במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

התחל הליך זה בהכנת פיברובלסטים של גיד העכבר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. קצרו את התאים מצלחת של 10 סנטימטר על ידי שאיבת המדיה תחילה. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA ודגרו במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הרוו את הטריפסין עם תשעה מיליליטר של DMEM-10, ואספו את התאים המרחפים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לדלל את התאים עם DMEM-10 לריכוז סופי של תא אחד לכל 100 מיקרוליטר. לאחר מכן העבירו את התאים לצלחות באר 96 על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מהמתלה לכל באר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהבארות מתלכדות, מה שיכול לקחת עד שבועיים-שלושה. החלף את המדיה ב-DMEM-10 טרי כל שלושה עד חמישה ימים. כאשר הם מתכנסים, גייסו את התאים עם 20 מיקרוליטר 0.05% טריפסין EDTA לבאר, וחלקו אותם לשתי קבוצות כפולות של 96 לוחות בארות.

בדיקה לפעילות לוציפראז בסט אחד של צלחות. השתמש בבדיקת לוציפראז גחלילית הומוגנית שאינה דורשת הסרת מדיה, בהתאם לפרוטוקול הכלול בערכת בדיקת הלוציפראז. השתמש בתוצאות הבדיקה כדי לבחור שיבוטים ללא פעילות לוציפראז הניתנת לזיהוי מקבוצת הלוחות הנותרת.

הרחב את השיבוטים הללו תחילה לצלחת של 24 בארות, ולאחר מכן לצלחת של שש בארות. בצע את אותו הדבר עבור שיבוט עם פעילות הלוציפראז הגבוהה ביותר. זה ישמש כבקרה חיובית למטרות אימות.

לאחר הרחבה בצלחת שש הבארות, קצור כמות גדולה מכל באר עבור כתם מערבי. גייסו את התאים עם 200 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין EDTA. דגרו על התאים במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הרוו את התאים בשני מיליליטר של DMEM-10, והעבירו מחצית מהתאים לצלחת נוספת של שש בארות. המתן עד שהתאים יתחברו לתחתית הצלחת. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני הליזינג לכתם המערבי.

צלחת מספר שיבוטים שליליים ב-0.2 מיליון תאים לבאר בצלחת של שש בארות. טפל בתאים פעם אחת עם 10 מיקרו-מולארי 5-אזציטידין. לאחר מכן דגרו במשך 72 שעות מבלי להחליף את המדיה לפני בדיקת פעילות לוציפראז, כמו קודם.

לאחר מכן, בחרו שיבוט שלילי אחד שצבר פעילות לוציפראז עם 5-אזציטידין למסך, והתחילו להרחיב אותו למספר צלחות של 10 סנטימטרים. הקפיאו את השיבוטים השליליים הנותרים בחנקן נוזלי כגיבוי. ניתן לשמור על השיבוט החיובי בתרבית הרקמה או להקפיא עד לשימוש נוסף.

בבוקר, צלחו מיליון תאי X לא פעילים על לוחות תרבית רקמה של 10 סנטימטרים. אחר הצהריים, הדביקו את הצלחות על ידי החלפת המדיה ב-DMEM-10 טרי המכיל כמות קבועה מראש של סופרנטנט ויראלי וחמישה עד 10 מיקרוגרם למיליליטר פוליברן. לאחר 18 עד 24 שעות, שאפו את המדיה והוסיפו 10 מיליליטר DMEM-10 טרי לכל צלחת.

צלחות תרבות למשך 48 שעות נוספות. בבוקר, גייסו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA לצלחת, והרוו את התאים עם 9 מיליליטר של DMEM-10 לצלחת. העבירו את המתלים דרך מסנן רשת של 100 מיקרון.

משוך את המתלים המסוננים יחד, וזרע שתי קבוצות של לוחות של 10 סנטימטר במיליון תאים לצלחת. אחר הצהריים, החלף את המדיה בסט אחד של צלחות ב-DMEM-10 המכיל 15 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B.In הסט השני, החלף את המדיה ב-DMEM-10 טרי בלבד. לאחר 48 שעות, גייסו את התאים מצלחות לא מטופלות של Hygromycin B באמצעות מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA.

יש לדגור במשך שתיים עד חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרוו את התאים עם 9 מיליליטר של DMEM-10. משוך את הדגימות הבודדות והמשך מיד בחילוץ DNA.

