שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בתרכובות המולקולות הקטנות PD0325901 וויטמין C כדי לשמור על מצב היפומתילציה ופלוריפוטנטי בתאי גזע עובריים של עכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי גזע עובריים של עכברים בתרבית FBS, כגון הטרוגניות במורפולוגיה ודה-היפרמתילציה. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי הגזע העובריים של העכבר מסוגלים לשמור על מורפולוגיה מצוינת ומצב היפומתילציה ומצב לא מובחן.

לאחר הכנת צלחות ומאגרים, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחמם מראש את תאי ה-ES של העכבר, מדיום התרבית, הטריפסין וה-PBS באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. כדי לעבור את התאים, שאפו את המדיום מהצלחת והשתמשו בשני מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הסר את ה-PBS והוסף 0.3 מיליליטר של טריפסון EDTA לתאים והטה במהירות את הצלחת כדי לכסות את התאים בתמיסה.

הסר מיד את הטריפסין ודגר את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנתק את התאים. הוסף שני מיליליטר של מדיום סרום שחומם מראש כדי לנטרל את הטריפסין והשתמש בפיפט של חמישה מיליליטר כדי להשעות מחדש את מושבות התאים 10 פעמים לתרחיף תא בודד. צלחו 150 מיקרוליטר מתמיסת התא לכלי חדש בציפוי ג'לטין בשישה סנטימטרים והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום VCPD0325901 טרי.

תרבית התאים ב -37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. בשל חוסר היציבות של Vc, כל 24 שעות בזמן הדגירה, הסר את מדיום התרבות הישן והוסף שלושה מיליליטר מדיום Vcpd0325901 טרי. לאחר שהגעתם למפגש של 70 עד 80 אחוזים, עברו את התאים והמשיכו לתרבית אותם כפי שהודגם זה עתה.

כדי לבצע מיצוי DNA, אסוף את התאים עם טריפסין כפי שהודגם קודם לכן והשתמש בערכת טיהור DNA גנומית בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד לצינור ה-DNA והמיס את ה-DNA על ידי פיפטינג כ-15 פעמים. לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את היחס Od260 ל-280 כדי לקבוע את ריכוז ואיכות ה-DNA.

ריכוז ה-DNA צריך להיות כ-500 נונוגרמות למיקרוליטר. לאחר מכן, עכל חמישה מיקרוגרם של DNA על ידי שילובו עם חמישה מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי tris hydrochloride PH7.6, שתי יחידות של פוספטאז מעי עגל, יחידה אחת של Dnase אחד, ו-0.005 יחידות של ארס נחש, פוספודיאסטראז אחד. לאחר מכן, השתמש במים טהורים במיוחד כדי להעלות את הנפח ל-50 מיקרוליטר.

דגרו את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת בבוקר, אספו את הדגימה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1,000xg בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את התמיסה לצינורות סינון אולטרה וסובבו את הדגימות בטמפרטורה של 13, 000xg ו-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להסיר את אנזימי העיכול.

כדי להכין את הדגימות לניתוח 5HMC, העבירו 36 מיקרוליטר של הסינון לצינור חדש של מיליליטר אחד והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של D35HMC לריכוז סופי של שלוש ננו-מולאריות. לניתוח 5MC, הכניסו 196 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד לתוך צינור צנטריפוגה חדש והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של סינון בשל הצפיפות הגבוהה של 5MC ב-DNA הגנומי. העבירו 36 מיקרוליטר מתמיסת 5MC המדוללת לצינור צנטריפוגה חדש והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של D35MC לריכוז סופי של 50 ננו-מולר.

השתמש ב-D35HMC ו-D35MC כתקנים פנימיים לכיול 5HMC ו-5MC בהתאמה. לאחר הגדרת הפרמטרים לניתוח 5MC ו-5HMC בתוכנת UHPLCMS, על פי פרוטוקול הטקסט, קבע את הפרמטרים עבור QQQMSMS על ידי לחיצה על MS QQQ. עבור זמן עצירה, בחר ללא הגבלה/כמשאבה.

עבור מקור יונים, בחר ESI. לסינון זמן, סמן את רוחב השיא והזן 0.07 דקות. כדי להגדיר את מקטעי הזמן, עבור שעת התחלה, בחר אפס.

