Name: שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למד שיטת תרבות חדשנית לתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות PD0325901 וויטמין C לשמירה על מצב היפומתילציה ופלוריפוטנטיות. הפרוטוקול משפר את המורפולוגיה ומונע הטרוגניות בתרביות ארוכות טווח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (21435008 ו- 21327006 ל ה. ו), התוכנית האסטרטגית של מחקר עדיפות של האקדמיה הסינית למדעים (XDB14030200 ל ה. ו).

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li>
<li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+modulates+NF%CE%BAB+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%3A+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li>
<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
<li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li>
<li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li>
<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22855723">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li>
</ol>

המחברים לחשוף אין פוטנציאל ניגודי עניינים.

עבודה, הפגנו שיטה של שילוב Vc, PD0325901 כדי לקיים את העכבר ES תאים על מצב מובחן ו hypomethylated, אשר הושגה על ידי פעולה סינרגטי של קידום DNA demethylation מאת Vc ודיכוי דה נובו דנ א מתילציה על-ידי PD0325901. יתר על כן, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה נהדר תחת מערכת התרבות Vc/PD0325901.
לקיים יותר של המדינה של העכבר ES תאים במערכת התרבות Vc/PD0325901, ישנם כמה צעדים קריטיים. ראשית, אצוות FBS צריך להיות ממוסך מראש כדי למצוא במלאי את הטוב באצוות. כמו כן, החלפה בתדירות גבוהה של סרום מזיק...

