השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש במיקרוסקופיה מהדור ההרמוני השני כדי להמחיש ולמדוד את אפקט הקישור הצולב של הקולגן ברקמת הסקלר כפי שהוא מושרה על ידי הזרקת חומר משחרר פורמלדהיד על ידי תת-טנון, וכפי שאושר עם קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הצלבת רקמות טיפוליות על ידי מתן שיטה לא פולשנית להערכת השפעות הצלבה המושרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאותות הנוצרים בהרמוניה שנייה הם ספציפיים מאוד לסיבי קולאז', וככאלה, אין צורך בהכנת רקמות מיוחדת, כגון צביעת נוגדנים.

עלה לנו לראשונה הרעיון לשיטה זו כאשר קראנו על ההליך המיושם על קישור רקמת קרנית טיפולית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שמיקרוסקופיה מוצלחת של דור הרמוני שני דורשת מיקום זהיר של הרקמה וקביעת תנאי הדמיה נכונים כדי למנוע נזק לרקמות וחפצים במדידת אותות. התחל את הטיפול בהזרקת תת-טנון בגלגלי העיניים של הארנב כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הראה כאן ייצוג סכמטי של אתר ההזרקה של תת-הטנון. בחר ספקולום בגודל אופטימלי בהתאם לגודל העין. לאחר שלוש וחצי שעות של דגירה, יש למשוך את העפעפיים באמצעות ספקולום העפעפיים כדי לייעל את הגישה לגלובוס.

הפרד את הלחמית המקיפה את הלימבוס וחתך את שרירי העיניים הנוספים באתרי ההחדרה הסקלרלית שלהם. חותכים את החלק העליון של הסקלרה בעזרת מספריים או להב ליצירת שטח של סנטימטר אחד עם אתר ההזרקה הממוקם במרכז. מגרדים את שכבות הרשתית והכורואיד הנותרות ושוטפים פעמיים עם PBS טרי, בכל פעם משאירים את החלקים בתמיסה למשך כ-10 שניות.

הנח את הרקמה בצינורות מיליליטר מלאים בתמיסת PBS להובלה למתקן ההדמיה. כדי למקסם את האות והרזולוציה בעת ביצוע מיקרוסקופ SHG, השתמש בעדשה אובייקטיבית המותאמת להעברת אור אינפרא אדום, ועם צמצם מספרי גבוה. כוונן את צווארון התיקון של העדשה כך שיתאים לעומק הדגימה.

במקרה זה, 0.17 מילימטרים. התקן את עדשת האובייקטיביות פי 25 על המיקרוסקופ והוסף כמות נדיבה של ג'ל טבילה על בסיס מים כדי לכסות את פני העדשה. חשוב לבצע את הדמיית הרקמה תוך 30 דקות מהרכבת הדגימה על המיקרוסקופ על מנת לשמור על לחות הרקמה ולמנוע ייבוש של ג'ל הטבילה בין אובייקט העדשה לשקופית, מכיוון שזה יגרום לשינויים באות ה-SHG.

הרכיבו את תא התא על ידי הנחת החלקת כיסוי עגולה של 25 מילימטר על החלק התחתון של החדר. הניחו את פיסת רקמת הסקלרה על החלקת הכיסוי והוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטר חיץ. מכסים את הרקמה בהחלקת כיסוי עגולה שנייה ומבריגים את החלק העליון של החדר מבלי ללחוץ או לשטח את הרקמה.

לאחר מכן, הרכיב את תא התא עם דגימת הרקמה על שלב המיקרוסקופ. מקם את ה-stage והתאם את גובה המטרה כך שהמשטח התחתון של הדגימה יהיה בפוקוס כפי שנקבע על ידי בדיקת שדה בהיר דרך חתיכת העין. כבה את כל האורות מלבד צג המחשב, וחסום כמה שיותר אור מהצג עם יריעות נייר אלומיניום עטופות על במת המיקרוסקופ.

