תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution
7 בדצמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור השגחה של אמת ירוק פלורסצנטיות חלבון (GFP) מתויג גלוקוז טרנספורטר 4 (GLUT4) חלבון סחר על גירוי האינסולין, אפיון התפקיד הביולוגי של CCR5 ב האינסולין – GLUT4 איתות עם מיקרוסקופ Deconvolution.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לצפות בסחר החלבון בזמן אמת בתאי עצב ראשוניים כגון GLUT4 בתאי עצב היפותלמוסיים עם נזק מינימלי. שיטה זו יכולה להסביר שאלות מפתח הקשורות לוויסות עצבי של איתות אינסולין וחילוף חומרים כמו במקרה של סוכרת מסוג 2. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחוקרים יכולים לבודד תרביות תאים ראשוניות ולצפות בהשפעה הנגרמת על ידי התרופה בזמן אמת.
המשמעות של טכניקה זו היא בחירת טיפול בסוכרת מסוג 2 או תנגודת לאינסולין הקשורה למוח מכיוון שכעת אנו יודעים כיצד אות האינסולין הזה משתנה על ידי הכימוקין CCL5 בנוירונים היפותלמוסיים. כדי להתחיל בהליך זה, צפו את כלי התרבות בליזין פולי-D יום לפני התרבות. למנה של שש בארות, הוסיפו 1.5 מ"ל פולי-D ליזין ב-0.05 מ"ג/מ"ל לכל באר.
למחרת, הסר פולי-D ליזין ושטוף את הכלים פעמיים עם 2 מ"ל של ddH2O. לאחר מכן מלאו את צלחות הפטרי בגודל 10 ס"מ ב-20 מ"ל של מדיום כביסה ושמרו אותן על קרח. מלאו את הצינורות של 15 מ"ל במדיום כביסה ושמרו אותם על קרח.
לבידוד רקמת המוח, יש לעקר את הפלטפורמה, לנתח מיקרוסקופ וכלי ניתוח עם אתנול 75% כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, חתכו סביב אזור חבל הטבור כדי לבודד את הגורים מבלי לפגוע בהם. לאחר מכן, הסירו את ראשו של כל גור ואבטחו אותו במקומו באמצעות המלקחיים הישרים בעלי הקצה העדין.
השתמש במלקחיים מעוקלים אחרים בעלי קצה דק כדי להסיר את העור החיצוני והגולגולת משני הצדדים ולקלף אותם מהכיוון הקדמי לכיוון הגב. לאחר מכן, שמרו את המוחות המבודדים בצלחת פטרי נקייה עם מדיום שטיפה קר כקרח. הפוך את המוח ושמור על הצד הגחוני כלפי מעלה.
לאחר מכן, בודד את רקמת ההיפותלמוס בעזרת מלקחיים מעוקלים דקים. החזיקו את אונת הריח בעזרת המלקחיים החדים וקילפו את קרומי המוח הדקים המקיפים את כל המוח בעזרת המלקחיים המעוקלים. הפוך לצד התחתון של קליפת המוח והפרד את ההיפוקמפוס מקליפת המוח על ידי משיכתו הצידה.
כאשר כל אזורי המוח בודדו, קוצצים את הרקמות הללו בצינורות של 15 מ"ל המכילים מדיום כביסה קר כקרח. בהליך זה, שטפו את הרקמות על ידי היפוך הצינור המכיל רקמה פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, שמור על הצינור ישר כדי לאפשר לרקמות להתייצב.
הסר את המדיום העליון באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית המחוברת למערכת ואקום. כדי לשטוף את הטישו, הוסיפו 15 מ"ל של מדיום כביסה קר כקרח והפכו את הצינור פעמיים-שלוש. לאחר הכביסה הסופית, הסר את אמצעי הכביסה בעזרת פיפטה של 1 מ"ל.
דגרו על הרקמות עם מאגר העיכול פפאין-טריפסין באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שבע עד 14 דקות. לאחר מכן, נטרל את פעילות האנזימים על ידי הוספת נפח אחד של סרום בקר עוברי. השאירו את השפופרת על המדף והמתינו דקה עד שתיים כדי לאפשר לרקמות להתייצב.
לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט בזהירות בעזרת פיפטה של 1 מ"ל. הוסף 6 מ"ל של מדיום ציפוי למבחנה ופיפטה את הרקמה למעלה ולמטה 50 פעמים בעדינות עם פיפטה של 5 מ"ל. השאירו את השפופרת על המדף והמתינו דקה עד שתיים כדי לאפשר לרקמות השמנמנות והלא מנותקות להתייצב.
לאחר מכן, העבירו את השלב העליון המכיל תאים מנותקים לצינור חדש ודללו אותו במדיום ציפוי. לאחר מכן, הוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם לכל באר של צלחת שש הבארות. כדי להכין את התאים להדמיה חיה, הסר בזהירות את החלקות הכיסוי עם תאי עצב באמצעות מלקחיים והנח אותם על מגלשת הזכוכית בזהירות.
לאחר מכן, הסר עודפי מדיום עם מגבוני משימה עדינים על ידי קיפולם פעמיים והנחתם בזהירות על החלקת הכיסוי מבלי להזיז אותה. חיוני להסיר כמות עודפת של מדיום כדי למנוע תנועה מיותרת על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, טפל בדגימות התאים שנבחרו עם CCL5 ב-10 ננוגרם/מ"ל או אינסולין ב-10 יחידות/מ"ל למשך דקה אחת.
לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מק"ל של אינסולין מדולל על קצה החלקות הכיסוי. לאחר מכן, הוסף שמן טבילה על עדשת אובייקט NA בהגדלה פי 60. לאחר מכן, הנח את החלקות הכיסוי על המיקרוסקופ דה-קונבולוציהtagה כשהחלקות הכיסוי פונות כלפי מטה ומאובטחות כהלכה.
השתמש בתאורת שדה בהיר או פלואורסצנטי כדי לזהות את תאי המטרה. לאחר מכן, כוונן את המיקוד עד שניתן יהיה לצפות בבירור בתאי המטרה. אל תזיז את עדשת האובייקט מחוץ לאזור החלקת הכיסוי כדי למנוע סימני שריטות מיותרים.
לאחר מכן, זהה את GFP-GLUT4 לפי אות GFP. לאחר מכן זהה את תאי היעד הרצויים לרכישת תמונה. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים הניסיוניים המתאימים בכל תא יעד, כולל מספר פיקסלים, אורך גל עירור, אחוז שידור, זמן חשיפה, עובי מחסנית, מרווח זמן וזמן הדמיה כולל.
התאם את פרמטר החשיפה לכ-2000 עד 3000 ספירות כדי להשיג עוצמת פיקסלים מרבית. כדי למזער הלבנת תמונות פלואורסצנטיות, צמצם ככל האפשר את אחוז העברת אור העירור תוך שמירה על זמן החשיפה פחות משנייה אחת. הגדר את הגבול העליון והתחתון של מחסנית Z על כל תא מטרה על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ עד שהחלק העליון והתחתון של תא המטרה יוצאים מעט מהמיקוד.
חשוב מאוד למזער את הלבנת הצילום הפלואורסצנטית במוות נוירונים בעקבות תמונת אור. איור זה מראה כי הנוירונים ההיפותלמוסיים המתורבתים העיקריים סומנו עם סמן נוירונים MAP2. הסמן העצבי ההיפותלמי POMC והביטוי המשותף שלהם של CCR5.
התמונה המשותפת מראה כי CCL5 מתבטא בנוירונים היפותלמוסיים חיוביים ל-POMC. תמונות אלה מראות את הביטוי של חלבון GFP-GLUT4 בנוירונים היפותלמוסיים מסוג בר ונוירונים היפותלמוסיים כפולים שליליים CCR5. נוירונים היו מגורים באמצעות אינסולין או CCL5.
החיצים מצביעים על הנקב GFP-GLUT4 בדלקת העצבים לפני או אחרי גירוי אינסולין או CCL5, וכוכביות מציינות את פני השטח GLUT4-GFP לפני או אחרי גירוי CCL5. לאחר השליטה, הקלטת מעבדה זו של טכניקת התאים הראשונית יכולה להיעשות בין שעה לארבע שעות, תלוי בדרישות הניסוי ואם היא נעשית כראוי. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את האפשרות לאפיין את ההשפעה המיידית הנגרמת על ידי תרופות בתרבית תאים ראשונית.
אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד תא עצב היפותלמי ראשוני, תא עצב בהיפוקמפוס ותא עצב בקליפת המוח. מלבד המעבדה, ניתן לדעת גם לבצע הקלטה חיה של המולקולה הטורית על גירויים שונים. אל תשכח ללבוש את מעיל המעבדה והכפפות שלך ולהשתמש לעתים קרובות באתנול כדי למנוע זיהום מחיידקים ופטריות מבעלי חיים.
כמו כן, היזהר מאוד בעת התמודדות עם החלקות כיסוי ונוירונים לאורך הליך זה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לתצפית בזמן אמת על תנועת Glucose Transporter 4 (GLUT4) מתויג ב-GFP בתאי עצב היפותלמיים ראשוניים בעקבות גרייה באינסולין. כמו כן, המחקר בוחן את תפקידו של CCR5 במסלול השהיות של אינסולין–GLUT4, ובכך תורם לתובנות לגבי הבקרה העצבית של אותיות האינסולין והמטבוליזם הרלוונטיים לסוכרת מסוג 2.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- המחקר מתמקד במנגנוני ההובלה של GLUT4 בתגובה לאינסולין.
- הוא עוסק בשאלות התנהגותיות ומטבוליות הקשורות לסוכרת מסוג 2.
- מעורבותו של CCR5 באיתות אינסולין מספקת נתיבים טיפוליים חדשים.
- תרביות של תאי עצב ראשוניים מאפשרות נזק מינימלי במהלך הניסוי.
מטרת המחקר
- לבדיקת הדינמיקה של תעתוע GLUT4 בתגובה לאינסולין.
- להערכת תפקידו של CCR5 במסלול איתות האינסולין.
- להעמקת ההבנה של השפעות עצביות על ויסות האינסולין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בתרבימי תאי מקור מנוירונים היפותלמיים לצורך דימיון חי.
- בידוד רקמות מוח מגורים בוצע בתנאים סטריליים.
- דימיון חי בוצע באמצעות מיקרוסקופיית דקונבולוציה למעקב אחר תעתוע של GLUT4.
- התאים טופלו באינסולין וב-CCL5 במהלך הדימיון כדי לבחון את ההשפעות.
- בוצעו התאמות בפרמטרים ניסיוניים מרכזיים כדי למזער דהייה פוטונית (photo-bleaching).
תוצאות עיקריות
- ניטור תנועת GFP-GLUT4 בוצע בתגובה לגירוי באמצעות אינסולין ו-CCL5.
- התצפיות הצביעו על קולוקליזציה של CCR5 עם סמנים עצביים, דבר המשפיע על הטרנספורט של GLUT4.
- מחקר זה חושף הפרה פוטנציאלית במנגנוני השמירה של סיגנל האינסולין עקב CCR5.
- התוצאות מדגישות אינטראקציות מכריעות בין סיגנל עצבי למטבוליזם.
מסקנות
- המחקר מאפשר תצפית בזמן אמת על תעתוק של GLUT4 המושרה על ידי אינסולין בנוירונים.
- הממצאים מדגישים את תפקידו של CCR5, ומציעים כיוונים טיפוליים לסוכרת מסוג 2.
- להשלכות המחקר השפעה על הבנת מנגנונים נוירונליים המשפיעים על הפרעות מטבוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של תנועת GLUT4 בנוירונים היפותלמיים ראשוניים, ובכך מספקת תובנה מכניסטית לגבי שיבוש באותות אינסולין הרלוונטי לסוכרת מסוג 2. על ידי קישור סיגנל כימוקין (CCL5) לדינמיקה של טרנספורטר גלוקוז נוירונלי, היא תומכת בתיקוף מטרות במסלולי מחלות מטבוליות במערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו מפחיתה סיכונים בהיפותזות בשלב מוקדם באמצעות אספקת נתונים כמותיים של תאים חיים על translocation של חלבונים תחת סטימולציה מבוקרת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את הקשר התפקודי בין CCR5 לבין translocation של GLUT4 המעורר על ידי אינסולין בנוירונים היפותלמיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תצפית ישירה על דינמיקת חלבונים בתאים ראשוניים, ובכך מפחית את ההסתמכות על מערכות תחליפיות.
- ערך חיזוי: תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) המעורבות בוויסות מטבולי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של יעילות התעתוק של GLUT4 לממברנה בעקבות גירוי באמצעות אינסולין או כימוקין.
- ערך תפעולי: מבסס בדיקת דימיון חי הניתנת לשחזור למעקב אחר דינמיקת נשאים במודלים עצביים.
- מוכנות הבדיקה: מפיק נתונים של צילומי רצף (time-lapse) עם רזולוציה מרחבית, המתאימים לאפיון השפעת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין חוסר איזון של כימוקינים פריפריים לבין פגמים באיתות של אינסולין במערכת המרכזית, במודל עצבי רלוונטי למחלה.
- ערך תפעולי: משתמש בנוירונים היפותלמיים ראשוניים ממודלים של סוג בר (wild-type) וממודלים חסרי CCR5 כדי להעריך תגובות התלויות בגנוטיפ.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים במבחנה (in vitro) לבין פתופיזיולוגיה של השמנה וסוכרת מסוג 2 בגוף (in vivo).
שילוב זרימות עבודה וצינורות עיבוד
הטכניקה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת בתיקוף השערות לפני זיהוי מובילים (lead identification) ובדיקות יעילות פרה-קליניות בתוכניות למחלות מטבוליות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן קשרים מכניסטיים בין רספטורים של כימוקינים לבין הובלת גלוקוז המוסדרת על ידי אינסולין בנוירונים.
- סריקה: מספק נקודות סיום כמותיות מבוססות דימיון להערכת השפעות של תרכובות על תנועת GLUT4.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מבוססות עוצמה של נקודות GFP-GLUT4 ומיקום ממברנלי לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תואם למודלים פרה-קליניים על ידי שימוש בנוירונים ראשוניים המשקפים דפוסי ביטוי משותף של CCR5 ו-POMC בנוירונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימיון חי ניתנת להרחבה, שניתן להחילה על טרנספורטרים או רספטורים אחרים המסומנים פלואורסצנטית בתרביות נוירונליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהיפותזות של מטרות על ידי ויזואליזציה של דינמיקת חלבונים בזמן אמת בתאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולים לדימוי תאים חיים עם פרמטרים מוגדרים לעירור, חשיפה ו-z-stacking כדי למזער פוטו-בליצ'ינג (photo-bleaching).
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפה השאלה אם מטרה מסוימת מווסתת את סיגנל האינסולין באוכלוסיות נוירונליות מרכזיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף מותאם סיכונים של טיפולים מטבוליים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS), בהתבסס על ראיות מכניסטיות ממודלים נוירונליים הרלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד נוירונים ראשוניים, טיפול סטרילי ברקאות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים.
- תלוי בגישה למערכות מיקרוסקופיית דקונבולוציה עם עדשות שמן 60x ובקרות סביבתיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי הכנת תאים, תזמון הגירוי ופרמטרים של רכישת תמונות.
- חייב להתחשב בשונות ביעילות הטרנספקציה של תאים ראשוניים ובביטוי הבסיסי של GLUT4 בעת השוואת תנאים.
- מוגבל על ידי סיכוני פוטוטוקסיות במהלך דימוי ממושך, אשר מופחתים על ידי אופטימיזציה של עוצמת העירור וזמן החשיפה כפי שמתואר בפרוטוקול.