ES תאים שמקורם את ICM של הבלסטוציסט1. התאים נמצאים במצב pluripotency והוא יכול ליצור כל שושלות הסומטית, תאים germline2. הקמת תאים ES מספק ההזדמנות לחקור את ההתפתחות תהליכי במבחנה ניתן להפיק תאים של הרלוונטיות רפואי עבור רפואה רגנרטיבית בהתבסס על שלהם pluripotency3.
שתי קבוצות seminally נוסדה הקווים תא העכבר ES בשנת 1981, כאשר תאים שמקורם העובר העכבר בתחילת היו תרבותי בנסיוב שור עוברית (FBS)-המכיל בינוני עם העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מזין שכבה1,4 . MEFs היו לא פעיל mitotically, גדלו מראש במנות לפני culturing תאים ES. MEFs מספקים תמיכה עבור העכבר ES תא מצורף ומפיקים גורמי גדילה כדי לקדם את הפצת ותרסן את הבידול5, בעוד FBS מציעה גורמים עם מחלות חיוניות והורמונים עבור התפשטות תאים. מחקרים מאוחרים יותר ציין כי LIF המיוצר על ידי תאי מזין היה ציטוקין מפתח התחדשות עצמית ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים, התוספת של LIF לתוך האמצעי יכול תחליף מזין תאים6. כיום, התפרסות של העכבר ES התאים FBS/LIF בינוני-מזיני הוא עדיין השיטה הרגילה שאומצה על ידי חוקרים רבים. עם זאת, כמה בעיות עולות מתוך תפיסה זו התרבות הקלאסית. ראשית, מזין התאים מפרישים גורמי עודף בלתי מבוקרת, עלול לגרום זיהום פתוגניים7. כדי למנוע הפרעה זו, ציפוי המשטח של מנות עם ג'לטין ותוספת של LIF בסרום המכיל בינוני הן שיטות אלטרנטיביות לשמירה על העכבר ES תאים ללא תאים בשכבה מזין. בנוסף, העכבר ES התאים גדלו בתנאים סרום/LIF התערוכה מורפולוגי הטרוגניות אוכלוסיית תאים, אפילו ברמת הביטוי של גורמים הקשורים pluripotency8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי בתנאים סרום/LIF, גורמי שעתוק הקשורות pluripotency הליבה (כולל SOX2, Nanog ו- OCT4) יכול לקיים את pluripotency דרך LIF ונ ט איתות; עם זאת, ראוי לציין, הם גם מפעילים אות פיברובלסט גורם הגדילה (FGF) כדי לעורר בידול8. עקב פעולה כפולה אמביוולנטי גורמי שעתוק הליבה, העכבר ES תאים בתרבית בנסיוב מציגים הטרוגניות, בהיקף של שתי האוכלוסיות להחלפה, אחד דומה ICM ועוד הדומה המדינה כאשר הבחינה epiblast8. יתר על כן, העכבר ES תאים בנסיוב לעתים קרובות להפגין hypermethylation העולמי9, בעוד ICM ו- PGCs הם במצב hypomethylated הכללית, אשר קשורה קשר הדוק שלהם9,pluripotency10.
יש ביקוש רב לפתח שיטות חדשות culturing העכבר ES תאים. מספר פרוטוקולים משופרת הוקמו מאז 200311 אבל שם ממשיך להיות כמה מגבלות, חסרונות7. מאז 2008, ניצול בשילוב של שני מעכבי קינאז מולקולה קטנה, PD0325901 (החומר המדכא של חלבון mitogen מופעל (MAPK) / חוץ-תאית-אות-מוסדר קינאז (טיפשה) (MEK)), CHIR99021 (המדכא של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3)), N2ב'27 בינוני עם LIF ובלי סרום פתחה אופקים חדשים עבור culturing העכבר ES תאים12. בינוני מוגדר החדש מאופיין על ידי שימוש שני מעכבי (2i). העכבר ES התאים תרבותי במדיום 2i/LIF הם הומוגנית אוכלוסיות התאים ואת הביטוי של גורמים pluripotency. בנוסף, העכבר 2i/LIF-תרבותי ' ES תאים התערוכה DNA hypomethylation ברחבי העולם, אשר קרובה יותר תאים דמויי ICM9,13. למרות זאת, תרבות 2i יש החסרונות. PD0325901, CHIR99021 אינם מסיסים במים, בדרך כלל הם מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-מבוסס מניות פתרון כדי להוסיף אותם תרבות בינוני. מחקרים הראו כי לטווח ארוך, חשיפה במינון נמוך של תאים דימתיל סולפוקסיד יכול להוביל cytotoxicity14.
כאן, אנחנו מנוצל שתי תרכובות מולקולה קטנה פיתחה שיטה תרבות חדשה של העכבר ES תאים. שיטת תרבות הרומן משלב Vc מעכב MEK PD0325901 כדי לקדם את ה-DNA hypomethylation במהירות, ביעילות לרמה המקבילה של PGC, בשם פרוטוקול culturing Vc/PD0325901. העכבר ES התאים Vc/PD0325901-נוסף בינוני המכילים סרום התערוכה עניי מורפולוגיה, מתקיימים במצב הקרקע. בהשוואה ל- 2i תרבות, העכבר ES התאים תרבותי בתנאים Vc/PD0325901 שהפגינו קינטיקה מהירה יותר של ה-DNA demethylation, יכול להגיע לרמה hypomethylation לזו של PGC. בנוסף, השימוש מעכב יחיד (PD0325901) מפחית את כמות דימתיל סולפוקסיד. קלט לתוך בינוני בהשוואה בשימוש 2i (PD0325901/CHIR99021) ומפחית את הנזק לתאים.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר עוברי מקור</td><td>אוסטרליה Corning</td><td>35-076-CV</td><td>רכיב של מדיום תא ES של עכבר</td></tr><tr><td>DMEM/גלוקוז גבוה</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>רכיב של מדיום תא ES של עכבר</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>רכיב של מדיום תאי ES</td></tr><tr><td>של עכבר חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td> <td>Gibco</td><td>11140050</td><td>רכיב של מדיום תא ES של עכבר</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>רכיב של מדיום תא ES של עכבר</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>רכיב של תמיסת סטרפטומיצין בינונית של תא ES של עכבר</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>רכיב של מדיום תא ES של עכבר</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>תאים שוטפים</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>Hyclone</td><td>SH30042</td><td>דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>48722</td><td>ציפוי כלים</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>כימיקל מולקולה קטנה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>כימיקל מולקולה קטנה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>ויטמין C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd&nbsp;</td><td>כימיקל</td><td>מולקולות קטנות XW00508171 לתרבית תאים</td></tr><tr><td>מערכת טיהור מים Ultra Bioscience</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>הקפאת תאים</td></tr><tr><td>צנטריפוגר</td> בינוני <td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>DNA ומיצוי חלבון</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז Sigma</td><td></td><td>P8340</td><td>רכיב של מאגר</td></tr> <tr>RIPA<td>מעכב פרוטאז PMSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>רכיב של מאגר RIPA</td></tr><tr><td>DTT</td>, <td>SIGMA</td><td>43815</td><td>רכיב של מאגר RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889</td><td>רכיב של מאגר RIPA</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA גנומי&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>מיצוי DNA גנומי</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>קביעת ריכוז DNA</td></tr><tr><td>עגל פוספטאז מעיים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0290</td><td>DNA עיכול</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0303</td><td>DNA</td></tr><tr><td>עיכול ארס נחש פוספודיאסטראז I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>עיכול DNA</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>סינון DNA מעוכל</td></tr><tr><td>מערכת 1290 UHPLC</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>הפרדת UHPLC</td></tr><tr><td>G6410B ספקטרומטר מסה מרובע משולש</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS ניתוח</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 עמודה</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>קולום להפרדת UHPLC</td></tr><tr><td>5-מתילציטוזין</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>סטנדרט 5mC</td></tr><tr><td>5-הידרוקסימתילציטוזין (סטנדרטי)</td> <td>טורונטו מחקר כימיקלים</td><td>M295900</td><td>סטנדרטי 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 נוגדן</td><td>bioworld</td><td>BS7634</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני Dnmt3a</td><td>נוגדן bioworld</td><td>BS6587</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני Dnmt3b נוגדן</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>נוגדן Dnmt3l</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Dnmt1 נוגדן</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני</td></tr> <tr><td>ובטא;-נוגדן טובולין</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>נגד ארנב עז IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן</td></tr> <tr><td>משניעז אנטי עכבר IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>ניתוח כתמים מערביים-נוגדן</td></tr><tr><td>משני טריזול</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td> מערכת שעתוק הפוך <td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG אלקליין פוספטאז צביעה וערכת בדיקת פעילות</td><td>תאים ביולאבס, בע"מ</td><td>CBA-302</td><td>&nbsp; ניתוח צביעת פוספטאז אלקליין</td></tr><tr><td>תאי ES של עכבר: WT, 129 SvEv</td><td>סופק על ידי פרופסור Guoliang Xu (מכוני שנחאי למדעי הביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, שנחאי, סין)</td><td></td> <td>זן תאים של תאי ES של עכבר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>תצפית תאי</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>ניתוח סטטיסטי</td></tr></tbody></table>

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות mek מעכב pd0325901 וויטמין c

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

תאי גזע עובריים (ES) יש את היכולת להבדיל בין לכל אחת משלוש שכבות הנבט (האנדודרם, והמזודרם או האאקטודרם), ניתן להפיק שושלות רבות עבור רפואה רגנרטיבית. ES תא תרבות במבחנה כבר זמן רב בנושא חששות נרחבת. באופן קלאסי, העכבר ES תאים נשמרים בסרום ו לוקמיה מעכבות פקטור (LIF)-המכיל בינוני. עם זאת, בתנאים סרום/LIF, תאים להראות הטרוגניות מורפולוגיה, לפרופיל ביטוי של גנים הקשורים pluripotency, בעיקר במצב והשלמת. יתר על כן, בתרבית תאים ES התערוכה הכללית hypermethylation, אך נאיבי ES תאים של התא הפנימי מסה (ICM), בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) במצב של hypomethylation העולמית. מדינת hypomethylated ICM, PGCs קשורה קשר הדוק pluripotency שלהם. כדי לשפר את העכבר ES תא תרבות שיטות, לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה המבוססת על ניצול סלקטיבי משולב של שתי תרכובות מולקולה קטנה כדי לשמור על המדינה hypomethylated ו pluripotent הדנ א. כאן, אנו מציגים את הטיפול שיתוף של ויטמין C (Vc), PD0325901 יכול למחוק כ 90% 5-methylcytosine (5mC) ב 5 ימים העכבר ES תאים. התוכן שנוצר 5mC דומה לזו של PGCs. החקירה מכניסטית מראה כי PD0325901 up-מווסת את הביטוי Prdm14 לדכא את Dnmt3b (de novo דנ א methyltransferase), Dnmt3l (קופקטור של Dnmt3b), על-ידי הפחתת סינתזה 5mC de novo . Vc מקלה את ההמרה של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בעיקר על ידי Tet1, Tet2, המציין את מעורבותם של demethylations ה-DNA פסיביים ואקטיביים. יתר על כן, בתנאים Vc/PD0325901, העכבר ES תאים מראים pluripotent המדינה ומורפולוגיה הומוגנית. באופן קולקטיבי, אנו מציעים הרומן ושיטת כימית-סינרגיה תרבות להשגת DNA hypomethylation ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים. השיטה תלויי-כימית מולקולה קטנה מתגבר את החסרונות העיקריים של התרבות סרום, מביאות הבטחה לייצר הומוגניות תאים ES עבור יישומים קליניים נוספים מחקרים.