כדי להגדיר מצב סריקה ב- MRM כדי לנתח את הרמז מהעמודה, עבור סוג סריקה, בחר MRM. עבור ערך div, בחר ל- MS. עבור Delta EMV plus, הזן 200 ועבור Delta EMV מינוס, הזן אפס. בנה את הפרמטרים לניטור המעברים על ידי לחיצה ראשונה על רכישת MSQQQ one.

כדי להגדיר מקטעי סריקה, עבור השתהות, הזן 90. כדי להגדיר את מתח השבר עבור ה-Fragmentor, הזן 90. עבור אנרגיית התנגשות, הזינו חמש.

עבור מתח מאיץ התאים, הזן ארבעה. כדי להגדיר את מצב היונים החיובי, עבור קוטביות, בחר חיובי. כדי לבצע הפרדת UHPLC של מונונוקלאוזידים, הכינו פתרונות a ו-b לרמיזה של 5MC וציטוזין על ידי ערבוב של 500 מיליליטר מים טהורים במיוחד עם 500 מיקרוליטר חומצה פורמית לתמיסה a.

לאחר מכן מדוד 500 מיליליטר של 100 אחוז מתנול ותמיסה ב. ערבב את תמיסה a ותמיסה b ביחס נפח לנפח של 95 עד חמישה כשלב הנייד כדי לחסל 5MC ו-C. לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה ל-0.25 מיליליטר לדקה. הפרד את 5HMC באמצעות רמז שיפוע אופטימלי.

לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה על 0.25 מיליליטר לדקה. נטר את המעברים עבור 5MC, D35MC, DC, 5HMC ו-D35HMC. הגדר את הנימים כרךtagה על 3, 500 וולט.

לאחר מכן הגדר את נפח ההזרקה ל-5 מיקרוליטר ונתח כל דגימה שלוש פעמים. השתמש בעקומות הסטנדרטיות המתאימות כדי להעריך את הכמות של 5MC ו-5HMC בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כפי שניתן לראות בניתוח זה של DNA גנומי בתאי ES של עכברים על ידי UHPLC MSMS, טיפול VcPD0325901 הביא לירידה מהירה יותר במתילציה של DNA והגיע לרמות יציבות של חמש MC לאחר חמישה ימים, בעוד שטיפול Vc 2i הביא לרמה דומה ביום 11.

גרף זה מראה כי טיפול המכיל Vc העלה באופן דרמטי את תדירות 5HMC לאחר יום אחד ולאחר מכן, רמות 5HMC ירדו בהדרגה עקב ירידה הדרגתית במצע 5MC. ניתוח כתמים מערביים הראה כי Prdm14 היה מוגבר באופן משמעותי, בעוד ש-Dnmt3b והקו-פקטור שלו, Dnmt3l, היו מווסתים במידה ניכרת כאשר התאים נסוגו עם PD0325901, מה שמצביע על פעולת PD0325901 במחיקת 5MC. בבדיקת פוספטאז אלקליין זו, תאי ES של עכברים נצבעו כולם בסגול עם מורפולוגיה דמוית כדור כאשר טופחו במשך 26 ימים ב-VcPD032590, מה שמעיד על מצב לא מובחן.

לעומת זאת, תאים שגדלו ב-FBS המכילים מדיום בלבד נראו בצבע בהיר עם התפשטות חלקית המעידה על התמיינות חלקית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-FBS צריך לעבור סינון מראש.

כמו כן, הימנע מפיפטינג יתר של תאים דרך המעבר והחלפת מדיום התרבית VcPDO325901 מדי יום. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום תרבית תאי ES של עכברים במבחנה לחקור את ההתפתחות והתהליכים של עוברים במבחנה ואת התאים הנוצרים בעלי רלוונטיות רפואית לרפואה רגנרטיבית. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה טובה יותר כיצד לשמור על מורפולוגיה של גדילה ומצב חזק היפרמתילציה ופלורלי עבור תאי ES של עכברים על ידי שימוש בשני רכיבים מולקולריים קטנים, מעכב MEK PD0325901.

אל תשכח שעבודה עם טריסול, DMS או PMS וה-DTT עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות כגון לבישת כפפות, מסכה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה.