Name: מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: למדו לבודד תאי CD34+ מדם חבל טבורי אנושי לחקר הבדלת מגקריוציטים וייצור טסיות דם. השיטה מאפשרת ניתוח השפעת טיפולים שונים על תהליכי מגקריופואזה ותפקוד טסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).

פרוטוקול זה אושר על ידי דרום מזרח סידני האנושי מחקר ועדת האתיקה, שאושררה על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של האוניברסיטה של ניו סאות וויילס. דם טבורי שהושג מתורמים בריאים סופק על ידי סידני בנק דם טבורי (NSW, סידני, אוסטרליה). כרכים של 100 מ ל שימשו עבור הליך זה.
הערה: עבודה ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic Class II אבטחה. Decontaminate החיצוני של שקית הדם טבורי עם 70% אתנול. להשתמש בכלים סטריליים (מספריים, פינצטה) עבור הליך זה.
1. כבל תאי הדם הכנה ובידוד של CD34 תאים+
<ol>
	<li>להכין את ההפרדה סטרילי מאגר (SB) בתמיסת פוספט buffered (PBS), ב- pH 7.2, המכילה 0.5% שור אלבומין ו- 2 מ מ EDTA.</li>
	<li>לוותר על 10 מ"ל של SB לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (צינור אחד לכל 10 מ"ל של דם זה נדרש). באמצעות מחט בוטה G18 רכוב על מזרק 10 מ"ל, לצייר 10 מ"ל של דם מתוך התיק, לוותר על תוך הצינורות 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של SB.</li>
	<li>להוסיף 15 מ"ל של לימפוציטים ההפרדה מדיה (ראה טבלה של חומרים) לתחתית הצינור המכיל את הדם מדולל, יצירת שתי שכבות. הערה: לוותר על מדיה לאט בחלק התחתון של צינור כדי להימנע מערבוב הרבדים השונים.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב g × 1,200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם בלי הפסקה, אין האצה.</li>
	<li>להעביר את השכבה ליד המרכז של הצינור המכיל תאי תאים (כ 5-10 מ"ל מהצינור כל) לתוך צינור 50 מ ל באמצעות פיפטה של פסטר. להוסיף SB כל שפופרת את הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge ב 400 g × 10 דקות ב RT. להשליך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תא כדורי בזהירות עם פיפטה פסטר ב 5-10 מ ל SB. לשלב את התאים מושעה ולהביא נפח 50 מ עם SB.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות צביעת Trypan blue ו- hemocytometer או אוטומטיות תא מונה (ראה טבלה של חומרים). כדי לקבוע את אחוז CD34+ תאים במדגם, resuspend 2.5 × 105 תאים µL 100 של SB, כתם על-ידי הוספת 10 µL של נוגדן anti-CD34-PE למשך 15-30 דקות ב 4 º C. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 1 א').</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב 400 g × 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. הערה: אם לא מיידית, תאי תאי שיכול להיות קפוא בשלב זה.</li>
	<li>Resuspend תאים µL 300 של SB לכל 108 תאים. להוסיף 100 µL של ה-FcR האנושי IgG (חסימת ריאגנט, ראה טבלה של חומרים) ו- µL 100 של CD34 beads מגנטי לכל 108 תאים. לערבב בעדינות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות. הערה: השעיה תא בודד נדרש (אם יש צורך, להעביר התאים למרות מסנן 30 מיקרומטר לפני הוספת ריאגנטים). השתמש את הכרכים ריאגנט המתוארים כאן עבור 108 תאים או פחות. עבור יותר מ-108 תאים, קנה המידה של ריאגנטים (SB, חסימת פתרון ולאחר beads מגנטי CD34) בהתאם.</li>