בתוכנה, כבה את מצב יציאת העין. בלוח TI Pad, בדוק שהגדרת העדשה נכונה. בלוח ממשק המשתמש הגרפי הקומפקטי A1, בחר את לייזר האינפרא אדום להדמיה, בחר את הגלאים שאינם סרוקים ובחר את ערוץ ה-DAPI המצויד במסנן מעבר פס של 400 עד 450 ננומטר.

בלוח ממשק המשתמש הגרפי A1 Multi Photon, הגדר את אורך הגל של לייזר האינפרא אדום ל-860 ננומטר ופתח את התריס. המתן עד שאורך גל הפליטה ישתנה כפי שמצוין על ידי האור הירוק הקבוע. כדי להגדיר את תנאי סריקת הלייזר בחלונית ממשק המשתמש הגרפי הקומפקטי בגודל A1, בחר סורק Galvano, סריקה כיוונית יחידה, גודל מסגרת של 1024 על 1024 פיקסלים, זמן השתהות פיקסלים של 6.2 מיקרו-שניות וממוצע קו של פי 2.

לאחר מכן, הפעל דמיון חי עם מצב החיפוש, והגדר את תנאי הדמיון בלוח ממשק המשתמש הגרפי הקומפקטי של AI על ידי התאמת עוצמת הלייזר ורווח הגלאי. הגדר את הספק הלייזר בין 50 מילי-וואט ל-150 מילי-וואט, כלומר בין שני אחוזים לשישה אחוזים עבור לייזר ב-860 ננומטר. מעל טווח זה יכול להתרחש נזק לרקמות.

פתח את חלונית טבלת החיפוש המציגה היסטוגרמה של ערכי עוצמת הפיקסלים בתמונה הנוכחית, והתאם עוד יותר את ההגבר של הגלאי בסרגל המסומן ב-HV כדי למקסם את טווח ערכי הפיקסלים תוך הימנעות מרוויה. השתמש בדגימה עם אות ה-SHG הגבוה ביותר כדי למצוא הגדרות לייזר ורווח אופטימליות. שמור על הגדרות זהות עבור כל הדגימות להשוואה בניסוי אחד.

תרגול זה מבטיח שאף דגימה בניסוי לא תרוויח את הגלאי. כדי לסרוק את הרקמה במצב תצוגה מקדימה, פתח את כלי הסקירה XYZ. הגדר את ההדמיה לרזולוציה נמוכה יותר כדי להאיץ את רכישת התמונות במצב זה.

בחלונית הסקירה הכללית של XYZ, לחץ לחיצה ימנית על המיקום הנוכחי ובחר סרוק חמש על חמש, שלוש על שלוש או לכידת תצוגה בודדת. לאחר סיום הסריקה, עבור למיקום חדש על-ידי לחיצה כפולה על אזור מחוץ לאזור הנוכחי בתצוגה מקדימה. הפעל את מצב הסריקה החיה, ולאחר מכן הבא את הרקמה למיקוד מכיוון שאזורים שונים של הרקמה יכולים להיות במיקומים שונים במקצת בכיוון הצירי.

לכוד שדה ראייה חדש של חמש על חמש, שלושה על שלושה או שדה ראייה יחיד. חזור על תהליך זה עד לתצוגה מקדימה של אזור גדול של הרקמה. בכלי הסקירה XYZ, לחצו פעמיים על מיקום שבו סיבי הקולגן נראים בכל שדה הראייה כדי להזיז את הבמה למיקום הספציפי הזה.

הגדר את ההדמיה לרזולוציה גבוהה, 1024 על 1024 פיקסלים וממוצע קווים פי 2. הפעל את מצב Live Find, כוונן את מיקום המטרה כך שהמישור התחתון יהיה בפוקוס, וב-TI Pad, השתמש ב-Z Drive כדי להזיז את המישור האופטי 10 מיקרומטר מעל שכבה תחתונה זו. רכוש תמונה באמצעות כפתור הלכידה, שמור את המיקום עם כפתור הפלוס בכלי הסקירה XYZ.

לחץ פעמיים על מיקום חדש וחזור על התאמת העומק ותהליך לכידת התמונה. עבור כל פיסת רקמה, צלמו 10 תמונות. שדות הראייה לא צריכים להיות חופפים כפי שמוצג על ידי המיקומים השמורים בכלי הסקירה XYZ.

