Name: ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למדו שיטה לניתוח בלוטות יותרת המוח בעכברים מתפתחים והכנת פרוסות הילטיות ללא נזק. הפרוטוקול משמר את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשר חקר היסטולוגיה, התמיינות תאים ואפופטוזה בפיתוח בלוטת יותרת המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).

C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת.
 1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח <ol><li>לבצע הרדמה: במקום neonatal עכברים (P0 - P5) על קרח כתוש, כדי ליצור היפותרמיה. עבור עכברים יותר 5 ימים של גיל מבוגר, להזריק urethane 5% (30 µL/g של משקל הגוף) intraperitoneally כדי לגרום הרדמה. להעריך תגובות הזנב toe צובט. להמשיך רק לאחר העכבר אינו מגיב לגירויים יתמודד.</li>
	<li>לאבטח את העכבר במצב פרקדן (שוכבת על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי בעדינות מקליטה את forepaws ואת hindpaws על משטח העבודה כי הוא מסוגל להיות מוצמד (קרי, קלקר) בתוך ברדס fume כימי.</li>
	<li>לבצע זלוף transcardial.
	<ol><li>לחתוך את בית החזה של העכבר עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הלב (ואיברים אחרים בית החזה).</li>
		<li>לאבטח את הלב הפועם עם מלקחיים בוטה והכנס מחט 26G (0.45 מ מ) לתוך החדר השמאלי. המחט מחוברת מזרק 10 מ"ל מלא מלוחים heparinized פוספט buffered (PBS; בתוספת 5 מ"ג/מ"ל נתרן חנקיתי ו 10 הפארין U/mL, pH 7.4, לחמם עד 37 ° C לפני השימוש). מיד אטריום ימין עם מספריים בסדר גזורה להתחיל perfuse לגוף PBS חמים עד הנוזל יציאה אטריום ימין ברור. 
		הערה: משוער 5-10 mL PBS יש צורך עכברים neonatal ו- 10-20 מ ל PBS עבור עכברים בוגרים.</li>
		<li>להשאיר את המחט מקום ושנה נוספת מזרק מלא עם 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL ו- 20 מיליליטר מקבע עבור neonatal ועכבר P21, בהתאמה. 
		התראה: PFA רעיל. הוא עלול לגרום לעור גירויים הנשימה ואת העין נזק. יש ללבוש כפפות ולעבוד תחת ברדס כימי.</li>
	</ol></li> <li>לערוף את העכבר מחברים-קבוע וחתך את הגולגולת עם מספריים.
	<ol><li>הרם בעדינות את hindbrain מבסיס הגולגולת עם מלקחיים קטנים. -הסימן הראשון אשר, להפסיק להרים אך להחזיק hindbrain, חותכים את גבעול יותרת המוח, סיבי עצב התחברות לבסיס של המוח עם מספריים משובחים. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי בלוטת יותרת המוח לא יוסר משם עם המוח.</li>
		<li>לאחר מכן להרים את המוח, להסיר את זה. כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח באופן מלא. לחתוך את האזור כולו סלה כולל בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש לרוחב, ו מתחת עצם היתד עם מספריים (כ 3 x 5 מ מ 2).</li>
	</ol></li> <li>להכניס את הרקמה ביתור תבשיל 35 מ מ או אחד טוב של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל קר 4% מחברים (pH 7.4). לתקן את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות בשביל P0 - P7 pituitaries, 1h לציון P14 pituitaries, ה 1.5 עבור P21 - P28 pituitaries, ו- h 3 עבור מבוגרים pituitaries.</li>
	<li>נוסף דיסוציאציה של יותרת המוח <ol><li>לרחוץ הרקמה קבוע עם 10 מ"ל PBS, שינויים 5, 15 דקות כל אחד. בלוטת יותרת המוח neonatal יחד עם הרקמות הסובבות שלו ואת מתחת עצם היתד יעובד ישירות על התייבשות. עם זאת, צריך להיות הפומבית יותרת מן העכברים שגילן עולה על 5 ימים נוספים תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
		<li>לשים את הרקמה קבוע לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל 1 מ"ל PBS. P5 - P14 pituitaries, להסיר את הקרומים חיבור בין העצבים והעצם עם בסדר. מלקחיים ומספריים, בזהירות לבודד את בלוטת יותרת המוח יחד עם העצבים המשולש לרוחב שלם אלא עוזב את אשר. בלוטת מבודד ועצבים מחוברים באמצעות ממברנות חיבור עם &#34; H &#34;-אוהב את המראה ( איור 1B).</li>
		Pituitaries <li>עבור P21, מבוגר, להסיר את העצבים ואת ממברנות חיבור מסביב בלוטת יותרת המוח, חופשית בלוטת מן הרקמות הסובבות. עוטפים את רקמת יותרת המוח עם עדשה ניקוי נייר טישו ולשים אותו קלטת ההטבעה. 
		הערה: גלישת בלוטת יותרת המוח זעיר עם עדשה ניקוי נייר טישו מסייע למנוע אובדן פוטנציאלי של דגימות לשמר את שלמות רקמות בפרוצדורה הטבעה-פרפין הבאה. זה ייתכן שלא יהיה צורך לעטוף את בלוטת יותרת המוח אם היא מעובדת בבקבוקון קטן בהליך הטמעת הקפאה.</li>
	</ol></li></ol> 2. שעוות פרפין Embedding ו Sectioning <ol><li>מייבשים דגימות ב הטבעה קלטות עם 50%, 65%, 75% ו-95% אתנול פתרונות למשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן מייבשים עם 3 שינויים של כוהל טהור, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. מעונן חלקית עם קסילן, 3 משתנה, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. לחדור עם מותך פרפין, שינויים 3, 7 דקות כל עבור P0 - בלוטות P4, ואחריו 8 דקות פעמיים 6 דקות פעם עבור P5 ובלוטות מבוגר. 
	הערה: פרמטרים אופטימליים לעיבוד רקמות יכול להיות מדעית מותאם. כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה, יש להימנע התייבשות לא מספיקות או נגמר. הדבר נכון עבור ניקוי הרקמה באמצעות קסילן.</li>
