בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור חלוקת תאי יונקים ואינטראקציות מטריצת תאים בסביבה תלת מימדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת גישה יעילה וכללית לחקר חלוקת תאי יונקים ואינטראקציות מטריצת תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא כגון הבסיס המולקולרי של התפתחות רקמה תקינה ורקמה חולה.

יום לפני הטרנספקציה, צלח חמישה מיליון תאי T HEK-293 בצלחת תרבית תאים של 100 מיליליטר ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים רגיל. דגרו על תאים אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת רגע לפני תחילת הטרנספקציה, הסר בקבוקון של מגיב הטרנספקציה מארבע מעלות צלזיוס והשאיר אותו בחוץ כדי להגיע לטמפרטורת החדר.

ואז כדי להתחיל, הוסף מיליליטר אחד של מדיום סרום מופחת לצינור מיקרופוגה סטרילי. לכך, הוסף כמויות מוגדרות של פלסמידים וקטוריים לנטי-ויראלים המשמשים לטרנספקציה וערבב על ידי פיפטינג. דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, הוסף 48 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה לתוך צינור זה וערבב בעדינות על ידי פיפטינג. לאחר מכן, דגרו תערובת זו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות. לאחר השלמת הדגירה, הסר את הצלחת עם תאי T HEK-293 מהחממה.

הוסף את תערובת ריאגנט טרנספקציית ה-DNA המוכנה טיפה חכמה על התאים וסובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד בצלחת. הנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור. כשש שעות לאחר הטרנספקציה, הסר את הצלחת ושאף את המדיום.

מוסיפים 10 מיליליטר מדיום תרבות טרי ומעבירים את הצלחת חזרה לחממה. בנקודות זמן מרובות, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה, קצרו את מדיום התרבית המכיל את החלקיקים הלנטי-ויראליים בצינורות נפרדים. לאחר מכן, סנן את מדיום התרבות שנקטף דרך פילטר סטרילי של 0.45 מיקרון כדי להסיר פסולת סלולרית.

החלף במדיום תרבית טרי לאחר כל קציר. התסנין המכיל את החלקיקים הלנטי-ויראלים יכול לשמש להתמרה מיידית או ניתן לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. צלחת תאי קרצינומה של השד האנושי MDA-MB-231 בצלחת תרבית של 35 מילימטר במדיום תרבית רגיל.

דגרו על תאים אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, שאפו את מדיום התרבות מהצלחת והוסיפו מיליליטר אחד של חלקיקי ה-lentiviral יחד עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי. דגרו על התאים בחממה למשך כ -16 שעות.

לאחר השלמת הדגירה עם חלקיקים נגיפיים, הסר את הצלחת כדי לשאוב את המדיום. לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר מדיום טרי ומעבירים חזרה לחממה למשך 24 עד 72 שעות. בדוק את הביטוי של H2B-mCherry בתאים המומרים הללו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

כדי להתחיל בניסויי הסנכרון, צלחת ראשונה תאי MDA-MB-231 המבטאים H2B-mCherry במפגש של 50 עד 60% בצלחת של 24 בארות. דגרו את התרבית בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. למחרת, החלף את מדיום התרבות ב 0.5 מיליליטר של מדיום המכיל שני תימידין מילימולרי.

השאירו את הצלחת בחממה למשך 24 שעות. לאחר השלמת הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כדי לשחרר אותם מהטיפול בתימידין. לאחר מכן השאירו את התאים ב 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית רגיל למשך חמש שעות בחממה.

לאחר מכן, כדי לחסום תאים אלה במיטוזה, הוסף נוקודזול למדיום התרבית. השאירו את התאים בחממה למשך 12 שעות. לאחר השלמת הטיפול בנוקודזול, הוציאו את הצלחת ובעזרת שייקר אורביטלי, נערו את התאים למשך 45 שניות עד דקה כדי לשחרר תאים מיטוטיים.

לאחר מכן, העבירו את המדיום המכיל את התאים המיטוטיים שחולצו לצינור צנטריפוגה חדש. לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר מדיום טרי לכל באר. לאחר מכן, חזור על ניעור וחילוץ התאים פעמיים נוספות.

