זרימת עבודה המבוסס על השילוב של מעקב איזוטרופי ניסויים כדי לחקור את חילוף החומרים מיקרוביאלית של מקורות מזון רבים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור כמותית את חילוף החומרים של מקורות תזונה מרובים באמצעות מצעים מסומנים. זרימת עבודה זו מאפשרת לקבוע את גורלם של חומרים מזינים נצרכים ואת המקור המטבולי של תרכובות המסונתזות על ידי שמרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים המיקרוביאלי כגון כיצד כל חילוף החומרים פועל בהתאם לתנאי הסביבה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הבהרה וכימות של החלבון של התפלגות החומרים המזינים ממקורות מרובים. שיטה זו שימשה לחקירת חילוף החומרים של חנקן בשמרים, אך ניתן ליישם אותה גם על מטבוליזם ומיקרואורגניזמים אחרים. המפתח להצלחה בניסוי זה טמון בשחזור התסיסות.

על המשתמשים להקדיש תשומת לב מיוחדת לאיסוף התאים באותו שלב פיזיולוגי מוגדר. מדגימים את ההליך כריסטיאן פיקו מהצוות הטכני שלנו, פאולין סגינו, דוקטורנטית מהמעבדה, וסטפני רולרו, פוסט-דוקטורנטית. בחיטוי יש לפסטר כל מדיום סינטטי שהוכן לכל מקור חנקן בבקבוק של ליטר אחד המכיל מוט ערבוב מגנטי.

ממיסים את הכמות המתאימה של המולקולה המסומנת כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי במדיום. עקר את המדיום באמצעות מערכת סינון ואקום חד פעמית. בעזרת גליל מדידה סטרילי, חלקו את המדיום בין שני תסיסות מעוקרות מראש המכילים מוט ערבוב מגנטי ומצוידים במנעולי תסיסה כדי למנוע כניסת חמצן אך לאפשר שחרור פחמן דו חמצני.

לאחר גידול זן cerevisiae במדיום YPD, יש לאסוף אליקוט לפני תרבית תחת זרימה למינרית ולכמת את אוכלוסיית התאים באמצעות מונה חלקיקים אלקטרוני המצויד בצמצם של 100 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה של התרבית המוקדמת, השעו את הגלולה בנפח מתאים של מים סטריליים כדי לקבל ריכוז סופי של 2.5 כפול 10 לתאים 9 למיליליטר. לאחר מכן, חסנו כל תסיסה במיליליטר אחד של תרחיף התאים.

לאחר מכן, הכינו פלטפורמת תסיסה על ידי התקנת התסיסות במכווני התמיכה המונחים כראוי על צלחות הערבוב ב-21 מצבים והגדירו את קצב הערבוב על 270 סל"ד. כדי להתחיל את הניטור המקוון של כל תסיסה, הפעל את אפליקציית בקרת הרובוט, לחץ על כפתור התחל בדיקה ובחר את נפח התסיסה לביצוע. כדי להבטיח שהממשק המוצג מאפשר חיווי של מספר ומיקום המתסיסים בפלטפורמה, לחץ לחיצה ימנית על מיקום החריץ ובחר השבת כדי להשבית את הניטור של המיקומים הריקים.

כדי לאתחל את תוכנת החישוב, לחץ על כפתור האתחול ואמת עם אישור. לאחר מכן, לחץ על כפתור התחל של אפליקציית בקרת הרובוט כדי להתחיל ברכישת המשקל. לאחר מכן, צנטריפוגה שתי דגימות של שישה מיליליטר שנלקחו מהתסיסות בטמפרטורה של 2,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסיום, העבירו כל סופרנטנט קפוא לשני צינורות ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

שוטפים כל כדור פעמיים בחמישה מיליליטר מים מזוקקים ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס למדידת העשרה איזוטופית. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חומצה סולפוסליצילית של 25% המכילה 2.5 מילי-מולרי נורלאוצין כתקן פנימי ל-800 מיקרוליטר של דגימה כדי להסיר מולקולות בעלות משקל מולקולרי גבוה. לאחר הדגירה והצנטריפוגה, מסננים את התערובת דרך קרום ניטרוצלולוזה בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ומניחים את הדגימה במערכת ניתוח חומצות אמינו.