	<li>התמצאות בעת הטבעה <ol><li>על טישו הטמעת מערכת מסוף, להסיר את הדגימה הקלטת ומקם אותה לתוך תבנית הבסיס מלא למחצה עם מותך פרפין. כיוון נכון של בלוטת יותרת המוח ההטבעה חיוני סיפוק מקטעים הילתית.</li>
		בלוטות יותרת המוח <li>עבור P21, מבוגר, מקם את בלוטת יותרת המוח עם ציר קצר בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס (המטוס סעיף). להשתמש היתד עצמות ועצבים המשולש בתור ציוני אנטומיים P0 - P4, P5 - P14 pituitaries, בהתאמה. אוריינט דגימות עם המשולש העצבים או פרופריה חציה של היתד עצמות בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס שלהם.</li>
		עם מלקחיים בסדר ומחוממת, <li>החזק בעדינות את הרקמה במיקום הרצוי עד שהשעווה הופך מוצק למחצה על צלחת קירור. למעלה למעלה את התבנית עם מותך פרפין. לאפשר לבלוק פראפין להתקרר עד השעווה לחלוטין פני השטח למוצק. 
		הערה: בלוטת יותרת המוח ביום עובריים 18.5 (E18.5) יכולים להיות מטופלים באופן זהה כמו בלוטת יותרת המוח neonatal. אבל pituitaries (ראת'קי &#39; s שקיות) יותר צעיר ממה צריך להיות מוטבע עם הראש כולו, מונחה עם הציר הסאגיטלי (מתוך הפה כדי occiput) בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס E16.5.</li>
	</ol></li> <li>להירגע לבלוק פראפין ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות ולאחר מכן לחתוך אותו לתוך דק לפרוסות (עובי 4 מיקרומטר הוא מועדף) עם מיקרוטום. כדי לקבל את המקטעים הילתית משביע רצון, לכוונן את המיקום של פרפין בלוקים במהלך חלוקתה. לטעון את הפרוסות רקמות על גבי זכוכית מצופים polylysine שקופיות כדי למנוע התנתקות של פרוסות בהליכים הבאים. 
	הערה: לחלופין, דגימות יכול להיות מיובש ב 15%, 30% (W/V) פתרונות סוכרוז (ב- PBS) ב 4 ° C עד הם שוקעים לתחתית, משובצים במתחם הטבעה-הקפאה באמצעות אותה שיטה שבה התמצאות, במהירות קפוא בקרח יבש. ואז חותכים את רקמת קפוא פרוסות של 8-10 מיקרומטר באמצעות cryostat. המורפולוגיה של הקפאה-מקטעים, עם זאת, לעיתים קרובות נחות הפרפין מקטעים.</li>
</ol> 3. H &#38; E מכתים ולקרוא Immunofluorescence <ol><li>חמים השקופיות על חום לחסום ב 55 ° C ו- dewax עם קסילן, 2 שינויים, 4 דקות כל אחד. מייבשים את הדגימות עם 95% אתנול פעמיים, 75% אתנול פעמיים, 3 דקות כל אחד. לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים למשך 5 דקות על מטרף.</li>
	<li>עבור H &#38; E מכתים, כתם בסעיפים אלום hematoxylin פתרון 6 דקות, לשטוף בשחקן פוטבול פועלing מי ברז למשך 2 דקות, להבדיל במים אמוניה 0.2% 45 s ו מחדש לשטוף במים למשך 2 דקות. לאחר מכן מייבשים הסעיפים עם אתנול 95% 1 דקות, הכתם עם אאוזין עבור 2 דק ברצף מייבשים, נקה, ואת הר-</li>
	<li>Immunofluorescence תיוג <ol><li>פנקו הסעיפים עם מתנול המכיל 3% H 2 O 2 ו- 0.01% נאן 3 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשבית peroxidases אנדוגני. לאחזר אנטיגנים על ידי הרתחה ובסעיף המאגר אחזור (EDTA 1 מ"מ ו 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4) בסיר לחץ במשך 2 דק Incubate הסעיפים באמצעות מאגר חסימה (סרום עיזים 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>דגירה מקטעים עם הארנב הורמון אנטי-גדילה (GH) נוגדנים (1:2, 000) או ארנב נוגדן anti-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) (1:2, 000) מדולל במאגר חסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>תקופת דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים (עז נגד הארנב IgG-HRP, 1:300 במאגר חסימה) של 35 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להגביר את האותות באמצעות Biotinyl Tyramide (1:50 בתוך תמיסת מלח טריס באגירה מלאה המכילה 2 O 0.3% H 2) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, והמחש עם Streptavidin-Alexa594 או 488 (1:300 בחסימה מאגר, 30 דקות, 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain הגרעינים עם דאפי (50 מ"ג/ליטר ב- PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. 
		הערה: לא יתכן צורך להגביר את האות באמצעות מערכת הגברה האות Tyramide (TSA). לחלופין, ניתן להשתמש נוגדנים משניים מצומדת פלורסצנטיות להמחיש את האות.</li>
	</ol></li> <li>רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד דאפי, טקסס ואדום, מערכות סינון FITC, × 4/0.13 כדי × 40/0.75 יעדים, 5.0 מגה פיקסל מצלמה. השתמש ה-360, 488, 594 ננומטר לייזר אורכי גל עבור הדמיה דאפי, אלקסה 488 - ומקטעי שהוכתמו 594 אלקסה, בהתאמה. למטב את עוצמת הלייזר (0.8 היה משמש בדרך כלל), זמן החשיפה לרמות הרצויות לכל ערוץ. ללכוד את התמונה תחת השליטה של תמונה רכישת תוכנה, כיסוי הדימויים פלורסצנטיות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה-</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12. למרות המקטע מאמצע-הווריד של יותרת המוח הוא גם מסוגל להראות את הקדמי, ביניים, אונות האחורי בפרוסה אחת, המקטע הילתית מועדף מאוד מכיוון שהוא מאפשר להציג תצוגה המרבי של אלה ...

