התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי
3 בדצמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור אבות בין-נוירונים קליפת המוח במבשרי אינטרנוירונים פוסט-מיטוטיים לתאי גזע עובריים של עכברים באמצעות שיטת גוף עוברי שונה לחד-שכבתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד תת-סוגים של אינטרנוירונים בקליפת המוח משיגים את גורלם האישי במהלך ההתפתחות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור יעיל של אבות בין-נוירוניים המבטאים Nkx2.1, כמו גם שיטות להעשרה עבור תת-קבוצות בין-עצביות של פרוואלבומין או סומטוסטטין.
כדי להתחיל בהליך זה, צלח תאי הזנה MEF לא פעילים מיטוטית במדיה MEF על צלחות שטופלו בתרבית רקמות. אפשר להם לפחות 12 שעות להתיישב באינקובטור תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי ה-mESCs. אם לא נעשה בו שימוש מיידי, החלף את מדיית MEF כל שלושה ימים.
לאחר מכן, הוסף mESCs המכילים גורם מעכב לוקמיה של עכברים ללוחות MEF. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. מעבר mESCs באמצעות טריפסין-EDTA ברגע שהצלחת הופכת ל-70 עד 80% מתכנסת, ושמור על ה-mESCs על שכבת הזנה MEF במדיית mESC כדי לשמור על פלוריפוטנטיות.
לפני תחילת ההתמיינות, העבירו את התאים לפחות פעם אחת על צלחות מצופות ג'לטין ללא MEFs כדי לדלל אותם. לשם כך, הכינו צלחות מצופות ג'לטין על ידי הוספת 0.1% ג'לטין ו-PBS עם סידן ומגנזיום לכלי שטופל בתרבית רקמות ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. צלח 1.5 עד פעמיים 10 עד התאים השישיים בכל צלחת של עשרה סנטימטרים ואפשר להם להתרחב במשך יומיים לפני תחילת ההתמיינות.
ב-DD0, לאחר שה-mESCs גדלו על הלוחות המצופים בג'לטין במשך יומיים, שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הוסף מספיק טריפסין-EDTA כדי לכסות את פני הצלחות. והחזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות.
לאחר ארבע דקות, יש להרוות את טריפסין-EDTA באמצעות פי שניים מנפח מדיית mESC. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה בגודל מתאים, וצנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הצינור ושאף את המדיה מבלי להפריע לגלולה.
השהה מחדש את הגלולה במיליטר אחד של מדיית KSR-N2. לאחר מכן, מדוד את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר, או מונה תאים אוטומטי. התחל לגדל את התאים כגופים עובריים על ידי הוספת 75,000 תאים למיליטר במדיה KSR-N2 בכלי תרבית הרקמה שאינם נדבקים.
ולדגור אותם ב-37 מעלות צלזיוס. ב-DD1, התכוננו לנחיתת תאים על ידי ציפוי הכלים שטופלו בתרבית רקמה בפולי-L-ליזין למשך שעה לפחות או לילה ב-37 מעלות צלזיוס. ב-DD2 יש לשאוב את הפולי-L-ליזין ולצפות את הצלחות בלמינין למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
ב-DD3, לפני תחילת דיסוציאציה של EB, יש לשאוב למינין ולאפשר לצלחות להתייבש לחלוטין במכסה מנוע של תרבית רקמות. לאחר מכן, העבירו את ה-EB עם המדיה לתוך צינור של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה למשך שלוש עד ארבע דקות ב-15 פעמים גרם או עד שה-EB התפוצץ. שאפו את המדיה, והוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים המכילה DNase.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש להזיז בעדינות את השפופרת כל שלוש דקות כדי לסייע בדיסוציאציה של EB. לאחר שה-EB כבר לא נראה, או שחלפו 15 דקות, הוסף שישה מיליליטר של KSR-N2 המכיל DNase, וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 כפול גרם.
