li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+%28trematode%29+Schistosoma+mansoni%3A+a+2009+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li>
<li>Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshino%2C+TP+%22Biomphalaria+snails+and+larval+trematodes%22">Biomphalaria snails and larval trematodes</a>. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).</li>
<li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites%3A+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li>
<li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li>
<li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19462900219">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li>
<li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li>
<li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+mortality%2C+pathophysiology%2C+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li>
<li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Proto+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li>
<li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni%3A+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni%3A+their+occurrence+and+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li>
<li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li>
<li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+EL+%22Invertebrate+tissue+culture%3A+Research+applications%22">Invertebrate tissue culture: Research applications</a>. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).</li>
<li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li>
<li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li>
<li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscan+cells+in+culture%3A+primary+cell+cultures+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li>
<li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flukes+without+snails%3A+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li>
<li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li>
</ol>

לעורכים יש דבר לחשוף.

Miracidia של S. mansoni, מבודד ולמניפולציה כמתואר להלן, יכול להדביק רק חילזון המארח ביניים, ולכן אינם מייצגים הביולוגי האנושי במהלך שלב זה של התפתחות הזחל. עם זאת, כדי למנוע חשיפה מקרית/זיהום של חלזונות, להקפיד לבצע miracidial ומשום במיקום שונה מאזורים שבו רגישים מינים חילזון Biomphalaria עשוי להיות נוכח או מתוחזקים. חדר נפרד, רשום כמרחב BSL2, מומלץ בחום. בנוסף, לשטוף כל פתרונות שימוש בעיבוד של כבדי ובידוד זחל צריכים להיות מטופלים עם חומר חיטוי (למשל, 1% מלבין) לפני סילוק.
<p class="jove_co...

האדם דם spp. עלקת הבילהרציה פספוסים, הסוכנים סיבתי של בילהרציה, מחלה טרופית מוזנח מתעצמת משוער 230 מיליון בני אדם ברחבי העולם1. המין הנפוץ ביותר, עלקת הבילהרציה mansoni, מופץ גיאוגרפית בדרום אמריקה, האיים הקריביים, המזרח התיכון, אפריקה לסהרה2. מחזור החיים של S. mansoni, ו schistosomes אחרים, היא מורכבת, מעורבים שורה מהווים הסופית יונקים ו חלזונות מים מתוקים של הסוג Biomphalaria המשמשים כפונדקאים ביניים בלבד.
S. mansoni מבוגר זכר ונקבה תולעת זוגות המתגוררים וורידי מצע המעי העליון האחורי להתרבות בתרבית של המארח, וכתוצאה מכך שחרורו של embryonated ביציות (פשוט) זה להיות תקוע בעצם venules קטן של רירית המעי. הביצים ואז פורץ דרך הקירות כלי השיט, דרך רקמות mucosal והזן בסופו של דבר לומן מעיים היכן הם נמצאים בוטל עם הצואה. כאשר ביצית מזין את הצוהר הזחלים מים מתוקים, free-swimming (miracidia), שהם חייבים, סדר קצר, למצוא חילזון Biomphalaria מתאימים כדי להדביק על מנת להמשיך את מחזור חייו. תהליך זיהום זה כרוך miracidial מצורף משטח הגוף החיצוני של החילזון ואחריו חדירה פעיל, כניסה של הזחל לתוך המחשב המארח. זמן קצר לאחר הכניסה, miracidium מתחיל לשפוך צלחות אפידרמיס ciliated החיצוני שלה כמו צורות syncytium שיהפכו את המשטח החיצוני החדש (tegument) של הזחל הבא, sporocyst ראשי או אמא. דרך רבייה אל-זוויגית, כל sporocyst ראשית מייצרת ומשחרר דור שני של sporocysts, כינה משני או הבת sporocysts, אשר בתורו, לייצר ולשחרר מספר גדול של השלב הסופי intramolluscan, cercaria3 . על הבריחה מהמחשב המארח חילזון, free-swimming cercariae מסוגלים הצמדת וחודר ישירות על העור של האדם או אחר מתאים שורה יונקים. כשנכנסתי אל הפונדקאי החדש שלהם, cercariae להפוך לבמה schistosomula טפיליות ו לפלוש במערכת כלי הדם. הם, בתורו, נודדים הריאה ולאחר מכן את וריד הכבד שבו הם התבגרת. תולעים בוגרות, יוצרות זוגות זכר ונקבה, לנסוע אל הורידים מצע המעי העליון כדי להשלים את מחזור החיים שלהם.
מוצלחת intramolluscan או "חילזון שלב" התפתחות הזחל schistosomes חיוני המשכיות המחזור של שידור מארח למארח אנושי. חשיבות קריטית היא הערך הבא תקופה של miracidium free-swimming לתוך המחשב המארח חילזון וטרנספורמציה מוקדם שלה על הבמה הראשית sporocyst. בהתאם התאימות פיזיולוגי ו בין המארח לבין טפיל, זה במהלך שלב זה של התפתחות הזחל את ההצלחה הראשונית או כשל ליצור זיהומים הוא נחוש4,5,6 . עוקבות התפתחות מסוגל לייצר asexually sporocysts משני, אשר לאחר מכן ליצור cercariae אנוש-זיהומיות, ראשי sporocysts נוספות דורשות סביבה מארח פיזיולוגיים מתירניות מספק עבור כל הצמיחה של הטפיל, הרבייה צריך.
עד כה, מעט מאוד ידוע על הבסיסית פיסיולוגי, ביוכימי, תהליכים מולקולריים אינטראקציות schistosome-חילזון לשליטה, במיוחד מולקולות מסלולים מעורבים בוויסות התפתחות הזחל ורביה, או להתכוונן תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. מוכן גישה לכמויות גדולות של אלה שדרגות בתנאים in vitro לקשרי תרבות כי היתר מניפולציה ניסויית מאוד להקל על הגילוי של מסלולים התפתחותית ומנגנונים הבסיסית של צמיחת תאים, בידול רבייה... נתיבים קריטיים טפיל או מנגנונים, מזוהה באמצעות ניסויים במבחנה , יוכל לשמש לאחר מכן כדי לשבש את הזחל הצמיחה רבייה במארח חילזון, או כדי לזהות חילזון מארח המערכת החיסונית מנגנונים מעורבים זיהוי ולמניעת שלבים miracidial או sporocyst.
זה מאמר, מצגת וידאו, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה לבודד מספר רב של free-swimming S. mansoni miracidia עבור מבוא לתרבות במבחנה זה עלולים להיות נתונים מעקב ניסיוני מניפולציה (ראו איור 1 מבט סכמטי של זרימת העבודה לפרוטוקול). אף על פי נהלים דומים שתוארו קודם לכן7,8,9, הרגשנו כי פרוטוקול מפורט יהיה שימושי לחוקרים המעוניינים להעסיק. את מודל זה להפנות שאלות שלא נענו עדיין קשורים פיתוח זחל intramolluscan תאית שגשוג, אינטראקציות המערכת החיסונית schistosome-חילזון. בנוסף, גישה זו יכולה להתאים בקלות עבור בידוד של הביצים אחרים trematodes חשוב מבחינה רפואית כגון שלפוחית השתן-דיור ס haematobium, פספוסים הכבד או הריאות פספוסים.

<table><tbody><tr><td><חזק>תמיסת מלח מאוזנת של צ'רנין (CBSS+)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>עבור 1 ליטר תמיסה</חזק></td></tr><tr><td>2.8 גרם נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-3</td><td>ממיסים מלחים, למעט סידן כלורי, ו&nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 גרם אשלגן כלורי&nbsp;</td>סוכרים <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>ב-800 מ"ל ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 גרם נתרן פוספט, דו-בסיסי נטול מים</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>ממיסים סידן כלורי בנפרד ב-200&nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 גרם מגנזיום גופרתי heptahydrate&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1880</td><td>מ"ל ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 גרם סידן כלוריד דיהידרט&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>מוסיפים לאט לאט סולן סידן לסולן המלח/סוכר עם&nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 גרם נתרן ביקרבונט&nbsp; &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S233-3</td><td>עם ערבוב קבוע</td></tr><tr><td>1 גרם גלוקוז</td><td>MP ביומדיקל</td><td>152527</td><td>להתאים ל-pH 7.2 ולעקר מסנן באמצעות a&nbsp;</td></tr><tr><td>1 גרם טרהלוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 ומיקרו; m מסנן בקבוק חד פעמי</td></tr><tr><td>10 מ"ל 100X פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>הוסף פניצילין מסונן וסטרפטומיצין soln&nbsp; שימוש קודם</td></tr><tr><td><חזק>Bge&nbsp; בינוני (Ibge)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>לתמיסה של 900 מ"ל</חזק></td></tr><tr><td>220 מ"ל שניידר' s Drosophila בינוני שונה</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>ערבב את המדיום של שניידר עם 680 מ"ל ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 גרם הידרוליזט אנזימטי לקטאלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>הוסף הידרוליזט לקטאלבומין וגלקטוז</td></tr><tr><td>1.3 גרם גלקטוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>התאם ל-pH 7.2 ועקר מסנן באמצעות 0.22 ומיקרו; m מסנן בקבוק חד פעמי מעוקר מראש</td></tr><tr><td><חזק>מדיום Bge שלם (cBge)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>עבור 100 מ"ל תמיסה</חזק></td></tr><tr><td>90 מ"ל מדיום</td><td></td><td></td> Bge לא שלם <td>לביטול חום FBS: דגירה FBS מופשר ב&nbsp;</td></tr><tr><td>9 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) (אופטימה)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>אמבט מים ב-60&80; C למשך שעה בעדינות&nbsp;</td></tr><tr><td>1 מ"ל 100X פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>לסובב את הבקבוק כל 10 דקות Aliquot FBS מומת בחום לתוך צינורות של 15 מ"ל&nbsp; ולאחסן ב-20&deg;C.&nbsp; מערבבים מסנן בינוני + FBS ו מעקרים באמצעות 0.22 & מיקרו; M מעוקר מראש&nbsp; מסנן בקבוק חד פעמי&nbsp; הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לפני השימוש</td></tr><tr><td><חזק>מי בריכה (תמיסת מלאי)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>1 ליטר של תמיסת מלאי</חזק></td></tr><tr><td>12.5 גרם סידן פחמתי</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>מערבבים את כל המלחים ב-1 ליטר של ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 גרם מגנזיום קרבונט</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>שימו לב שהמלחים לא יהיו לגמרי&nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 גרם&nbsp; נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-3</td><td>מומס.&nbsp; יש לנער נמרצות כדי להשהות&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 גרם&nbsp; מלחי אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5405</td><td>לפני הכנת הסולן העובד&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td><חזק>מי בריכה (תמיסת עבודה)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>1.5 ליטר תמיסה</חזק></td></tr><tr><td>0.8 מ"ל תמיסת מלאי מי בריכה (לנער לפני שימוש) ב&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>מערבבים ציר ל-ddH2O</td></tr><tr><td>1500 מ"ל של ddH2O</td><td></td><td></td><td>מעקרים את מי הבריכה על ידי חיטוי (איטי&nbsp; מחזור)</td></tr> <tr><td>1.5 מ"ל של 100X פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לשימוש קודם</td></tr><tr><td><תמיסת מלח חזקה>(1.2% NaCl)</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>1.5 ליטר תמיסה</חזקה></td></tr><tr><td>18 גרם נתרן כלורי ב-1500 מ"ל של תמיסת מלח DDH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave לעיקור</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל של 100X פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לשימוש קודם</td></tr><tr><td><חזק>ציוד וחומר נוסף:&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-ליטר תא</td><td></td><td></td> המתת חסד של עכבר <td>בעקבות פרוטוקול IACUC מאושר מס' V001551</td></tr><tr><td>עכברים</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, נקבה, בת 6 שבועות, מורין&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 מיכל ווסת</td><td></td><td></td><td>צלחת</td></tr><tr><td>תרבית רקמות 24 בארות</td> ללא פתוגן <td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות</td><td></td><td></td><td></td>נפח 1-L</tr><tr><td>מקור אור (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>דגם F0-150</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, מקוררת, דלי מתנדנד</td><td>צנטריפוגה אפנדורף</td><td>דגם 5810R</td><td></td></tr><tr><td> בקבוקים (250 מ"ל)</td>צינורות צנטריפוגה <td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>430053</td><td></td></tr><tr><td>צינורות העברה חד פעמיים סטריליים&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנן בקבוק חד פעמי מעוקר מראש&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>בלנדר נירוסטה</td><td>Waring</td><td>מסחרי דגם 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>בלנדר, קיבולת 100 מ"ל</td><td>Waring מסחרי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרכובת הפוך</td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>ליקוי חמה של TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד המוני וטיפוח במבחנה intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי mansoni עלקת הבילהרציה