Vc/PD0325901 המושרה בסינרגיה מחיקה הכללית של העכבר ES התאים. העכבר ES התאים בנסיוב התערוכה DNA hypermethylation, ואילו תאים pluripotent ICM PGCs מראים מחיקה הכללית של מתילציה DNA המדינה hypomethylated קשורה קשר הדוק עם שלהם9,pluripotency10.
בעבר, אנחנו ואחרים מצאו כי Vc עשוי לשפר את בתיווך ט 5mC demethylation15,17</sup...

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בתרכובות המולקולות הקטנות PD0325901 וויטמין C כדי לשמור על מצב היפומתילציה ופלוריפוטנטי בתאי גזע עובריים של עכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי גזע עובריים של עכברים בתרבית FBS, כגון הטרוגניות במורפולוגיה ודה-היפרמתילציה. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי הגזע העובריים של העכבר מסוגלים לשמור על מורפולוגיה מצוינת ומצב היפומתילציה ומצב לא מובחן.לאחר הכנת צלחות ומאגרים, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחמם מראש את תאי ה-ES של העכבר, מדיום התרבית, הטריפסין וה-PBS באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. כדי לעבור את התאים, שאפו את המדיום מהצלחת והשתמשו בשני מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הסר את ה-PBS והוסף 0.3 מיליליטר של טריפסון EDTA לתאים והטה במהירות את הצלחת כדי לכסות את התאים בתמיסה.הסר מיד את הטריפסין ודגר את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנתק את התאים. הוסף שני מיליליטר של מדיום סרום שחומם מראש כדי לנטרל את הטריפסין והשתמש בפיפט של חמישה מיליליטר כדי להשעות מחדש את מושבות התאים 10 פעמים לתרחיף תא בודד. צלחו 150 מיקרוליטר מתמיסת התא לכלי חדש בציפוי ג'לטין בשישה סנטימטרים והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום VCPD0325901 טרי.תרבית התאים ב -37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. בשל חוסר היציבות של Vc, כל 24 שעות בזמן הדגירה, הסר את מדיום התרבות הישן והוסף שלושה מיליליטר מדיום Vcpd0325901 טרי. לאחר שהגעתם למפגש של 70 עד 80 אחוזים, עברו את התאים והמשיכו לתרבית אותם כפי שהודגם זה עתה.כדי לבצע מיצוי DNA, אסוף את התאים עם טריפסין כפי שהודגם קודם לכן והשתמש בערכת טיהור DNA גנומית בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד לצינור ה-DNA והמיס את ה-DNA על ידי פיפטינג כ-15 פעמים. לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את היחס Od260 ל-280 כדי לקבוע את ריכוז ואיכות ה-DNA.ריכוז ה-DNA צריך להיות כ-500 נונוגרמות למיקרוליטר. לאחר מכן, עכל חמישה מיקרוגרם של DNA על ידי שילובו עם חמישה מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי tris hydrochloride PH7.6, שתי יחידות של פוספטאז מעי עגל, יחידה אחת של Dnase אחד, ו-0.005 יחידות של ארס נחש, פוספודיאסטראז אחד. לאחר מכן, השתמש במים טהורים במיוחד כדי להעלות את הנפח ל-50 מיקרוליטר.דגרו את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת בבוקר, אספו את הדגימה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1,000xg בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את התמיסה לצינורות סינון אולטרה וסובבו את הדגימות בטמפרטורה של 13, 000xg ו-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להסיר את אנזימי העיכול.כדי להכין את הדגימות לניתוח 5HMC, העבירו 36 מיקרוליטר של הסינון לצינור חדש של מיליליטר אחד והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של D35HMC לריכוז סופי של שלוש ננו-מולאריות. לניתוח 5MC, הכניסו 196 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד לתוך צינור צנטריפוגה חדש והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של סינון בשל הצפיפות הגבוהה של 5MC ב-DNA הגנומי. העבירו 36 מיקרוליטר מתמיסת 5MC המדוללת לצינור צנטריפוגה חדש והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של D35MC לריכוז סופי של 50 ננו-מולר.השתמש ב-D35HMC ו-D35MC כתקנים פנימיים לכיול 5HMC ו-5MC בהתאמה. לאחר הגדרת הפרמטרים לניתוח 5MC ו-5HMC בתוכנת UHPLCMS, על פי פרוטוקול הטקסט, קבע את הפרמטרים עבור QQQMSMS על ידי לחיצה על MS QQQ. עבור זמן עצירה, בחר ללא הגבלה/כמשאבה.עבור מקור יונים, בחר ESI. לסינון זמן, סמן את רוחב השיא והזן 0.07 דקות. כדי להגדיר את מקטעי הזמן, עבור שעת התחלה, בחר אפס.כדי להגדיר מצב סריקה ב- MRM כדי לנתח את הרמז מהעמודה, עבור סוג סריקה, בחר MRM. עבור ערך div, בחר ל- MS. עבור Delta EMV plus, הזן 200 ועבור Delta EMV מינוס, הזן אפס. בנה את הפרמטרים לניטור המעברים על ידי לחיצה ראשונה על רכישת MSQQQ one.כדי להגדיר מקטעי סריקה, עבור השתהות, הזן 90. כדי להגדיר את מתח השבר עבור ה-Fragmentor, הזן 90. עבור אנרגיית התנגשות, הזינו חמש.עבור מתח מאיץ התאים, הזן ארבעה. כדי להגדיר את מצב היונים החיובי, עבור קוטביות, בחר חיובי. כדי לבצע הפרדת UHPLC של מונונוקלאוזידים, הכינו פתרונות a ו-b לרמיזה של 5MC וציטוזין על ידי ערבוב של 500 מיליליטר מים טהורים במיוחד עם 500 מיקרוליטר חומצה פורמית לתמיסה a.לאחר מכן מדוד 500 מיליליטר של 100 אחוז מתנול ותמיסה ב. ערבב את תמיסה a ותמיסה b ביחס נפח לנפח של 95 עד חמישה כשלב הנייד כדי לחסל 5MC ו-C. לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה ל-0.25 מיליליטר לדקה. הפרד את 5HMC באמצעות רמז שיפוע אופטימלי.לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה על 0.25 מיליליטר לדקה. נטר את המעברים עבור 5MC, D35MC, DC, 5HMC ו-D35HMC. הגדר את הנימים כרךtagה על 3, 500 וולט.לאחר מכן הגדר את נפח ההזרקה ל-5 מיקרוליטר ונתח כל דגימה שלוש פעמים. השתמש בעקומות הסטנדרטיות המתאימות כדי להעריך את הכמות של 5MC ו-5HMC בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כפי שניתן לראות בניתוח זה של DNA גנומי בתאי ES של עכברים על ידי UHPLC MSMS, טיפול VcPD0325901 הביא לירידה מהירה יותר במתילציה של DNA והגיע לרמות יציבות של חמש MC לאחר חמישה ימים, בעוד שטיפול Vc 2i הביא לרמה דומה ביום 11.גרף זה מראה כי טיפול המכיל Vc העלה באופן דרמטי את תדירות 5HMC לאחר יום אחד ולאחר מכן, רמות 5HMC ירדו בהדרגה עקב ירידה הדרגתית במצע 5MC. ניתוח כתמים מערביים הראה כי Prdm14 היה מוגבר באופן משמעותי, בעוד ש-Dnmt3b והקו-פקטור שלו, Dnmt3l, היו מווסתים במידה ניכרת כאשר התאים נסוגו עם PD0325901, מה שמצביע על פעולת PD0325901 במחיקת 5MC. בבדיקת פוספטאז אלקליין זו, תאי ES של עכברים נצבעו כולם בסגול עם מורפולוגיה דמוית כדור כאשר טופחו במשך 26 ימים ב-VcPD032590, מה שמעיד על מצב לא מובחן.לעומת זאת, תאים שגדלו ב-FBS המכילים מדיום בלבד נראו בצבע בהיר עם התפשטות חלקית המעידה על התמיינות חלקית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-FBS צריך לעבור סינון מראש.כמו כן, הימנע מפיפטינג יתר של תאים דרך המעבר והחלפת מדיום התרבית VcPDO325901 מדי יום. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום תרבית תאי ES של עכברים במבחנה לחקור את ההתפתחות והתהליכים של עוברים במבחנה ואת התאים הנוצרים בעלי רלוונטיות רפואית לרפואה רגנרטיבית. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה טובה יותר כיצד לשמור על מורפולוגיה של גדילה ומצב חזק היפרמתילציה ופלורלי עבור תאי ES של עכברים על ידי שימוש בשני רכיבים מולקולריים קטנים, מעכב MEK PD0325901.אל תשכח שעבודה עם טריסול, DMS או PMS וה-DTT עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות כגון לבישת כפפות, מסכה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה.

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

למד שיטת תרבות חדשנית לתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות PD0325901 וויטמין C לשמירה על מצב היפומתילציה ופלוריפוטנטיות. הפרוטוקול משפר את המורפולוגיה ומונע הטרוגניות בתרביות ארוכות טווח.

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

גלה סרטונים נוספים