הערכה של חדירות מחסום הדם - מוח על ידי עירוי תוך ורידי של התווית על-ידי FITC אלבומין במודל של עכברים של מחלות ניווניות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את חדירות מחסום המוח-דם במודל עכברי של הפרעה ניוונית על ידי הזרקה תוך-צווארית של אלבומין המסומן ב-FITC. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בחקר הומאוסטזיס במוח. זה יכול להיות שימושי במיוחד לחקור כל קשר אפשרי בין נזק למחסום הדם-מוח לבין ניוון עצבי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה וקלה לביצוע וניתנת ליישום גם על מודלים גדולים יותר של בעלי חיים ועל מסגרות נוירו-פתולוגיות אחרות. מדגים את ההליך הכירורגי של הזרקה תוך צווארית של אלבומין FITC יהיה לוקה קפוצ'י. סלבטורה קסטלדו ידגים את החתך ההיסטולוגי של המוח.

ואנריקו אמיקו ידגים את ההליך לרכישת מיקרוגרף. התחל בהכנת תמיסת אלבומין FITC על ידי המסת אבקת FITC-אלבומין במי מלח חוצצים פוספט ב-10 מיליגרם למיליליטר. פרשו את מכשירי הניתוח שעברו חיטוי.

נקו את ספסל הניתוח עם 70% אתנול והניחו וילון חד פעמי סטרילי כירורגי. לאחר מכן הגדר את מיקרוסקופ הסטריאו ההפעלה. לאחר הרדמת העכבר בהזרקה תוך-צפקית של תמיסת קטמין קסילזין, יש לעקוב אחר הרגעה של בעלי חיים על ידי צביטה עדינה בבוהן והקפדה על היעדר רפלקס הנסיגה.

הנח את העכבר המורדם בשכיבה עם הפנים כלפי מעלה וקבע את ארבע הרגליים והזנב על שולחן העבודה הכירורגי בעזרת סרט דבק. לאחר אבטחת העכבר, יש לגלח בזהירות את שולי הניתוח המתאימים על הצוואר ולחטא אותו בתמיסת פובידון-יוד באתנול 70%. יבש את המשטח המגולח החשוף בעזרת צמר גפן.

לאחר מכן, לאחר ביצוע חתך אורכי באורך 1.5 ס"מ בקו אמצע עצם הבריח, החל מאמצע בית החזה ונמשך ממש מתחת לצוואר, מתחו בזהירות את רקמת החיבור בעזרת מלקחיים תחת השגחה מיקרוסקופית כדי לחשוף את וריד הצוואר החיצוני. הקפידו על מספיק מקום מימין ומשמאל לווריד הצוואר כדי להקל על החדרת המחט בגודל 30 וחצי לעירוי תמיסת ה-FITC-חלבון. הזרקו 100 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר אלבומין FITC בווריד הצוואר הימני במשך שלוש דקות.

זהו השלב הקריטי ביותר במהלך ההליך. החדרה לא נכונה של המחט עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך לדופן הווריד ולפגוע בניסוי כולו. חמש עשרה דקות לאחר ההזרקה, לאחר המתת חסד של העכבר על ידי עריפת ראש, הוציאו במהירות את המוח מהגולגולת וטבלו אותו בנפח של איזופנטן מקורר מראש, כלומר פי עשרה מהמוח, למשך 15 דקות.

העבירו את המוח הקפוא של האיזופנטן לתוך צינור מקורר מראש ואחסנו אותו במקפיא של 80 מעלות צלזיוס עד לחתך היסטולוגי. הטמע מוח קפוא בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לפני חתך קריוסטט. חותכים את המוח לחלקים בעובי 20 מיקרון בעזרת קריוסטט ומרכיבים אותם על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ.

בצע צביעה משותפת של למינין FITC-אלבומין על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים נגד למינין, כפי שתואר קודם לכן. כסו את מגלשות ההחלקה במדיום הרכבה המכיל DAPI והשאירו את המגלשה לייבוש למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, צפו בכתמי הקרינה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה פי 20, מצוידים במסנני FITC ו-Cy3 כאחד.

הפעל את הקרינה lamp כ-10 דקות לפני השימוש. הפעל את המיקרוסקופ, את המחשב המחובר ואת המצלמה הדיגיטלית. הפעל את תוכנת ניתוח התמונות.

השתמש במטרה המתאימה לאיסוף אותות אופטימלי ורזולוציה מרחבית ובחר מסננים מתאימים. רכוש מינימום של ארבע חשיפות צבע של 24 סיביות לכל פרוסת מוח. נתח את עוצמת הקרינה עבור כל ערוץ בודד, באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה בחינם.

המיקרוגרפים הפלואורסצנטיים המייצגים הבאים של קריוסקציות מוח מראים התפלגות דיפרנציאלית של אלבומין פלואורסצנטי ירוק בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. הצביעה האדומה, המוצגת כאן, מייצגת את סמן כלי הדם, למינין, בתנאים פיזיולוגיים ובתנאים של פגיעה במחסום הדם-מוח. תמונות ממוזגות אלה מראות לוקליזציה משותפת של אלבומין פלואורסצנטי ירוק ולמינין, יחד עם צביעת DAPI של גרעינים במחסומי דם-מוח שלמים ונפגעים.

גרף זה מציג את כימות הקרינה הירוקה הנפלטת על ידי FITC-אלבומין, המדווחת כעוצמת הקרינה הירוקה בתנאים בריאים ופגומים כאחד. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין כל מגיב טרי ולהכין את הספסל הכירורגי. אחרי הצפייה בסרטון הזה, ייתכן שתהיה לכם הבנה טובה כיצד להעריך את החדירות של מחסום הדם-מוח במודל של חיות של מחלות ניווניות, על ידי מדידת ההיצמדות של האלבומין הפלואורסצנטי הירוק לפרנכימה של המוח.