בתוכנית או בתוכנה של מערכת הניתוח, לחץ על הכפתור הפעל כדי להתחיל בניתוחי הכרומטוגרפיה הנוזלית עם המנתח המצויד בעמודת חילופי קטיון. לאחר מכן, הכינו תמצית מחומצנת על ידי השעיית כדור תא מסומן שהוכן בעבר ב -200 מיקרוליטר חומצה פרפורמית. לאחר דגירה של ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה על ידי הוספת 33.6 מיליגרם נתרן גופרתי.

הוסף 800 מיקרוליטר של שש חומצות הידרוכלוריות, לתמצית המחומצנת, ודגר את הדגימה בצינור זכוכית אטום הרמטית למשך 16 שעות בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס בתנור בחום יבש. לאחר שאפשרו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר, הוסיפו 200 מיקרוליטר של 2.5 מילי-מולרי נוירולאוצין והסירו את גז המימן הכלורי עם זרם חנקן. שוטפים את התמצית המיובשת פעמיים עם 800 מיקרוליטר מים מזוקקים, ולאחר מכן 800 מיקרוליטר אתנול.

לאחר מכן, הוסף 800 מיקרוליטר של מאגר ליתיום אצטט של 200 מילי-מולרי לתמצית. קבע את הריכוזים היחסיים של חומצות אמינו בתוך חלבונים בדגימה באמצעות השיטה הכרומטוגרפית שתוארה קודם לכן. הידרוליזה של כדור תא מסומן על ידי הוספת 1.2 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית בעלת שש מולריות, ודגירה של הדגימה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 105 מעלות צלזיוס בצינור זכוכית סגור היטב בתנור בחום יבש.

לאחר שאפשרו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר, הוסיפו 1.2 מיליליטר מים מזוקקים. לאחר צנטריפוגה להסרת הפסולת התאית, חלקו את הסופרנטנט לשישה שברים של 400 מיקרוליטר בצינורות זכוכית פתוחים. יבש את השברים בתנור בחום יבש בחום של 105 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות עד שהם מגיעים לסמיכות של סירופ.

במהלך הידרוליזה של ביומסה, יבש את השבר עד לעקביות של סירופ על ידי שליטה תכופה בחומצת הפעולה. לצורך נגזרת ECF, ממיסים את ההידרוליזט המיובש המקורר ב-200 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית של 20 מילי-מולרית ו-133 מיקרוליטר של תערובת של אחד עד ארבעה של פירידין ואתנול. הוסף 50 מיקרוליטר של אתיל כלורופורמט כדי להפיק את חומצות האמינו.

לאחר שחרור הפחמן הדו חמצני, העבירו את התערובת לצינורות צנטריפוגות המכילים 500 מיקרוליטר דיכלורומתאן כדי לחלץ את התרכובות הנגזרות. מערבולת את הדגימות למשך 10 שניות. לאחר צנטריפוגה של ארבע דקות ב-10,000 פעמים G, אספו את השלב האורגני התחתון של כל דגימה עם פיפטה של פסטר והעבירו לבקבוקון דגימה אוטומטית של GC המכיל תוספת זכוכית חרוטית כך שניתן יהיה להזריק כל דגימה ישירות למכשיר ה-GCMS.

ריאגנטים לנגזרת HPLC משמשים להליך ECF. החלף לעתים קרובות את ריאגנטים ECF. לצורך נגזרת DMF-DMA, ממיסים את ההידרוליזט המיובש ב-50 מיקרוליטר מתנול ו-200 מיקרוליטר אצטוניטריל.

הוסף 300 מיקרוליטר של DMF-DMA ומערבל את הדגימה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לבקבוקון דגימה אוטומטית של GC המכיל תוספת זכוכית חרוטית. לצורך נגזרת BSTFA, השעו את ההידרוליזט ב -200 מיקרוליטר אצטוניטריל.