המשיכו לטפח את ערכת הבחירה של Hygromycin B למשך שישה ימים נוספים, וחידשו את אמצעי הבחירה ב-DMEM-10 טרי המכיל Hygromycin B כל יומיים. ביום השישי, החלף את מדיית הבחירה ב-DMEM-10 טרי בלבד. אפשר ארבעה ימים להתאוששות, ולאחר מכן קצור את ה-DNA של הדגימה לאחר הבחירה כמו קודם.

המשך לזהות סיכות שיער מועשרות בדגימות שלאחר הבחירה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לאמת את הלהיטים, זרע ראשון שמונה מיליון תאים של 293 FT לצלחת על לוחות של 10 סנטימטרים. למחרת, החלף את המדיה בתשעה מיליליטר DMEM-10 ללא אנטיביוטיקה לכל צלחת 30 דקות לפני החתך.

לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של תערובת טרנספקציה אחת לכל מנה של תערובת טרנספקציה שתיים, וערבב בעדינות על ידי פיפטינג. לאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מרחו את התערובת על כל צלחת בצורה טיפתית, וסובבו את הצלחת בעדינות לערבוב.

למחרת, החלף את המדיה בחמישה מיליליטר של DMEM-10.48 שעות לאחר הטרנספקציה הראשונית, אסוף את הסופרנטנט הלנטי-ויראלי והעביר אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרון שנרטב מראש עם DMEM-10 כדי למקסם את ההתאוששות. למחרת בבוקר, צלחו 0.1 מיליון תאי X לא פעילים לבאר על שש צלחות באר. אחר הצהריים, הדביקו את הצלחות על ידי החלפת המדיה בשני מיליליטר של DMEM-10 טרי המכיל סופרנטנט לנטי-ויראלי וחמישה עד 10 מיקרוגרם למיליליטר פוליברן.

להדביק באר בקרה בסופרנטנט ויראלי המיוצר מווקטור לנטי-ויראלי ריק. למחרת, החלף את המדיה בשני מיליליטר DMEM-10 המכילים מיליגרם אחד למיליליטר של פורומיצין. השתמש בבחירה במשך ארבעה ימים.

לאחר ארבעה ימים, החלף את המדיה בשני מיליליטר DMEM-10 טרי, ואפשר 48 עד 72 שעות להתאוששות. לאחר גיוס התאים עם 150 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין EDTA, דגרו אותם במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הרוו את התאים ב-1.5 מיליליטר של DMEM-10 לפני העברתם לצינורות חרוטיים וצנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר ב-500 פעמים G למשך 10 דקות.

הסר את המדיה והשהה מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה המסופק בערכת בדיקת הלוציפראז. דגרו את המתלה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את המתלה לצלחת לבנה של 96 בארות.

בצע את הבדיקה בחדר החושך, בהתאם לפרוטוקול הכלול בערכה. השתמש בתאי X פעילים כבקרה חיובית ובתאי X שליליים הנגועים בווקטור לנטי-ויראלי ריק כבקרה שלילית. שיבוטים פיברובלסטים של גיד עכבר אימורטליים מראים פעילות חיובית או שלילית של לוציפראז גחלילית, העולה בקנה אחד עם מיקום המדווח על כרומוזום X הפעיל או הלא פעיל, בהתאמה.

ביטוי MeCP2, כפי שנקבע על ידי הכתם המערבי, מציג את הדפוס ההדדי. שימו לב שפעילות לוציפראז גחלילית יכולה להיגרם בשיבוטים שליליים עם מתן 5-אזציטידין. אם קיים על כרומוזום ה-X הפעיל, הגן העמיד להיגרומיצין מעניק יתרון הישרדותי בבחירת היגרומיצין, בהשוואה לתאים עם הגן על כרומוזום X הלא פעיל.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן ולבצע מסך עבור מווסתים של השבתת כרומוזום X באמצעות מדווחים המוכנסים באופן סלקטיבי על כרומוזום X לא פעיל. המעבדה שלי ביצעה בעבר מסכי בסיס מדווחים לווסתים כרומטין בשמרים, והצלחתנו בגישה זו נתנה לי השראה לעצב את המסך הזה עבור מווסתים של השבתת כרומוזום X בתאי יונקים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שימוש ב-RNA קטן ומפריע, CRISPR, מולקולות קטנות כדי לעזור לענות על שאלות נוספות לגבי השבתת כרומוזום X בתאי יונקים.