לבסוף, הנח את החלקים הסקלריאליים בשפופרת של מיליליטר אחד עם PBS מיד לאחר השלמת המיקרוסקופיה כהכנה לניתוח קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית לאחר מכן. כדי להתחיל, גזרו את החלק המרכזי של הבקרה וטיפלו בסקלרה במספריים. יבש כל ריבוע סקלרלי עם רקמה סופגת והניח אותו שטוח על תחתית תבנית DSC בעזרת מלקחיים משוננים.

כשהרקמה בפנים והשפה מכווצת ומכוסה, שקלו את המחבת על מנת לקבל את המשקל הרטוב של הרקמה. לאחר מכן, הנח את הדגימה המשוקללת במיקומה המיועד על מגש הדגימה האוטומטית של DSC. צור שיטה באמצעות תוכנת ניהול מכשירים, המציינת את משקל הרקמה והפעל את הניתוח התרמי באמצעות ההיקפים המפורטים בפרוטוקול הטקסט.

לאחר השלמתו, נתח את הנתונים עבור כל דגימה על ידי חילוץ שיא טמפרטורת המעבר שבו מתרחשת דנטורציה תרמית באמצעות תוכנת הדמיית המכשיר. תמונות SHG של סקלרה נותחו בפיג'י עבור בהירות פיקסלים ממוצעת. כאשר תמונה נפתחת ותפריט הניתוח נבחר ואחריו מדידה, נפתחת טבלה עם תוצאות המכילה את הבהירות הממוצעת של האות.

לחלופין, בתפריט Analyze, היסטוגרמה נבחרת ליצירת היסטוגרמה של ערכי עוצמת פיקסלים הכוללת מידע על הבהירות והשונות הממוצעת של האות בתמונה. מדידה זו חזרה על עצמה עבור כל התמונות מדגימות הבקרה והמקושרות. תמונות SHG מייצגות של סקלרה עם ניתוח היסטוגרמה נלווה, כולל בהירות ממוצעת, מודגמות כאן.

דגימת הבקרה מאופיינת בסידור גלי של סיבים. מוצגת כאן דגימה צולבת עם SMG של 400 מילימולרית עם עוצמת פיקסלים מוגברת החושפת סיבי קולגן שנראים ישרים יותר. תוצאות הניתוח התרמי מראות את השיא הגבוה יותר של טמפרטורת דנטורציה ומאשרות את אפקט הקישור הצולב.

מוצגת דגימת הביקורת, ועקומת דנטורציה של דגימה צולבת של 400 מילי-מולאר. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימה צולבת, וכיצד לבצע מיקרוסקופ SHG על דגימות סקלרליות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו נאבקים בהזרקה מדויקת בחלל התת-טנון, חילוץ כירורגי של הריבוע סביב אתר ההזרקה וקביעת תנאי התמונות לסריקת הרקמה במצב תצוגה מקדימה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו אוטולורסנציה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון ניתוח אלסטין כולל כימות ומורפולוגיה. ההשלכות של טכניקת מתן סוכנים צולבים זו משתרעות על טיפול בקוצר ראייה גבוה וסטפילומה אחורית, מכיוון שהיא מספקת גישה קלה יותר לקוטב האחורי לצורך ייצוב סקלרלי. ההשלכות של טכניקת מיקרוסקופיה זו משתרעות על אבחון של קוצר ראייה גבוה וסיבוכים הנגרמים על ידי היחלשות קולגן על ידי מדידת מצב הצלבת קולגן בסקלרה החולה, או על ידי מדידת התוצאה לאחר השלמת הליך הצלבה הרצוי.

לכן, שיטת הצלבה זו ומיקרוסקופ הדור ההרמוני השני יכולים לספק תובנה לגבי קישור צולב סקלרלי, ניתן ליישם אותו גם על רקמות אחרות כגון קרנית, עור, סחוס, גיד, שסתום לב וכלי דם.