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

פספוסים דם אנושי, עלקת הבילהרציה spp., יש מחזור חיים מורכב שמערב שלבים התפתחותיים אל-זוויגית, מיניות בתוך השבלול ביניים, יונקים הסופי מארח, בהתאמה. היכולת לבודד ולקיים את שלבי מחזור החיים שונים בתנאים תרבות ' במבחנה הנחתה במידה רבה את חקירות של המנגנונים הסלולר, הביוכימי והמולקולרי ויסות טפיל צמיחה, פיתוח, מארח אינטראקציות. שידור של בילהרציה דורש רבייה אל-זוויגית ופיתוח של שלבים רבים זחל בתוך שבלול המארח; מ miracidium זיהומיות, דרך sporocysts ראשיים ומשניים, ועד השלב הסופי cercarial זה מסוגל להזיק לבני. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור המוני הבקיעה ובידוד של עלקת הבילהרציה mansoni miracidia מביצים המתקבל הכבדים של עכברים נגועים, מבוא עוקבות שלהם לתוך התרבות במבחנה . הוא צפוי כי פרוטוקול מפורט יעודד חוקרים חדשים לעסוק ולהרחיב שדה חשוב זה של מחקר schistosome.

הרוב המכריע של miracidia בדרך כלל שנאסף ב- "יבולים" שני הראשונים. דגירה של מבודדים miracidia ב CBSS + מפעיל על תהליך הטרנספורמציה miracidium-אל-sporocyst (איור 4A- C). בתוך שעה הראשונה העברה הבא לתרבות בארות המכיל CBSS +, הרוב המכריע של miracidia הפסקת שחייה (איור 4A). ב- 6-אייץ ' בתרבות, miracidia בעיצומו של פעיל ששפך צלחות אפידרמיס ciliated שלהם (איור 4B). חופפת התהליך שפיכת, הזחלי...

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבקיעה ובידוד בקנה מידה גדול של שחייה חופשית Schistosoma mansoni miracidia והחדרה לאחר מכן לתרבית חוץ גופית. Schistosoma mansoni הוא אחד מארבעת המינים העיקריים של מזל הדם המדביקים למעלה ממאתיים מיליון אנשים ברחבי העולם וגורמים למחלה הטרופית המוזנחת הידועה בשם Schistosomiasis. מחזור החיים של הסכיסטוזום מורכב וכולל חלזונות כפונדקאי ביניים ויונקים כולל בני אדם כפונדקאים סופיים.גידול במבחנה של סכיסטוזומים זחלים ובוגרים מייצג כלי רב ערך לקידום המחקר לקראת בקרה וחיסול של מחלה טפילית זו. בסרטון זה, תוך שימוש במודל עכבר לייצור ביצי S.mansoni המכילות את השלב המיר-חומצי הנגוע בחילזון, אנו מדגימים הליך שלב אחר שלב לבידוד המוני של מירסידיה שבקעו מביצים שהוחזרו מכבד וגידולן במבחנה. מסייעים לי בהדגמה זו נטלי דינגוירארד וקודי היינמן.להלן דיאגרמת זרימת עבודה הממחישה את שלושת השלבים העיקריים שיש לכסות בסרטון הווידאו המצורף. בחלק הראשון, אנו מדגימים את העיבוד של כבדים נגועים. באמצעות עכברים הנגועים במבוגרים של Schistosoma mansoni, נתאר כיצד להסיר את הכבד הנגוע שלהם ואת השלבים המשמשים להכנתם למיזוג רקמות, כולל הסרת רקמה שאינה כבד ושטיפה לאחר מכן בתמיסת מלח סטרילית.בחלק השני, נראה כיצד מוציאים ביצים מכבדים ומבודדים מירסידיה. ביצים משתחררות מהכבד על ידי ערבוב מכני ו

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה ' מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

אנו מתארים כאן את ההתקדמות האחרונה בבידוד ויראלי לאפיון גנוטיפים חדשים של Faustovirus, שושלת חדשה הקשורה לאספרווירוס של נגיפי ענק. ניתן ליישם פרוטוקול זה על בידוד תפוקה גבוהה של וירוסים, במיוחד נגיפי ענק המדביקים אמבה.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

למדו פרוטוקול לבידוד המוני של מיראצידיה מביצי Schistosoma mansoni וטיפוחם במבחנה. שיטה זו מסייעת בחקר בילהרציה ובהבנת מחזור החיים של הטפיל.

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

גלה סרטונים נוספים