	<li>להכין את העמודה ההפרדה האם במהלך תקופת הדגירה על ידי הצבת העמודה LS בעל מגנטי כביסה עם 3 מ של SB. להשליך למסקנות. הערה: ניתן לטעון? האם ההפרדה עמודות עם תאים הכולל8 × 10 עד 2. עמודות קטן יותר, גדול יותר זמינים.</li>
	<li>להוסיף 5-10 מ ל SB לתערובת תא וזורקים צנטריפוגה ב 400 × g במשך 10 דקות את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל SB וטען התליה תא (1.5 מ ל) אל העמודה LS. לאסוף את הזרימה המכילות את התאים ללא תווית בשפופרת איסוף 15מל (שבר שלילי #1). תן את הנוזל לרוקן ולשטוף את העמודה עם 1.5 מ ל SB.</li>
	<li>לטעון את הזרימה (3 מ"ל) שנאספו בחזרה לתוך העמודה ולאסוף את הזרימה לשפופרת אוסף 15 מ"ל זהה (שבר שלילי #1). לשטוף את העמודה LS 3 פעמים עם 3 מ"ל של SB. הערה: אם יש צורך, תאים השבר שלילי (12 מ ל) יכול להיות מוכתם נוגדן anti-CD34 לאמת לכידתו של CD34+ תאים לפי העמודה LS.</li>
	<li>הסר העמודה במפריד מגנטי ותורידי תאים לאט עם פומפה מזרק לתוך צינור 15 mL החדש עם 2 מ ל SB.</li>
	<li>במקום העמודה בחזרה על עומס mL 2 תאים ומפריד מגנטי בחזרה לתוך העמודה. לאסוף את הזרימה, לשטוף עם 2 מ ל SB. זהו השבר שלילי #2 (4 מ ל).</li>
	<li>הסר האם העמודה מפריד מגנטי ולהוסיף 2 מ"ל של תאים SB. סומק בהתמדה בנחישות עם פומפה מזרק כדי לאסוף את CD34+ תא שבר. לספור את התאים באמצעות trypan blue מכתים, hemocytometer או מונה תא אוטומטית.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור עם השבר חיובי ב g × 400 למשך 15 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים בתקשורת ללא סרום עבור CD34+ תאים (SFM, ראה טבלה של חומרים). הערה: אם לא מיידית, תאים שיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי בשלב זה.</li>
</ol>
2. טוהר הסימון של CD34 מבודד התאים+
<ol>
	<li>כתם 2 x 104 תאים מן השבר חיובית עם נוגדן anti-CD34-PE µL, 20 µL נוגדן anti-CD45-PerCP למשך 15 דקות ב 4 ° C (שימוש נפרד צינור עבור פקדים isotype) 10 (איור 1B).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend צנפה ב 200 µL של SB.</li>
	<li>לבצע ניתוח תזרים cytometric, שער האוכלוסייה תא חי כדי לא לכלול פסולת (איור 1B). להגדיר את השער עבור אוכלוסיות חיובי PE ו- PerCP באמצעות PE ו- PerCP isotype שולטת (איור 1B), לקבוע את אחוזי CD34+/CD45+ תאים.</li>
</ol>
3. מגקריוציט בידול
<ol>
	<li>זרע 5 × 105 תאים למ"ל CD34+ תאי 2 מ של SFM בתוספת 50 ng/mL רקומביננטי האנושי thrombopoietin (rhTPO) לכל טוב בצלחת 12-. טוב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באווירה humidified. אם התאים נמצאים confluent לפני שהם נדרשים לניתוח, לקצור את התאים, התפצל ולס מרובים עם rhTPO ומדיה חדשה. הערה: צריך להיות מוכן בארות שניים או שלושה במיוחד כדי לפקח על בידול בנקודות זמן שונות (למשל, ימים 7, 9 ו-10).</li>
	<li>קציר תאים מן הבארות להפריש לפקח בידול מבלי להפריע התאים הבארות אחרים.</li>
	<li>כתם תאים עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL, 10 µL, אנטי-GPIX/CD42a-Alexa עבור חיל הים 647 נוגדן באמצעי אחסון הסופי של µL 100. הגדר פקד צינור באמצעות נוגדנים שליטה isotype בהתאמה. תקופת דגירה של 15-30 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף.</li></ol>צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 200-300 µL של נתח SB. על ידי cytometry זרימה.