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ' שני-in-one"הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת'קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.
בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ"ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ"מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ"מ P0.
מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

<table><tbody><tr><td><חזקים>כלים/ציוד</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים-ישר</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td> ניתן <td>לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מספריים משובחים-סטרינגט</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>מלקחיים קהים</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>לבידוד של יותרת המוח</td></tr><tr><td>מחט 26G (0.45 מ"מ)</td><td>HongDa</td><td></td><td>למזרק זלוף דרך הלב</td></tr><tr><td>(1 מ"ל)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מזרק (10 מ"ל)</td><td>BD</td><td></td><td>מספקים אחרים ניתן לרכוש</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש נייר לניקוי עדשות</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מיקרוסקופ אנטומי</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש קלטת<td>הטמעה</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מערכת קונסולת הטמעת רקמות</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש שקופיות Superfrost-Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש<td>זכוכית כיסוי</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש<td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>מספקים אחרים</td></tr> חזק<tr><td><>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוריתן</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>עבור PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>עבור PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>עבור PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>עבור PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת נתרן הפרין</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>לזלוף</td></tr><tr><td>מלח Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>תרמו פישר</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>סיגמא</td><td>H9627</td><td>עבור H& E מכתים</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>עבור H& </td></tr><tr><td>הורמון אנטי גדילה של ארנב מכתים E (GH)</td> <td>הורמון</td><td></td> לאומי <td>לנוגדנים צביעה חיסונית</td></tr><tr><td></td> תוכנית <td></td><td></td><td>יותרת המוח</td></tr><tr><td>ארנב נגד עכבר נוגדן GFAP</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>נגד ארנב עיזים IgG, HRP</td><td>ג'קסון</td><td>111-035-003</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>מערכת TSA</td><td>NEN מוצרי מדעי החיים</td><td>NEL700</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>סטרפטווידין, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr></tbody></table>

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.

פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א'). בלוטות יותרת המוח קשורה העצבים המשולש לרוחב עכברים שגילן עולה על 5 ימים, היו אז מבודד. המבנה ברוטו של בלוטת יותרת המוח מבודד את P7 העכבר השתמר היטב (איור 1B). עבור העכבר P21, בגודל של בלוטת יותר...

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג חתכים תקינים של יותרת המוח עם ארכיטקטורות רקמות שמורות היטב מעכברים מתפתחים. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות יותרת המוח, כגון היסטולוגיה של יותרת המוח, התמיינות תאים, התפשטות ואפופטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח את יותרת המוח של העכברים המתפתחים ללא נזק נראה לעין ולכוון אותם כראוי להשגת חתכים עטרתיים.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו שעבור פיתוח יותרת המוח של עכברים, קשה מבחינה טכנית להשיג חתכים עטרתיים מתאימים. לאחר הרדמה ותיקון עכברים לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש במספריים כדי לחתוך את עצם הגולגולת. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הרם בעדינות את המוח האחורי מבסיס הגולגולת.לאחר מכן, עם הסימן הראשון של sella turcica, הפסיקו להרים אך החזיקו את המוח האחורי, והשתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את גבעול יותרת המוח וסיבי העצב המחוברים לבסיס המוח. המשך להרים ולהסיר את כל המוח כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח במלואה. בלוטת יותרת המוח מונחת על פני השטח הגביים של העצם הספנואידית ומוקפת לרוחב בעצבים טריגמינליים.לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את כל אזור המוכר כולל בלוטת יותרת המוח, עצבים טריגמינליים לרוחב ומתחת לעצם הספנואיד. הכניסו את הטישו לצלחת 35 מ"מ המכילה 4% PFA, ודגרו אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות עד 3 שעות, תלוי בגילאים. לאחר מכן השתמש ב-10 מ"ל PBS כדי לשטוף את הרקמה הקבועה למשך חמישה שינויים ב-15 דקות כל אחד.העבירו את הרקמה הקבועה לצלחת 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל PBS, ותחת מיקרוסקופ סטריאו, נתקו את בלוטות יותרת המוח. עבור יותרת המוח P5 עד P14, בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים מסירים את קרומי החיבור בין העצבים לעצם, ומבודדים בזהירות את בלוטת יותרת המוח יחד עם עצבים טריגמינליים לרוחב בכללותם, אך משאירים את הסלה טורציקה. עבור יותרת המוח P21 ומבוגרים, הסר את העצבים ואת קרומי החיבור סביב יותרת המוח, ושחרר את הבלוטה מהרקמות שמסביב.לאחר התייבשות, ניקוי קסילן וחדירת שעווה המתבצעת על פי פרוטוקול הטקסט, על מערכת קונסולת הטמעת רקמות, הסר את הדגימה מהקסטה והנח אותה בתבנית בסיס מלאה למחצה בשעוות פרפין מותכת. עבור P21 ובלוטות יותרת המוח הבוגרות, השתמש במלקחיים עדינים מחוממים כדי למקם את בלוטת יותרת המוח עם הציר הקצר שלה בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס. עבור יותרת המוח P0 עד P4, כוונו את הדגימות עם עצמות הספנואיד שלהן בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס.עבור בלוטות יותרת המוח P5 עד P14, כוונו את הדגימות עם העצבים הטריגמינליים שלהן בניצב למשטח התחתון של תבנית בסיס. לאחר מיקום הבלוטה, השתמש במלקחיים עדינים מחוממים כדי להחזיק בעדינות את הרקמה במצב הרצוי עד שהשעווה הופכת למוצקה למחצה על צלחת קירור. מלאו את התבנית בשעוות פרפין מותכת.הניחו לגוש הפרפין להתקרר עד שהשעווה מתמצקת לחלוטין. מצננים את גוש הפרפין במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות, ואז השתמשו במיקרוטום כדי לחתוך אותו לפרוסות דקות, תוך כוונון עדין של מיקום גוש הפרפין במהלך החיתוך. בצע תיוג חיסוני על פי פרוטוקול הטקסט.כפי שמוצג כאן, כדי לנתח את בלוטת יותרת המוח מעכבר היילוד, כל אזור הסלר המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים הטריגמינליים והעצם הספנואידית שמתחתיו נותחו מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח הזעירה והעדינה נותרה שלמה במהלך התהליך. עבור עכברים מעל חמישה ימים, בלוטות יותרת המוח המחוברות לעצבים הטריגמינליים הצדדיים בודדו.מבנה הגדילה של בלוטת יותרת המוח שבודד מעכבר P7 נשמר היטב. כאן, בלוטת יותרת המוח של עכבר P21 בודדה בהצלחה ללא נזק נראה לעין תוך הסרת הרקמה הסובבת אותה. באיור זה, צביעת H&E של חתכים קורונליים מכוונים כראוי מדגימה מורפולוגיה שמורה היטב הן של אדנוהיפופיזה והן של נוירוהיפופיזה בבלוטות יותרת המוח P0, P7 ו-P21.לבסוף, השקופיות המעובדות היו תואמות גם לתיוג אימונופלואורסצנטי. כדוגמה, האדנוהיפופיזה והנוירוהיפופיזה הראו תיוג חיסוני ספציפי של GH ו-GFAP, בהתאמה. לאחר השליטה, התהליך מדיסקציה להטמעה יכול להיעשות תוך 7.5 שעות בעכברים בוגרים ואפילו פחות בעכברים צעירים יותר אם הוא מבוצע כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנתח את כל אזור המוכר כדי להימנע מנגיעה בבלוטת יותרת המוח עם כלים כירורגיים כלשהם. בעקבות הליך זה, ניתן לבודד גם את יותרת המוח שלא קידומת. במקרה כזה, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע נזק לא רצוי.יש לנתח את הבלוטה במהירות האפשרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את בלוטות יותרת המוח של העכבר ולהכין חתכים קורונליים של יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

