עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעבד מטריצה חוץ-תאית לבבית להידרוג'ל, המאפשרת לחקור את השפעת המטריצה במבחנים שונים מבוססי תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלב, כגון כיצד מטריצה חוץ-תאית משפיעה על התנהגות התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מקלה על השימוש במטריצה החוץ-תאית לביצוע ניסויים בקנה מידה גדול במבחנה או in vivo.

ניתן להרחיב את היישומים של טכניקה זו לטיפול באוטם שריר הלב מכיוון שהמטריצה יכולה לספק רמזים חיוניים להישרדות. כדי להתחיל בניסוי, השתמש באזמל סטרילי עם להב מספר עשר, כדי להסיר רקמת שומן משריר הלב של החדר השמאלי שהושג בעבר. חותכים את שריר הלב לקוביות בערך 1 על 1 על 1 ס"מ, בעזרת אזמל.

לאחר מכן, הניחו את הקוביות בצינור סטרילי של 50 מ"ל. אחסן את הצינורות המכילים את הקוביות בחום של 80 מעלות צלזיוס. הוציאו את הצינור המכיל את הקוביות המוכנות מהמקפיא והעבירו אותו על קרח לקריוסטט.

הגדר את טמפרטורת האובייקט והתא של הקריוסטט ל-15 מעלות צלזיוס. מצננים צינורות ריקים של 50 מ"ל וחותמות בתא. הוסף שכבה של מדיום קריוסקציה על החותמת הקרה, ותן לה לקפוא עד שהיא לבנה ומוצקה.

הוסף שכבה שנייה של מדיום קריוסקציה והנח צינור שריר הלב בשכבה השנייה. ודא שאמצעי ההקפאה ושריר הלב קפואים לחלוטין. לאחר מכן, הכנס את החותמת עם שריר הלב הקפוא לתוך המחזיק והדק את כל הברגים.

חתוך את פני הרקמה עד לקבלת משטח חתך אחיד. חתכו את שריר הלב הקפוא עם חתך אוטומטי כדי להבטיח חתכים אחידים. ניתן לפרוס כ -30 עד 40 חלקים מקוביה אחת.

מניחים כל פרוסה, לאחר החיתוך, באופן רופף בצינור מקורר מראש של 50 מ"ל. סגור את הצינורות המלאים והניח אותם על קרח. מעבירים את החלקים הקפואים של כל 50 מ"ל הצינורות, לכוס סטרילית אחת.

הוסף 50 מ"ל תמיסת ליזה לכל צינור של 50 מ"ל המכיל פרוסות שריר הלב. לאחר מכן, מנערים את פרוסות שריר הלב בכוס סטרילית. מסננים את הנוזל עם פרוסות הרקמה דרך מסננת גסה.

לאחר מכן, העבירו את פרוסות הרקמה בעזרת פינצטה קהה לכוס סטרילית חדשה. הוסף 50 מ"ל של 0.5% SDS ב-PBS לכל צינור ראשוני של 50 מ"ל של פרוסות שריר הלב. לנער את הכוס ברציפות במשך שש שעות בטמפרטורה של 100-150 סל"ד בטמפרטורת החדר.

לאחר הטלטול, מסננים את הנוזל עם פרוסות הרקמות דרך מסננת גסה. בעזרת פינצטה קהה מעבירים את פרוסות הרקמות לכוס סטרילית חדשה ושוטפים את הפרוסות שלוש פעמים עם 50 מ"ל PBS. לאחר מכן, שטפו את הפרוסות למשך הלילה ב-PBS, עם 1% סטרפטומיצין פניצילין ו-1% ניסטטין.

למחרת, הסר את תמיסת הכביסה והוסף 25 מ"ל FBS שחומם מראש ב -37 מעלות צלזיוס עם 1% פטרפטומיצין פניצילין ו -1% ניסטטין, לפרוסות הנטולות תאים לכל צינור ראשוני של 50 מ"ל של פרוסות שריר הלב. דגרו את הפרוסות במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל הדנ"א שנותר מהמטריצה. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לכוס סטרילית חדשה ושטפו שלוש פעמים עם 50 מ"ל PBS.