לאחר מכן, צלחו את התאים ב-KSR-N2 המכילים LDN193189, XAV939 ומעכב ROCK, Y27632, ב-4.5 עד חמש פעמים עשרה עד הרביעי תאים לסנטימטר בריבוע. ב-DD5, החלף מדיה עם KSR-N2 המכיל FGF2, IGF1 ו-SSH. לאחר מכן, הכינו צלחות תרבית רקמות לציפוי מחדש ביום 8, באמצעות ההוראות המפורטות בנהלים על DD1 ו-DD2.
ב-DD7, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל FGF2, IGF1 ו-SHH. ב-DD8, צלחו מחדש את התאים על ידי ניתוקם מהצלחות עם טריפסין-EDTA למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. להרוות את trypsin-EDTA באמצעות פי שניים מהנפח שלו עם KSR-N2.
וצנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות. סנן את התאים דרך צינור סינון 40 מיקרון כדי להסיר גושים. לאחר מכן, צבחו מחדש את התאים ב-250,000 תאים לסנטימטר בריבוע ב-N2-KSR המכילים FGF2, IGF1 ו-Y27632 עם SHH.
ב-DD10, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל SHH. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ללא סידן ומגנזיום, והוסיפו לתאים מגיב דיסוציאציה של תאים מחומם מראש, שאינו מכיל טריפסין, המכיל DNase. הכניסו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות, או עד שהתאים מתנתקים.
לאחר מכן, הקש בעדינות על הצלחות כל חמש דקות כדי לסייע לדיסוציאציה. ב-DD5, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל FGF2 ו-IGF1. לאחר מכן, הכינו לוחות תרבית רקמות לציפוי מחדש על DD8.
ב-DD7, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל FGF2 ו-IGF1. ב-DD8, יש לצבוע מחדש את התאים עם אגוניסט מוחלק ולהוסיף מעכב PKC לא טיפוסי. ב-DD10, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל aPKCi.
ב-DD11, נתק את התאים מהלוחות עבור FACS. אם התאים לא נותקו עבור FACS ב-DD11, החלף מדיה ב-DD12 עם KSR-N2 המכיל aPKCi. ב-DD14, שנה את המדיה עם KSR-N2 המכיל aPKCi.
וב-DD16, החלף את המדיה עם KSR-N2 המכיל aPKCi. לאחר מכן, ב-DD17, אסוף את התאים החיוביים Nkx-2.1:mCherry . מוצגות כאן התמונות המייצגות של צביעה חיסונית עבור Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry ו-Lhx6:GFP מתרבית התמיינות של יום 12.
שימו לב שתמונות אלה הן ערוצים חופפים מאותו שדה ראייה. גרף זה מציג את כימות האחוז הממוצע של גרעינים חיוביים DAPI המבטאים Nkx2.1 ב-DD12 בתרבית. וזוהי תרשים מייצג של FACS, המדגים את ארבע אוכלוסיות התאים השונות שניתן לבודד באמצעות קו mESC המדווח הכפול שלנו.
שימו לב ש-mCherry נמצא על ציר ה-x, ו-GFP נמצא על ציר ה-y. לפיכך, התיבה הימנית העליונה מייצגת תאים שהם mCherry-GFP חיובי כפול. להלן מהלך הזמן של אינדוקציה Nkx2.1:mCherry ו-Lhx6:GFP מ-DD6 עד 16, מבוטא כאחוז התאים בתרבית שהם מבטאים רק mCherry , מבטאים GFP בלבד או mCherry-GFP מבטאים במשותף
.לאחר השליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך 17 יום מתחילתו ועד סופו, אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד להתחיל עם תאי גזע פלוריפוטנטיים, לא ממוינים ובריאים למראה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו השתלה לניאו-קורטקס של ילודים או עכברים בוגרים על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לקביעת גורל בין-נוירולוגי או השפעת השתלת אינטרנוירון על תפקוד המעגל והתנהגות בעלי חיים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים לחקור גורמים המניעים את קביעת גורל האינטרנוירונים בעכברים, ובהרחבה, בחולים המושפעים מהפרעות הקשורות לאינטרנוירונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפיק אבות מבטאים Nkx2.1, ואת צאצאיהם הפוסט-מיטוטיים מתאי גזע עובריים של עכברים. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור מבשרי אינטרנוירונים קליפתיים ומבשרים פוסט-מיטוטיים של אינטרנוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר באמצעות שיטת גוף עוברי-מונושכב משולבת. טכניקה זו מאפשרת יצירה יעילה של מבשרי אינטרנוירונים המבטאים Nkx2.1 לחקר קביעת גורל ויישום טיפולי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- מחקר תאי גזע
רקע
- אינטרנוירונים קליפתיים ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד המוח.
- הבנת התפתחותם יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
- שיטה זו מאפשרת את חקר קביעת הגורל של אינטרנוירונים.
- היא יכולה גם לאפשר העשרה של תת-סוגים ספציפיים של אינטרנוירונים.
מטרת המחקר
- ליצור מבשרי אינטרנוירונים קליפתיים מתאי גזע עובריים של עכבר.
- לחקור את מסלולי ההתפתחות של אינטרנוירונים קליפתיים.
- לחקור יישום טיפולי פוטנציאלי של מבשרים אלו.
שיטות ששימשו
- שיטת גוף עוברי-מונושכב משולבת.
- שימוש בתאי הזנה MEF לא מיטוטיים.
- טכניקות תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס.
- מיון פלואורסצנטי של מבשרי אינטרנוירונים.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של מבשרי אינטרנוירונים קליפתיים.
- העשרה יעילה של תת-קבוצות אינטרנוירונים של פרבלבומין וסומטוסטטין.
- תובנות לגבי קביעת גורל של אינטרנוירונים קליפתיים.
- פוטנציאל ליישום טיפולי במדעי המוח.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה אמינה ליצירת מבשרי אינטרנוירונים.
- היא משפרת את הבנתנו את התפתחות האינטרנוירונים הקליפתיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הממצאים הללו להתקדמות טיפולית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient derivation of cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells enables systematic investigation of interneuron fate determination and supports scalable production of defined neuronal subtypes. This capability is critical for de-risking early neurodevelopmental targets and establishing robust in vitro models for disease-relevant mechanistic studies. The approach facilitates portfolio decisions by providing reproducible access to functionally distinct interneuron populations for downstream screening and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of interneuron lineage specification and fate determination mechanisms.
- Supports biological de-risking by generating Nkx2.1-expressing progenitors and post-mitotic interneuron subtypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorder research.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of defined interneuron subgroups for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of differentiation efficiency and marker expression via FACS and immunostaining.
- Supports scalable preparation of PV and SST interneuron-enriched populations for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling by generating interneuron populations implicated in neuropsychiatric disorders.
- Enables continuity from in vitro differentiation to in vivo transplantation studies for functional integration analysis.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic strategies targeting interneuron dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical model development, supporting both mechanistic studies and translational applications.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on interneuron fate and molecular drivers of differentiation.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for evaluating differentiation protocols and compound effects.
- Analytics: Enables robust measurement of marker expression and population purity using FACS and immunostaining.
- Translational Research: Bridges in vitro differentiation with in vivo transplantation for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating interneuron subtypes across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in interneuron-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes differentiation and enrichment protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for interneuron-focused programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and FACS-based cell sorting.
- Demands access to specialized instrumentation for fluorescence imaging and flow cytometry.
- Necessitates cross-team standardization of differentiation and enrichment protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different stem cell lines or species-specific models.
- Dependent on maintenance of pluripotency and health of starting mESC populations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Culturing mESCs
2:14
Differentiation mESCs Toward MGE-like Telencephalic Progenitors
4:57
Somatostatin-enriching Protocol: "DD12 GFP High Sonic Hedgehog (SHH)"
6:36
PV-enriching Protocol: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"
7:53
Generation of Nkx2.1::mCherry and Lhx6::GFP Interneuron Precursors
9:11
Conclusion