הסרטון מדגים הכנת פרוסות מוח קוליקולו-תלמוקורטיקליות ממוחות של גורי עכברים. מוח מבודד מיושר על שקופית מסומנת ונחתך בזווית כדי ליישר את המוח התיכון השמיעתי ואת המוח הקדמי באותו מישור. לאחר מכן חותכים את המוח באמצעות ויברטום, והפרוסות המכילות את מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים העיקריים מועברות לתא אחיזה לשימור.

הכנת פרוסות קוליקולו-תלמוקורטיקליות ממוח גור עכבר

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

סוגים רבים של גידולי מוח אנושיים ממוקמים באזורים ספציפיים במוח וקשה לגדל אותם בתרבית. פרוטוקול זה מתייחס לתפקיד המיקרו-סביבה של הגידול וחוקר טיפולים תרופתיים חדשים על ידי ניתוח תאי גידול מוח ראשוניים פלואורסצנטיים הגדלים בפרוסת מוח אורגנוטיפית של עכבר.

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

במאמר זה, אנו מתארים, בפרוטרוט, פרוטוקול עבור הדור של תרבויות נוירוספירה מתאי גזע העכבר הפוסט-לידתיים נגזר של נישות הראשי נוירוגניים העכבר. הנוירוספירות משמשות לזיהוי תאי גזע עצביים מרקמת מוח המאפשרים הערכה של מספרי תאים מקודמי. יתר על כן, אלה מבנים תלת-ממדיים יכול להיות מצופה בתנאים הדיפרנציאל, הענקת הנוירונים, oligodendrocytes הפוך ו astrocytes, המאפשר לימוד של הגורל התא.

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית של הגוף. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של organoids מן בלוטת יותרת המוח העכבר כמו מודל הפריה חוץ גופית 3D רומן לחקור את אוכלוסיית תאי הגזע של הבלוטה אשר הביולוגיה והתפקוד נשארים מובנים היטב.

פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח

למדו שיטה לניתוח בלוטות יותרת המוח בעכברים מתפתחים והכנת פרוסות הילטיות ללא נזק. הפרוטוקול משמר את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשר חקר היסטולוגיה, התמיינות תאים ואפופטוזה בפיתוח בלוטת יותרת המוח.

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

גלה סרטונים נוספים