	<li>עבור כל fluorophore, לנתח את הפקדים isotype כדי להגדיר את gating לאוכלוסיות חיובית FITC, אלכסה הקמח 647. לנתח את הדגימות תא מוכתם כדי לקבוע את אחוז CD41+/CD42a+ להכפיל תאים חיובית, אשר מייצג את ח"כ בוגרת (איור 1C).</li>
	<li>להמחשת מיקרוסקופי של תאים סמני פני כתם תאים כמתואר ב- 3.3.<ol>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend בגדר 100 µL של SB, ספין על זכוכית-1000 g x עבור 5 דק תאים תיקון בשקופית על-ידי טבילה ב מתנול 30 ס' אוויר יבש, להוסיף 20 µL של טעינת המדיה המכילה דאפי (ראה טבלה של חומרים) , מכסים עם coverslip ולאחר להמחיש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור ויזואליזציה של אנטיגנים תאיים, resuspend תאים ב- PBS ותקן עם paraformaldehyde (ריכוז סופי 1%) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי permeabilize את התאים, להוסיף טריטון-X 100 (0.1%), תקופת דגירה של תאים 15 דקות לשטוף עם 2 מ"ל PBS/0.1% טריטון-X 100. Resuspend ב µL 100 של PBS/0.1% טריטון-X 100, להוסיף אנטי-vWf, אנטי CD62p נוגדנים (דילול 1:200), תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
		<li>לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, צנטריפוגה ב 400 g × 10 דקות, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף העכבר אנטי איג-Alexa 594 וארנבת אנטי-488 IgG-Alexa (1: 100). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף 20 µL של אנטי-CD42b-APC. ואז לסובב את התאים על גבי מדרון זכוכית כפי שמתואר בשלב 3.6.1, הכנת דוגמאות להמחשת מיקרוסקופיים כפי שמתואר בשלב 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור פלואידיות נחישות, הקציר תאים ב ימים 12 או 13 של בידול. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה ב 400 × g 10 דקות, הכתם עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC µL 20 בנפח סופי של 100 µL. Incubate ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.<ol>
		<li>לשטוף פעם עם 1 מ"ל של SB, resuspend צנפה ב- 300 µL של ציטראט היפוטוניק מאגר (1.25 מ"מ סודיום ציטרט, 2.5 מ מ נתרן כלורי, 3.5 מ מ דקסטרוז) המכיל 20 µg/ml propidium יודיד ל- 0.05% 100 טריטון-X. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.</li>
		<li>להוסיף RNase ריכוז סופי של 20 µg/mL, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור. לקבוע את עוצמת יודיד propidium על ידי cytometry זרימה על ידי איסוף אירועים 30,000 כדי 50,000 מכלל האוכלוסייה CD41-FITC+ (איור 2C).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet סופרים, ספירת טסיות, והפעלה טסיות
<ol>
	<li>הקציר תאים (מתוך שלב 3.1) ב ימים 8 או 9 של בידול, זרע-1 × 104 תאים/טוב ב- 48-ובכן הצלחות µL 200 של SFM טרי בתוספת 50 ננוגרם למ"ל rhTPO. תרבות במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2- הערה: לצורך כימות, זרע בארות דולר. צפיפות נמוכה זה נדרש עבור ויזואליזציה, ספירת proplatelet מניבי קרונית דחיפה קלה Proplatelets בדרך כלל מתחילים להופיע לאחר יומיים של תרבות. הפסגה היא בין ימים 4 ו- 5.</li>
	<li>לספור את מספר proplatelet מניבי ח"כ בבאר שלם על מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות 10 X או מטרות X 20. הערה: שלב מיקרוסקופ מחוממת (37 מעלות צלזיוס) היא עדיפה, מאז להשאיר את התאים בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת גורמת הצטמקות של הרחבות proplatelet. Proplatelets הם נצפו כהרחבות ארוך מהגוף MK. כל ח"כ ייתכן כמה בליטות proplatelet. כפי proplatelets לפתח, הגוף של ח"כ הקטנת גודל.</li>
	<li>קציר תאים, צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר. כתם תאים עם נוגדן אנטי-האדם CD41-FITC µL 20, כפי שתואר בשלבים 3.3 ו- 3.4. לחשב את האחוזים של ח"כ מניבי proplatelet (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet מניבי חברי כנסת/טוב) / (סה כ CD41+ תאים / טוב)] x 100</li>
	<li>כדי לספור טסיות שוחרר לתוך המדיום תרבות, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות.<ol>
		<li>כתם עם נוגדנים CD41-FITC נגד µL 20 למשך 20-30 דקות ב 4 º C. להגדיר את צינור שליטה באמצעות הנוגדן שליטה isotype בהתאמה.</li>
		<li>להוסיף 150 µL של SB ו 50 µL של ספירת חרוזים.</li>
		<li>לניתוח cytometric זרימה, הגדר את FSC ואת האס על סולם לוגריתמי. שימוש רגיל האנושית טסיות דם של טסיות דם עשיר פלזמה מוכתמים CD41-FITC כמתואר בסעיף 4.4.1 כדי להגדיר את דרך השער של טסיות הדם (איור 3 א).</li>