אסוף את סך המדיום שנאסף ולאחר מכן צנטריפוגה אותו כדי לגלול את התאים המיטוטיים. לאחר הסיבוב, השעו מחדש את כדור התא ב-0.25 מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרי. בעזרת המוציטומטר, ספרו את מספר התאים.

בתחילת שלב זה, הכינו 50 מיליליטר של תמיסת DMEM פי 10 וסננו אותו. לאחר מכן, קבע את הנפחים של כל הרכיבים שישמשו לייצור מטריצת הקולגן התלת מימדית כמפורט בפרוטוקול הטקסט. צננו מראש את כל המרכיבים הללו על קרח כדי להאט את הג'לציה של הקולגן.

כעת, לצינור צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר, הוסף את מספר התאים הנדרש במדיום ואז 10x DMEM, FBS, מים נטולי יונים, קולגן ולבסוף נתרן הידרוקסיד. מערבבים בזהירות בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר שהתמיסה מעורבבת היטב, מוסיפים 500 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת 24 הבארות.

מניחים את צלחת 24 הבארות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, הוציאו את הצלחת והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שחומם מראש על גבי הג'ל. לפני ההדמיה, הפעל את יחידות התאים החיים של ניגודיות הפאזה והמיקרוסקופים הקונפוקליים.

כדי ללכוד תאים מתחלקים, הנח את צלחת 24 הבארות המכילה את התאים המשובצים במטריצות קולגן לתוך יחידת התא החי של מיקרוסקופ הקרינה. באמצעות המטרה פי 10, מצא את החלק התחתון של הצלחת ולאחר מכן הזז אותה למעלה עד שהמיקרוסקופ יתמקד בכ-500 מיקרומטר מתחתית הצלחת. הזיזו את השלב כדי למצוא תאים בשלבים שונים של מיטוזה ובחרו מספר מיקומים להדמיה.

הגדר את ניסוי קיטועי הזמן עם מרווחים של שתי דקות. לאחר מכן, כדי לצלם את רשת הקולגן, הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי כך שילכוד רק אור מוחזר מהלייזר של 488 ננומטר. לאחר מכן הנח את הצלחת המכילה תאים במטריצות קולגן ליחידת התא החי של מיקרוסקופ זה.

מצא את החלק התחתון של הצלחת ולאחר מכן הזז את עדשת האובייקט כלפי מעלה עד שהיא מתמקדת בכ-100 מיקרומטר מתחתית הצלחת. הזז את הבמה כדי למצוא תאים ולבחור מיקומים מרובים להדמיה. הגדר את ניסוי קיטועי הזמן עם מרווחים של חמש דקות.

תמונות פלואורסצנטיות של תא H2B-mCherry מתחלק המבטא MDA-MB-231 המוטבע במטריצת קולגן מוצגות כאן. שלבים שונים של מיטוזה נצפים בקלות כצפוי. התפלגות סיבי הקולגן בלבן המומחשת בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונפוקלי משתנה מעט מאוד במהלך המיטוזה.

שלב G2-M מסונכרן בין התאים ומשובץ במטריצת קולגן השלים את חלוקת התאים בשעתיים הראשונות בזמן שתאי בקרה אסינכרוניים מתחלקים באופן אקראי. כימות התפלגות סיבי הקולגן במהלך השלבים הבין-פאזיים והמיטוטיים מצביע על כך שעיוות המטריצה הוא מינימלי במהלך חלוקת התאים וגבוה יותר בתאים בין-פאזיים. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבעה ימים, החל מיצירת קו התאים היציב ועד לניתוח חלוקת תאי הווידאו במטריצה תלת מימדית.

לאחר צפייה בסרטון זה, יש לקוות שיש לך הבנה טובה כיצד לסנכרן ולנטר חלוקת תאי יונקים במטריצות תלת מימד באמצעות הדמיית תאים חיים וכיצד לקבוע עיוות מטריצה באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונפוקלי וטכניקות ניתוח הדמיה כמותית.