הוסף 200 מיקרוליטר BSTFA לדגימה וסגור הרמטית את צינור הזכוכית. לאחר הדגירה במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 135 מעלות צלזיוס, העבירו את התמצית המקוררת ישירות לבקבוקון דגימה אוטומטית של GC המכיל תוספת זכוכית חרוטית. כעת, נתח את הדגימות בעזרת כרומטוגרף גז המצויד במזרק דגימה אוטומטית ומחובר לספקטרומטר מסה.

לחץ על מכשיר בתפריט של תוכנת המחשב. תחת הכרטיסיה רצף, לחץ על עריכת טבלת יומן רישום לדוגמה כדי ליצור רשימה לדוגמה ולחץ על הפעל והפעל רצף כדי להתחיל את ההזרקות. לאחר השלמת הניתוחים, רשום מקבץ עוצמות עבור כל חומצת אמינו המתאימה לאיזוטופומרי המסה השונים שלה.

הוסף 10 מיקרוליטר מהתקנים הפנימיים המתאימים לחמישה מיליליטר של סופרנטנט בצינור זכוכית של 15 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של דיכלורומתאן, סגור היטב את הצינור ונער את הדגימה על משטח נדנדה למשך 20 דקות. לאחר הצנטריפוגה, אוספים את השלב האורגני התחתון בצינור זכוכית של 15 מיליליטר.

לאחר חזרה על מיצוי הדיכלורומתאן, יבש את התמצית האורגנית מעל 500 מיליגרם של נתרן גופרתי נטול מים ואסוף את השלב הנוזלי בעזרת פיפטה פסטר. רכז את התמצית בפקטור של ארבעה תחת שטף חנקן. לאחר מכן, העבר את הדגימה המרוכזת לבקבוקון דגימה אוטומטית של GC.

לכימות GCMS, הזרקו שני מיקרוליטר של דגימה ביחס מפוצל של 10 לאחד, והפרידו את המולקולות הנדיפות שחולצו באמצעות פרופיל טמפרטורת התנור המתאים. באמצעות הגיליונות האלקטרוניים בפרוטוקול הטקסט, הזן את ערכי הנתונים הגולמיים התואמים את ריכוז חומצות האמינו החוץ-תאיות, המשקל היבש של התא, תכולת החלבון של התאים, ריכוז המולקולות הנדיפות והעשרה איזוטופית של חומצות אמינו חלבון ומולקולות נדיפות. תרשים סכמטי של זרימת העבודה לחקירת הניהול על ידי שמרים של מקורות החנקן המרובים שנמצאים במהלך תסיסת היין מוצג כאן.

עבור נקודות דגימה שונות, הפרמטרים הביולוגיים מראים יכולת שחזור גבוהה בין פרמצות. סקירה כללית של החלוקה מחדש של חנקן מהמקורות במיץ ענבים לכל חומצות האמינו החלבון מוצגת כאן. בשילוב עם קביעת מאזן המסה, מדידת ההעשרה האיזוטופית של חומצות אמינו חלביאניות סיפקה את הכימות הראשון של תרומתם של ארגינין, גלוטמין, אמוניום ומקורות אחרים שמקורם בחנקן לקבוצות האמינים של כל אחת מהתרכובות הללו.

השוואה בין כמות חומצת האמינו הנצרכת המוחזרת ישירות לביומסה מתוארת כאן. חלוקה של חומצות האמינו האליפטיות הנצרכות, לאוצין וואלין ברשת המטבולית בשמרים מוצגת כאן. יותר מ-96% מהוואלין והלאוצין הנצרכים מוחזרים במוצרי ההמרה שלהם.

באופן מפתיע, חלק ניכר מהוולין והלאוצין הם קטבוליים למרות חוסר איזון ניכר בין הזמינות של תרכובות אלה במדיום לבין תכולתן בביומסה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמישה ימים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור בקפידה את חלק התיוג של המצע בהתאם לסוגיות המדעיות.

כדי להבטיח שחזור ביולוגי טוב, בצע את התסיסה והניתוח הכרומטוגרפי בשכפול. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור כיצד חילוף החומרים והפיזיולוגיה של מיקרואורגניזמים משתנים בהתאם לתנאי הסביבה. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים לנגזרות וממס ארגינין עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ועבודה מתחת למכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.