		<li>לנתח את טסיות הדם ויטראז'ים עם סופר חרוזים מאת cytometry זרימה. לאסוף 1,000 אירועים של ספירת חרוזים באמצעות את FSC מול מגרש פיזור האס (איור 3 א). לחשב את מספר טסיות בהתבסס על CD41-FITC חיובי אירועים (איור 3B) תוך שימוש בנוסחה: טסיות לכל µL = [(מספר אירועים חיוביים CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/לדגום נפח)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לנתח טסיות הפעלה, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מאגר (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, MgCl 1 מ2, 1.8 מ"מ CaCl2, 0.2 מ מ נה2HPO4, 12 מ מ NaHCO3, 5.5 מ מ D-גלוקוז, pH 6.5) של Tyrode, צנטריפוגה g x 200 עבור 5 דקות כדי הצניפה תאים.<ol>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות הצניפה חלקיקים בגודל טסיות.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר של Tyrode. להוסיף 20 µL של נוגדן PAC1-FITC, אדנוזין diphosphate (ADP) ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות נתח מאת cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז FITC אירועים חיוביים. טסיות דם אנושי טרי לשימוש מטופלים באופן זהה כפקד חיובי (איור 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
<li>Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis%3A+State+of+the+Art%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li>
<li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation%2C+transcriptional+activity+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li>
<li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34%2BCD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells%3A+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li>
<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia%3A+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li>
<li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol.+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li>
<li>Lu, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li>
<li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208(2016).</li>
<li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells%3A+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).</li>
<li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+proplatelet+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).</li>
<li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li>
<li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34%2B-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li>
<li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation%2C+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1%2FS+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li>
<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח"כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.
מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספת של ציטוקינים כגון גורם לתאי גזע, Flt 3 ליגנד, IL-3 ו- IL-6 תומך CD34+ תא התפשטות. עם זאת, התרחבות זו התוצאה טוהר ח"כ מופחת ב תרבות14. השיטה המוצגת כאן, באמצעות מדיה ללא סרום rhTPO ל...

בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח"כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.
ח"כ טסיות התוצרת מן בליטות cytoplasmic שנקרא proplatelets, אין ויוו, כ עונה 1 פרק 1011 טסיות הם יצרו מדי יום כדי לקיים את ספירת טסיות של 150-400 x 109/L. טסיות ייצור במבחנה הוא עד 1000 -מקפלים נמוך יותר מאשר ה- ויוו הערכות3, זה נתן עלייה לתנאים תרבות רבים באמצעות CD34+ ובתאים hematopoietic כדי לשפר את ח"כ, טסיות ייצור במבחנה. המקור הראשוני של CD34+ התאים המשמש ח"כ בידול היה דם היקפיים אנושי4. מקורות תא אחרים כוללים את מח העצם5,6, עובריים תאי גזע/המושרה pluripotent תאי גזע (ESC/iPSC)7הטבור דם (UCB)8,9,10 . מח עצם האדם CD34+ 11 ו העכבר שושלת היוחסין שלילי מח עצם תאים5 התוצרת ח"כ ולבנים וטסיות דם בתוך חוץ גופית; ובכל זאת, חוסר זמינות של מח עצם האדם מגביל את השימוש בו כמקור CD34+ תאים. לעומת זאת, ESC, iPSC מייצגים מקור מוגבל של תאים עבור ייצור טסיות במבחנה . טסיות ייצור של תאים אלה דורש מזין תאים תאים OP9 מאתר ו תקופות ארוכות יותר של תרבות. טסיות נגזר בתנאים ללא מזין להיראות פחות פונקציונלי12. טסיות נגזר iPSC נוטים להיות השימוש בהגדרות קליני מאז הם ניתן להרחיב בקנה מידה גדול. תהליך זה דורש lentiviral בתיווך התמרה חושית של גורמי שעתוק, תא לטווח ארוך תרבות13.