מניחים את פרוסות ה- ECM באופן רופף בצלחת סטרילית חדשה של שש בארות. הקפיאו את ה-ECM ב-80 מעלות צלזיוס, ועשו לו ליופיליזציה במשך יומיים בליופיליזציה. לצורך ריסוק פרוסת ה- ECM, השתמש בצינורות כרסום המכילים חרוזי קרמיקה בגודל 1.4 מ"מ.

מלאו את הצינורות באופן רופף ב-ECM ליופילי, באמצעות פינצטה סטרילית וקהה. הצמד להקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי. הכנס את הצינורות הקפואים למכונת הטחינה ורסק את ה-ECM.

הגדר את משך הזמן ל-30 שניות, התאם את המהירות המרבית והפעל את המכשיר. לאחר הריסוק, הוציאו את הצינורות והקפיאו אותם שוב בחנקן נוזלי. שטפו את המיקרו-חלקיקים מהצינורות, על ידי הוספת 1 מ"ל של ddH20 לכל צינור, ונערו למסיסות מלאה.

לאחר מכן, סנן את התמיסה ההטרוגנית דרך רשת של 200 מיקרומטר, לתוך צינור של 50 מ"ל. הקפיאו את הצינור בחנקן נוזלי. החזר את המכסה הסטנדרטי של הצינור, במסנן של 0.22 מיקרומטר כדי למנוע מהאבקה לזרום החוצה מהצינור.

הכנס את הצינור לליופילייזר, ועשה שוב ליופיליזטור כדי להסיר את המים משלב הכביסה. ממיסים את אבקת ה-ECM האנושית שהוכנה בעבר בתמיסת פפסין, לריכוז סופי של 10 מ"ג למ"ל. העבירו את התמיסה לצינורות של 2 מ"ל בנפח של 1 מ"ל לצינור.

פיפטה את התמיסה לערבב היטב. לאחר מכן, הכניסו את הצינורות לשייקר ונערו בחום של 1200 סל"ד למשך 48 שעות בחום של 27 מעלות צלזיוס. הוציאו את הצינורות מהשייקר והניחו אותם על קרח או על מחזיק צינור מקורר מראש.

מערבבים 1/9 מנפח תמיסת ה-ECM של PBS 10X קר, עם 1/10 מנפח תמיסת ECM של נתרן הידרוקסיד קר 0.1 מולרי, בצינור מקורר מראש ומניחים אותו על קרח כדי לנטרל את תמיסת ה-ECM המעוכלת ולנטרל את הפפסין. לבסוף, הוסיפו את תמיסת ה-ECM לתערובת הנטרול וערבבו היטב באמצעות פיפטינג או מערבולת. בדיקות כמותיות עבור רכיבי ECM בודדים חשפו הסרת DNA מלאה יותר ושימור טוב יותר של סך הקולגן, האלסטין והגליקוסומינוגליקנים בהשוואה לדה-סלולריזציה על ידי SDS, בלבד.

RT-PCR שימש לכימות הביטוי של חלבוני קרדיומיוציט מבניים, גורמי שעתוק קרדיומיוגניים מוקדמים ומאוחרים, ותאי אנדותל סמנים על פני השטח של תאי אנדותל ב-ESC עכברי, שעוברים התמיינות ספונטנית. מגע עם cECM מניע תאי גזע פלוריפוטנטיים, רצוי לעבר פנוטיפ דמוי קרדיומיוציט. מיקרוסקופ אור ניגוד פאזה מדגים כי עיכול אנזימטי של ה-cECM במשך 48 שעות, מביא לפתרון ECM הומוגני יותר.

צביעה חיה/מתה של פיברובלסטים לבביים אנושיים על הידרוג'ל cECM, מראה כדאיות מוגברת. גם מיקרו-חלקיקי cECM וגם הידרוג'ל cECM משפרים את הפעילות המטבולית של תאי HL-1 מתכווצים, בתנאים איסכמיים, בהשוואה לתאים בתרבית סטנדרטית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע מרקמה להידרוג'ל, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התחדשות הלב, לחקור את ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית לבבית, in vitro ו-in vivo, מערכות מודל.