Name: דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: למד פרוטוקול מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לדימוי מחסום הדם-מוח בעכבר ושחזור תלת-ממדי. השיטה משלבת אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח אברונים תוך-תאיים בתאי אנדותל מוחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קראוון עבודה נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט רושה (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSibarita%2C+JB+%22Deconvolution+Microscopy%22">Deconvolution Microscopy</a>. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-387-45524-2_23">Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging</a>. , 453-467 (2006).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li>
<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

מחברים הם תחת עבודה בשכר על ידי רוש.

פרוטוקול שפורטו לעיל מתאר את ההכנות של מקטעים לתרשים המוח, צביעת immunofluorescent, ייבוא תמונות ניתוח הפרמטרים מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של BBB. בשיטה זו נעשה שימוש לאחרונה לחקור הלוקליזציה של נוגדן משלוח פלטפורמות3, התעבורה של IgG אנדוגני על פני ה-BBB17, והטרוגניות של BBB על אובדן pericyte18. שלבים שונים בפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים למטרה ספציפית של הניסוי. ראשית, השימוש של מקטעים (100 מיקרומטר) עבה מקלה על טיפולם במהלך ההליכים immunostaining, הרכבה. זה גם מאפשר שחזור תלת-ממד של הרשת נימי, יחידת נוירו-וסקולריים, ועל הדור של נימי וחתכי NVU. אולם, חדירה של נוגדנים בתוך המקטעים רקמות עשוי להשתנות, צביעת נוגדנים מסוימים יכול להיות מוגבל לשכבה שטחית של הרקמה קרוב coverslip. ניתן לשנות את הפרוטוקול על ידי הגדלת הריכוז של דטרגנט במהלך השלב permeabilization ו/או את אורך הצעד permeabilization כדי לשפר את הנוגדן חדירה לתוך הרקמה. שנית, איכות התמונה אולי התגלה כאשר מנסים לרכוש תמונות עמוק בתוך הרקמה (בד כ 20 עד 30 מיקרומטר מתחת לפני השטח) בשל פיזור אור, כמו גם סטייה אופטית של אי-התאמה של שבירה. כדי להתגבר על בעיה זו, ניתן לשלב שיטות חדשות עבור ניקוי רקמות ונוגדנים פעילים חדירה20 עם פרוטוקול זה כדי אחסון גדולים יותר תמונות של רקמה. שלישית, deconvolution מתבצע לאחר ייבוא תמונות כדי לשפר את הרזולוציה צירית של התמונה. הבחירה של האלגוריתם deconvolution עיוור בשימוש פרוטוקול זה היה מבוסס על (i) קלות השימוש, כפי אין חישוב מראש של הפונקציה בנקודה-התפשטות נדרשת, (ii) שלה חוסן לשיפור איכות התמונה21, ו- (iii) חוסר חפצי אמנות ב- mIgG מבנים תאיים לאחר יישום. בהתאם המבנים תאיים דמיינו במדגם, אלגוריתמים deconvolution אחרים עלולים לגרום איכות תמונה גבוהה יותר. 21,הפניות הבאות22 מספקים דיון מקיף היתרונות ואת המגבלות של אלגוריתמים נוספים deconvolution התמונה. לבסוף, השימוש של חבילת התוכנה של ניתוח תמונה מותרת את פילוח של נימים ומבנים תאיים בשלושה ממדים. בבירור וניתוח תמונות אינה מוגבלת התוכנה תיאר את הפרוטוקול ואת חבילות חלופיים, לדוגמה אלה דנו הפניה23, יכול לשמש לתמונות מקטע. ההתאמה של תוכנות שונות לניתוח של מבנים תאיים על פני BBB צריך לאמת מדעית על-ידי הערכת הדיוק של סגמנטציה.
מאז בשיטה זו מבוסס על דגימות קבוע, הוא אינו מספק מידע ישיר על הדינמיקה של transcytosis על פני BBB. עם זאת, ניתן לשלבו עם הזמן-קורס ניסויים24, לדוגמה על-ידי הזרקת המולקולה עניין ומדידת שלה הצטברות בתוך בקס בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה, לשחזר את קינטיקה של דרך הווריד תחבורה תאיים. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת לניתוח של אזורים מוחי עמוק, כפי שמוצג18, אשר אינם נגישים כעת גישות intravital הדמיה בשידור חי. שלב קריטי במהלך הפרוטוקול הוא פיקוח קפדני על קיבוע הרקמה. קיבוע עם 4% PFA מפחיתה באופן דרמטי את immunogenicity של organelles תאיים ושל immunoglobulins אנדוגני או המנוהלת באופן עקיף17 (איור 1B). מגבלה של פרוטוקול זה היא הדרישה שלו באיכות גבוהה נוגדנים (קרי, צביעת שאינם ספציפיים נמוך, נמוך אשיג) מתאים immunofluorescence. ובלבד ריאגנטים כאלה זמינים, ניתן להחיל את שיטת לחקור לוקליזציה תאיים של חלבון בכל עניין. לדוגמה, הפרוטוקול שימש לזיהוי lysosomes המוח תאי אנדותל17. בנוסף יש לציין כי מאז פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה קונפוקלית, הרזולוציה לרוחב מוגבל על ידי עקיפה, אין אפשרות לזהות מבנים קטנים יותר כ 175 ל-250 ננומטר (איור 2).
מחקרים קודמים יש לבצע ניתוח מפורט של הרכב הסלולר של יחידת נוירו-וסקולריים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית25,26. עם זאת, חוקרים תחבורה תאיים-BBB מסתמך בעיקר על השימוש הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים19,27,28. שיטה זו מציעה לרוחב הרזולוציה הגבוהה ביותר של מבנים תאיים, מיקרוסקופ אלקטרונים נותר טכניקה מאתגר עם תפוקה נמוכה. יתר על כן, מספר מטרות מולקולריות שונות אשר ניתן לאבחן על ידי EM מצומצמת מאוד. פרוטוקול זה מציע חלופה נגישה לחקור תחבורה תאיים-BBB. הנוהל המלא, מאוסף המוח כדי ניתוח תמונות, ניתן לבצע 5 עד 6 ימים. אם נוגדנים המתאימים זמינים, immunofluorescence מאפשר זיהוי בו זמנית של מספר תאים סוגים/מולקולות בתוך באותה דגימת זרע. יתר על כן פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם סופר-רזולוציה טכניקות במיקרוסקופ כדי להתגבר על המגבלות רזולוציה מרחבית29. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר כימות של שינויים תאיים לוקליזציה של חלבונים עניין בתוך יחידת נוירו-וסקולריים. היישום שלה על שונות גנטית או תרופתי לפליטת יאפשר חוקרים את הפונקציות מבנה ותעבורה תאיים של ה BBB ויוו.

מחסום הדם - מוח (BBB) היא רציפה הסלולר מחסום שנוצר על ידי האסטרוציטים, pericytes, נוירונים, תאי אנדותל המפריד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) זרימת הדם1. ויסות תעבורה על פני BBB ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווך על ידי מאפיינים מיוחדים של תאי אנדותל של המוח (בקס). הנוכחות של צמתי המערכת צר בין בקס קצב הבסיס נמוך של transcytosis להגביל את התעבורה paracellular ו- transcellular של מולקולות נישא בדם, בהתאמה2. לאחרונה, מסלול transcytosis ב בקס לרתום כדי לשפר את המסירה של מולקולות גדולות טיפולית עד3,המוח4. עם זאת, המנגנון של transcytosis על פני BBB טרם אושרו במלואו מאופיין5,6.
עבודה נרחב נעשה במבחנה כדי לפענח את המנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תעבורה תאיים על פני בקס7,8,9,10, 11, אבל מערכות כאלה להיכשל כדי לסכם את אדריכלות מורכבים ופיזיולוגיה של היחידה נוירו-וסקולריים (NVU). מצד שני, מחקרים ויוו12,13 לספק מידע מפורט כמותית על תעריפי התחבורה ברחבי BBB אך אינם מספקים תובנות מנגנונים תאיים תחבורה. לכן, חוקרים מרכיבי NVU הסלולר, תאיים ויוו ו- ex-vivo נשאר מאוד מאתגר14. רק מספר מצומצם של טכניקות נתונות לנתח subcellular מבנים בתוך התאים של NVU. רוב המחקרים להשתמש מיקרוסקופ אלקטרונים אבל בטכניקה זו הוא מוגבל על ידי הפרוטוקולים המורכבים הדרושים עבור הכנת הרקמה הנכונה וטיפול הדגימה. לכן, הקמנו מתודולוגיה בהתבסס על רזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית שתאפשר עיבוד מוחי לדוגמאות הניתוח, כימות של תאי subcellular בתוך התאים NVU.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל את העכבר המוח מקטעים לתרשים כדי לבצע הדמיה כמותית של BBB ו- NVU ברמות סלולרית ו- subcellular. אנחנו נבדק ואומת מספר נוגדנים תמונה, לשחזר את NVU בשלושה ממדים. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר דימות ברזולוציה מירבית מוגבלת עקיפה אופטי של organelles בתוך המוח נימים. יחד עם ניתוח תמונות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את העברת מקרומולקולות תאיים על פני BBB בתנאים שונים ניסיוני, למשל במודלים של העכבר המחלה של הקשורים ניוון מוחיים.

<table><tbody><tr><td>שיבוט נוגדן חד שבטי של חולדה ER-MP12 כנגד CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Labels תאי אנדותל במוח השתמש בדילול 1:100 לזהות עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי חולדה נגד Podocalyxin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1556</td><td>תוויות לומן של נימים השתמש בדילול 1:100 לזהות עם חמור פוליקלונלי אנטי חולדות IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי ארנב נגד CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>תוויות קרום בסיס של נימים השתמש בדילול 1:100 לזהות עם IgG אנטי-ארנב רב-שבטי של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, משמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי עז כנגד CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>תוויות pericytes שימוש בדילול 1:100 זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד עזים של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>שיבוט נוגדן חד שבטי של עכבר G-A-5 כנגד GFAP בשילוב עם Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>תוויות אסטרוציטים שימוש בדילול 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי ארנב נגד Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>תוויות מיקרוגליה שימוש בדילול 1:100 זיהוי עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי של חולדה ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>תוויות ליזוזומים השתמש בדילול 1:100 זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד חולדות של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, משמש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>שימוש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>שימוש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן רב-שבטי עז נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>שימוש בדילול 1:400</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman נייר סינון איכותי קפל מראש כיתה 0858 1/2,</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td> מגורען <td>רוט קארל</td><td>258.1</td><td>רוטי קול 1</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה פלואורסצנטי</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako פלואורסצנטי הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>עכברים בוגרים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td>C57BL/6J זכר או נקבה עכברים בין גיל 9 ל-19 חודשים</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S להב רוטט מיקרוטום</td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X עם גלאי HyD ולייזר אור לבן</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF גרסה 3.1.0 לבנות 8587</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>Bitplane תוכנה מדעית</td><td>NA</td><td>Imaris גרסה 7.6.5 לבנות 31770 עבור x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של transcytosis

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

מחסום הדם - מוח (BBB) הוא ממשק multicellular דינמי המסדירה את התעבורה של מולקולות בין את זרימת הדם למוח. Transcytosis על פני BBB מסדיר את המסירה של הורמונים, מטבוליטים נוגדנים טיפולית parenchyma המוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב immunofluorescence סעיפים לתרשים סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה להמחיש organelles subcellular בתוך תאי אנדותל-BBB לייזר. שילוב זה הנתונים-קבוצה עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית מאפשרת פילוח חצי אוטומטית את כימות של נפח נימי, השטח, כמו גם מספר ואת עוצמת תאיים organelles ב BBB. הגילוי של העכבר אנדוגני אימונוגלובולינים (IgG) בתוך שלפוחית תאיים, כימות שלהם ב BBB משמש להמחשת שיטת. פרוטוקול זה פוטנציאל ניתן להחיל את החקירה של מנגנוני השליטה BBB transcytosis של מולקולות שונות בתוך vivo.

כמה דוגמאות מייצגות של תמונות המתקבל הפרוטוקול המתואר כאן, חלקים במוח העכבר היו מוכתמים נוגדנים זיהוי מרכיבים שונים של NVU כולל את קרום המרתף, האסטרוציטים, pericytes, תאי אנדותל (ראה טבלה של חומרים של נוגדנים ספציפיים השתמשו) (איור 1A, D, ו- E). ברזולוציה זו אפשרי להבחין את התהליכים הנפרדים astrocytic והרגליים סוף-הנמצאים במגע ישיר עם נימים.
כדי להבליט את התאמתו של פרוטוקול זה לגילוי מבנים תאיים, סעיפים מוח מחיות שמעניינת הזריק ה נוגדן mAb86 אנטי-טאו אנושית16 היו מוכתמים של נוגדנים נגד fluorescently שכותרתה ( איור 1B). mAb86 ידוע במיוחד היעד נוירונים המבטאות צורה פתולוגית של טאו16. MAb86, באמצעות הפרוטוקול המתואר במסמך זה זוהה עם רזולוציה עקיפה-מוגבלת בתוך מבנים vesicular בודדים בתוך הנוירונים (איור 1בג). בנוסף, העכבר אנדוגני IgG זוהה מבנים תאיים בתוך תאי אנדותל אך לא pericytes (איור 1D-E ואיור 2).
רכישת ברזולוציה גבוהה קונאפוקלית z-ערימות של להערכת המוח מאפשר פילוח תלת מימדי של נימים ושלפוחיות תאיים-BBB. איור 2 מציג דוגמה של התהליך של עיבוד הממיין של נימי בלוחיות הסבר CollagenIV ועכבר IgG חיובי תאיים שלפוחית. מאת לכימות dataset מלא תמונות מקוטע, לדוגמה על ידי מדידת מספר שלפוחית לכל אמצעי אחסון נימי, זה אפשרי ללמוד שינויים תאיים תחבורה תהליכים בתנאים שונים. איור 3 בג מציג את ההבדלים בעוצמתם mIgG שלפוחית פלורסצנטיות ומספר המתייחס mIgG-parenchyma המוח, בהתאמה, על המחסור pericyte במודל עכבר pdgf-bret/ret כפי שדווחה בעבר 17. אותה גישה גם לאחרונה השתמשו כדי לנתח את השינויים בהעברה תאיים-BBB בין אזורים שונים במוח18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
איור 1: Labelling של מספר סוגי תאים ומבנים subcellular של נוירו-וסקולריים ההוראה תמונות נציג של יחידת נוירו-וסקולריים (A ו- D), שלפוחית תאיים הכלול בתוך הנוירונים (B) או תאי אנדותל (E) שהושג עם פרוטוקול זה. העוצמה המקסימלית ההקרנה התמונה ב- A (למעלה) מציג את ההפצה של GFAP-חיוביות האסטרוציטים (אדום) סביב נימים מתויג מאת CollagenIV (ירוק). חצים להצביע על תהליכים astrocytic בודדים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. ברזולוציה זו, תהליכים בודדים אסטרוציט ו סוף-כפות רגליים הם נראים בבירור, כפי שמוצג בתמונה מוגדלת של האזור מסגרת (למטה). ראשי חץ הצבע על הקצה astrocytic-מטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. בתמונה B מראה ההצטברות של נוגדן המוזרק באופן עקיף, mAb86 (ירוק), בתוך נוירון בהיפוקמפוס. ראשי חץ הצבע שלפוחית mAb86-חיוביים בודדים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. גרף ג' מציג את עוצמת פרופיל שורה שלפוחית יחיד. גודל שלפוחית הוערך מ לכל רוחב חצי מקסימום של התאמה לפי עקומת גאוס (קו שחור מוצק) של עקומת העוצמה (הקו הירוק, עיגולים). התמונות ב- D מראים שחזור תלת מימדי של (ירוק) תא אנדותל מוקף של pericyte (אדום) בתוך הנדן הבזליים (CollagenIV, אפור). הלוחות התחתון הצג את הערוצים פלורסצנטיות בודדים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. התמונות ב- E הראה הלוקליזציה של mIgG (אדום) בתאיים שלפוחית בתוך תאי אנדותל (משמאל לוח, CD31 בירוק) אבל לא בתוך pericytes (לוח נכון, CD13 בצבע ירוק). כל התמונות, דאפי צבעונית גרעינים מוצגים בכחול. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לוחות D ו- E שונו מן ההפניה17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
איור 2 : עיבוד תלת מימדי של נימים ושלפוחיות תאיים-מחסום הדם - מוח. עם הפרוטוקול המתואר, תמונות וידאו ברזולוציה גבוהה של נימים CollagenIV-חיוביות (ירוק) ועכבר IgG תאיים שלפוחית (אדום) היו רכשה (A). החלונית השמאלית מציגה את מקטע אופטי יחיד עם חתכים. החצים הצבע שלפוחית mIgG-חיוביים בודדים בתוך תאי אנדותל המוח. החלונית ' ' על שחזור מראה נכון 3D של z-מחסנית מלאה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים). נימי נפח (B) ושלפוחיות בודדים (ג) היו מעובד בשלושה ממדים, לכמת באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים). כל התמונות, דאפי צבעונית גרעינים מוצגים בכחול. גודל ברים = 5 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
איור 3 : כימות של לוקליזציה תאיים mIgG ב BBB. להחליפן בתמונות מציג שחזורים תלת מימדיים (A) של נימים (בלוחיות הסבר collagenIV, ירוק) והפצה של mIgG (אדום), ב- C57BL/6 עכברים וב - pdgf-bret/ret pericyte דלה עכברים שתואר קודם לכן ב-19. גודל ברים = 10 מיקרומטר. התמונות ב- B הצג את פילוח של שלפוחית תאיים בתוך המסיכה CollagenIV. The גרף ב' מציגה את כימות השוואה של מספר שלפוחית mIgG לכל אמצעי אחסון של נים. כל נקודה מייצגת מדידות של מקטעים בודדים נימי. הקו המלא מציג את הממוצע של קווי השגיאה ומייצגים את סטיית התקן של הנתונים. התמונות ב- C הצג mIgG אות פלורסצנטיות מחוץ המסכה CollagenIV. באופן דומה, גרף ג' מציגה את כימות השוואה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית mIgG ב- parenchyma המוח בין עכברים C57BL/6 pdgf-bret/ret עכברים pericyte דלה. יחידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית היו מנורמל על ידי עוצמת parenchyma mIgG ממוצע נמדד כל העכברים C57BL/6. דמות זו שונתה מן ההפניה17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה דימות ברזולוציה, שחזור תלת מימדי של העכבר נוירו-וסקולריים יחידה, מחסום הדם - מוח באמצעות סעיפים לתרשים המוח. שיטה זו מאפשרת הפריט החזותי, ניתוח של כימות של organelles תאיים-BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה להדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת מימדי של מחסום הדם-מוח של העכבר. הוא משלב אימונופלואורסצנציה של קטעים צפים חופשיים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לנתח אברונים תת-תאיים בתוך תאי האנדותל של המוח. שיטה זו מוסיפה הכנת חלקים צפים במוח, צביעה אימונופלואורסצנטית, רכישת תמונה ופרמטרים אנליזה למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא בכך שהיא מאפשרת כימות של אברונים תת-תאיים בתוך תאים של היחידה הנוירו-וסקולרית. מי שידגים את ההליך יהיה רוברטו וילאס

