ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג חתכים תקינים של יותרת המוח עם ארכיטקטורות רקמות שמורות היטב מעכברים מתפתחים. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות יותרת המוח, כגון היסטולוגיה של יותרת המוח, התמיינות תאים, התפשטות ואפופטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח את יותרת המוח של העכברים המתפתחים ללא נזק נראה לעין ולכוון אותם כראוי להשגת חתכים עטרתיים.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו שעבור פיתוח יותרת המוח של עכברים, קשה מבחינה טכנית להשיג חתכים עטרתיים מתאימים. לאחר הרדמה ותיקון עכברים לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצם הגולגולת. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הרם בעדינות את המוח האחורי מבסיס הגולגולת.

לאחר מכן, עם הסימן הראשון של sella turcica, הפסיקו להרים אך החזיקו את המוח האחורי, והשתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את גבעול יותרת המוח וסיבי העצב המחוברים לבסיס המוח. המשך להרים ולהסיר את כל המוח כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח במלואה. בלוטת יותרת המוח מונחת על פני השטח הגביים של העצם הספנואידית ומוקפת לרוחב בעצבים טריגמינליים.

לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את כל אזור המוכר כולל בלוטת יותרת המוח, עצבים טריגמינליים לרוחב ומתחת לעצם הספנואיד. הכניסו את הטישו לצלחת 35 מ"מ המכילה 4% PFA, ודגרו אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות עד 3 שעות, תלוי בגילאים. לאחר מכן השתמש ב-10 מ"ל PBS כדי לשטוף את הרקמה הקבועה למשך חמישה שינויים ב-15 דקות כל אחד.

העבירו את הרקמה הקבועה לצלחת 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל PBS, ותחת מיקרוסקופ סטריאו, נתקו את בלוטות יותרת המוח. עבור יותרת המוח P5 עד P14, בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים מסירים את קרומי החיבור בין העצבים לעצם, ומבודדים בזהירות את בלוטת יותרת המוח יחד עם עצבים טריגמינליים לרוחב בכללותם, אך משאירים את הסלה טורציקה. עבור יותרת המוח P21 ומבוגרים, הסר את העצבים ואת קרומי החיבור סביב יותרת המוח, ושחרר את הבלוטה מהרקמות שמסביב.

לאחר התייבשות, ניקוי קסילן וחדירת שעווה המתבצעת על פי פרוטוקול הטקסט, על מערכת קונסולת הטמעת רקמות, הסר את הדגימה מהקסטה והנח אותה בתבנית בסיס מלאה למחצה בשעוות פרפין מותכת. עבור P21 ובלוטות יותרת המוח הבוגרות, השתמש במלקחיים עדינים מחוממים כדי למקם את בלוטת יותרת המוח עם הציר הקצר שלה בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס. עבור יותרת המוח P0 עד P4, כוונו את הדגימות עם עצמות הספנואיד שלהן בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס.

עבור בלוטות יותרת המוח P5 עד P14, כוונו את הדגימות עם העצבים הטריגמינליים שלהן בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס. לאחר מיקום הבלוטה, השתמש במלקחיים עדינים מחוממים כדי להחזיק בעדינות את הרקמה במצב הרצוי עד שהשעווה הופכת למוצקה למחצה על צלחת קירור. מלאו את התבנית בשעוות פרפין מותכת.

הניחו לגוש הפרפין להתקרר עד שהשעווה מתמצקת לחלוטין. מצננים את גוש הפרפין במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות, ואז השתמשו במיקרוטום כדי לחתוך אותו לפרוסות דקות, תוך כוונון עדין של מיקום גוש הפרפין במהלך החיתוך. בצע תיוג חיסוני על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן, כדי לנתח את בלוטת יותרת המוח מעכבר היילוד, כל אזור הסלר המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים הטריגמינליים והעצם הספנואידית שמתחתיו נותחו מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח הזעירה והעדינה נותרה שלמה במהלך התהליך. עבור עכברים מעל חמישה ימים, בלוטות יותרת המוח המחוברות לעצבים הטריגמינליים הצדדיים בודדו.

מבנה הגדילה של בלוטת יותרת המוח שבודד מעכבר P7 נשמר היטב. כאן, בלוטת יותרת המוח של עכבר P21 בודדה בהצלחה ללא נזק נראה לעין תוך הסרת הרקמה הסובבת אותה. באיור זה, צביעת H&E של חתכים קורונליים מכוונים כראוי מדגימה מורפולוגיה שמורה היטב הן של אדנוהיפופיזה והן של נוירוהיפופיזה בבלוטות יותרת המוח P0, P7 ו-P21.

לבסוף, השקופיות המעובדות היו תואמות גם לתיוג אימונופלואורסצנטי. כדוגמה, האדנוהיפופיזה והנוירוהיפופיזה הראו תיוג חיסוני ספציפי של GH ו-GFAP, בהתאמה. לאחר השליטה, התהליך מדיסקציה להטמעה יכול להיעשות תוך 7.5 שעות בעכברים בוגרים ואפילו פחות בעכברים צעירים יותר אם הוא מבוצע כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנתח את כל אזור המוכר כדי להימנע מנגיעה בבלוטת יותרת המוח עם כלים כירורגיים כלשהם. בעקבות הליך זה, ניתן לבודד גם את יותרת המוח שלא קידומת. במקרה כזה, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע נזק לא רצוי.

יש לנתח את הבלוטה במהירות האפשרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את בלוטות יותרת המוח של העכבר ולהכין חתכים קורונליים של יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.