high-resolution-confocal-imaging-blood-brain-barrier-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

מקור: Villaseñor, R and Collin. L. הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח: הדמיה, שחזור תלת מימד וכימות של טרנסציטוזיס. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח (BBB) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, המציגה קטעי מוח של עכבר מוכתמים בנוגדנים לניתוח רכיבי BBB ומבנים תוך-תאיים, ישים לחקר הומאוסטזיס מוחי, אינטראקציות נוירו-וסקולריות ותפקוד לקוי של BBB הקשור למחלה.

הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח בקטע מוח של עכבר

מקור: Bagheri, M., et. al. פרוטוקול לניתוח מורפומטרי קונפוקלי תלת מימדי של אסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2015).סרטון זה מדגים הדמיה של אסטרוציטים עם תווית פלואורסצנטית בקטע מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. חלק המוח ממוקם תחת עדשת האובייקט המתאימה, ונבחרים פלואורופורים ומסננים מתאימים. לאחר אופטימיזציה של החשיפה באופן אוטומטי, פרמטרי הסריקה מוגדרים כדי להבטיח תמונות דו-ממדיות ברזולוציה גבוהה. פרמטרים של מחסנית Z מוגדרים, ותמונות תלת מימד מתקבלות.

הדמיה תלת מימדית של אסטרוציטים בעלי תווית חיסונית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בפלורסנט בתוך רקמות גדולות, באופן אידיאלי, יש לדמות את הדגימות הביולוגיות ללא חתך. 3DISCO הוא הליך ניקוי רקמות פשוט המבוסס על דגירה רציפה עם ממיסים אורגניים. עם הניקוי, האיברים הופכים שקופים ומאפשרים סריקת לייזר מקצה לקצה של הדגימה.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לכמת את ארכיטקטורת כלי הדם במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני in vivo ו-ex vivo.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

סמים המיקוד גידולים במערכת העצבים המרכזית היא אתגר גדול. כאן נתאר פרוטוקול לייצר לחקות במבחנה של דם-מוח הגידול-המכשול באמצעות תאים מאתר ו/או האדם, לדון את הרלוונטיות שלהם עבור מהמכונית של מערכת העצבים המרכזית הגידול מיקוד ויוו.

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

מחסום הדם - מוח (BBB) יכול להיות משובש באופן זמני עם אולטרסאונד ממוקד microbubble בתיווך (FUS). כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לפתיחת BBB בתפוקה גבוהה ב vivo באמצעות מערכת FUS מודולרית נגישה למומחים שאינם אולטרסאונד.

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).

כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

למד פרוטוקול מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לדימוי מחסום הדם-מוח בעכבר ושחזור תלת-ממדי. השיטה משלבת אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח אברונים תוך-תאיים בתאי אנדותל מוחיים.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

גלה סרטונים נוספים