UCB הוא מקור נגיש של CD34+ התאים יכולה בקלות לשמש מחקר הגדרות. TPO לבד יכול לקדם את הבידול של כבל דם-derived CD34+ תאים וזה מעורר חברי כנסת מאוד טהור, בוגר ללא צורך תוספי סרום או תרבות משותפת עם מזין תאים. ציטוקינים אחרים כגון SCF עשויה להקטין בידול מ- UCB CD34+ תאים, בעוד ליגנד Flt-3 ו- IL-11 לקדם את הייצור של ילדותי megakaryocytes14. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תרבויות ח"כ מאוד טהור של דם טבורי CD34+ תאים בתנאים ללא סרום.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים לתרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי TPO אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>מדיה נטולת סרום עבור תאי CD34+</td></tr> <tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>CD34 Isolation Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>ערכה זו כוללת את המגיב חוסם IgG האנושי FcR ומיקרו-חרוזי CD34. חרוזים אלה מכילים את שיבוט הנוגדנים נגד CD34 QBEND/10. השתמש בשיבוט אחר נגד CD34 לבדיקת טוהר (למשל שיבוט 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>אמצעי הפרדת לימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>מאגר הפרדה סטרילי (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>מאגר זה מכיל תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2 המכיל 0.5% אלבומין בסרום בקר ו-2 מ"מ EDTA. ניתן להכין אותו באמצעות רכיבים סטריליים בדרגת תרבית תאים. הסר גז לפני השימוש מכיוון שבועות אוויר עלולות לחסום את העמוד.</td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי-אנושי CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. זה יכול לשמש לבדיקת טוהר CD34. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.</td></tr><tr><td>עכבר PerCP אנטי אנושי CD45</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>347464 דילול 1:10</td></tr><tr><td>בקרת איזוטיפ PerCP BD</td><td>Biosciences</td><td>349044</td><td>דילול 1:10</td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>דילול ריכוז נוגדנים סופי 1:5.</td></tr><tr><td>APC Mouse אנטי-אנושי CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>נוגדן זה יכול לשמש גם לאיתור MK בוגר (אחוז התאים החיוביים בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם אנטי CD42a). ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>מופץ כיום על ידי Bio-Rad. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>מופץ כיום על ידי Bio-Rad. נוגדן בקרת איזוטיפ</td></tr><tr><td>אנטי פון ווילברנד גורם ארנב פוליקלונלי</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>V450 עכבר אנטי הומנה CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 דילול</td></tr><tr><td>V450 בקרת איזוטיפ</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 דילול</td></tr><tr><td>PAC1-FITC נוגדן BD</td><td>Biosciences</td><td>340507</td><td>דילול 1:10</td></tr><tr><td>עכבר אנטי CD62p חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז אנטי ארנב IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עז אנטי עכבר IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control קוקטייל-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>נוגדן לבקרת איזוטיפ</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright חרוזי ספירה מוחלטת</td><td>בדיקות מולקולריות, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>ספירת חרוזים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>עמודים קטנים וגדולים יותר זמינים גם מסחרית</td></tr><tr><td>מגנט מפריד MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל צינורות FACS מפוליפרופילן תחתון עגול, עם מכסה הצמד, טכנולוגיות סטריליות</td><td>במבחנה</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td> <td>זכוכיתמדיית הרכבה של Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>עם מדיום הרכבה DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Antifade עם DAPI</td></tr><<tr><td>strong>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Leica</td><td>DMIRB מיקרוסקופ</td><td></td>הפוך</tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>מנתח תאים</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ציטוספין</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyzer software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva תוכנה</td><td></td></tr><tr><td>לניתוח תאים בודדים</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל cd34 נגזר דם תאים+

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.

פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרבויות ח"כ הטהור מאד מכבל דם-derived CD34+ תאים. האחוז של CD34+ תאים כבל דם הוא כ 1.3%15 (איור 1 א') ואת המספר הכולל של תאי תאי (שלב 1.8) נע בין 90-300 x 106 ליחידה UCB. טוהר CD34 + CD45 + תאים לאחר בידוד נעה בין 90 ל 99% (איור 1B). ח"כ (כהגדרתו CD41+ תאים) הם נצפו בתחילת CD34 ללא סרום+ תא תרבויות בנוכחות rhTPO. יום 7, האחוז של ...

אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בדגימות דם טבורי אנושי כדי לבודד תאים טהורים חיוביים ל-CD34 כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ספציפיות מעניינות על התמיינות מגקריוציטים, היווצרות טסיות וייצור טסיות דם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המגקריוציטים והטסיות, כגון מהן ההשפעות של טיפולים ספציפיים על התמיינות מגקריוציטים וייצור ותפקוד טסיות דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה לבידוד עקבי של תאים חיוביים ל-CD34 מדם טבורי טרי.באמצעות שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מגקריופואזיס, ניתן לחקור גם סוגי תאים אחרים כגון לימפוציטים, אריתרוציטים ומקרופאגים. התחל בהוספת 10 מיליליטר של חוצץ הפרדה לצינור חרוטי של 150 מיליליטר לכל 10 מיליליטר דם טבורי. בעזרת מחט קהה בגודל 18 המותקנת על מזרק של 10 מיליליטר, העבירו 10 מיליליטר דם לכל צינור, ואחריו הוסיפו 15 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים לתחתית כל צינור.הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, ואז בסוף הסיבוב, אסוף בזהירות חמישה עד 10 מיליליטר של תא חד-גרעיני המכיל שכבת מעיל באפי לצינור חדש אחד לכל דגימה. הביאו את הנפח הכולל בכל צינור עד 50 מיליליטר עם מאגר הפרדה טרי וצנטריפוגה שוב את התאים. השעו מחדש את הכדורים בחמישה עד 10 מיליליטר של מאגר הפרדה טרי ואגד את דגימות התאים.כוונן את עוצמת הקול ל-50 מיליליטר עם מאגר הפרדה טרי לספירה והקצה 100 מיקרוליטר תאים כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים CD34 על ידי ציטומטריית זרימה. צנטריפוגה שוב של התאים והשעיה מחדש של הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר הפרדה, 100 מיקרוליטר של מגיב חוסם IgG אנושי לקולטן FC, ו-100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים CD34 לכל אחד כפול 10 לתאים השמינית. מערבבים את התאים בעדינות לפני שמניחים אותם על ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 עד 40 דקות דגירה.במהלך הדגירה, הנח עמוד הפרדת חרוזים מגנטי בגודל מתאים לתוך המחזיק המגנטי המתאים ושטוף את העמוד בשלושה מיליליטר של מאגר הפרדה. בתום הדגירה, הסר את החרוזים הלא קשורים על ידי צנטריפוגה בחמישה עד 10 מיליליטר של מאגר הפרדה והשעיה מחדש של החרוז המגנטי וכדור התא ב-1.5 מיליליטר של מאגר הפרדה טרי. טען את התאים המסומנים על העמודה ואסוף את הזרימה הלא מסומנת בצינור איסוף של 15 מיליליטר.טען את הקולחין בחזרה על העמוד ואסוף את סיבוב הזרימה השני לאותו צינור איסוף. לאחר מכן שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר הפרדה והוציאו את העמוד מהמגנט. בעזרת בוכנת העמודה, שטפו בהדרגה שני מיליליטר של מאגר הפרדה דרך העמודה לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר והחזירו את העמודה למגנט.טען את התאים השטופים בחזרה על העמודה. אסוף את הזרימה ושטוף את העמוד עם שני מיליליטר של מאגר הפרדה כפי שהודגם זה עתה. לאחר הסרת העמודה מהמגנט, שטפו את העמודה בשני מיליליטר של מאגר הפרדה טרי כדי לאסוף את חלק התא החיובי ל-CD34 כפי שהודגם זה עתה, ואספו את התאים החיוביים ל-CD34 על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במדיום נטול סרום עבור תאים חיוביים ל-CD34. לצורך התמיינות מגקריוציטים, זרע 5 x 10 עד 5 תאים חיוביים CD34 למיליליטר ב-2 מיליליטר של מדיום נטול סרום, בתוספת תרומבופויטין אנושי רקומביננטי לבאר בצלחת של 12 בארות לדגירתם ב-37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני, באטמוספירה לחה. בנקודות הזמן המתאימות לניטור התמיינות, קצרו את התאים משתיים עד שלוש בארות בכל נקודת זמן מבלי להפריע לתאים בבארות האחרות, וצבעו את התאים שנאספו בנוגדנים נגד CD41 ואנטי-CD42a כדי לקבוע את אחוז המגקריוציטים הבוגרים בתוך התרביות.להדמיה מיקרוסקופית בסמני פני התא, שטפו את התאים שנקטפו ב-1 מיליליטר של מאגר הפרדה, והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר טרי. השתמש בציטוספין כדי לזרוע את התאים על שקופית זכוכית, וקבע את התאים למגלשה עם טבילה של 30 שניות במתנול. לאחר ייבוש באוויר, סמן את התאים ב-20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה בתוספת DAPI, וכסה את התאים בהחלקת כיסוי להדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.כדי לספור את הטסיות, קצרו את התאים ביום השמיני או התשיעי של ההתמיינות, וזרעו את התאים שנאספו בתא אחד x 10 עד תא רביעי לכל 200 מיקרוליטר של מדיום טרי נטול סרום, בתוספת תרומבופויטין אנושי רקומביננטי לכל באר בצלחת של 48 בארות. לאחר חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, ספרו את מספר המגקריוציטים נושאי הטסיות לבאר במיקרוסקופ אור הפוך, תוך שימוש במטרה פי 10 או 20. כדי לנתח את הפעלת טסיות הדם, ביום ה-14 או ה-15 של התרבית, ערבבו בעדינות את התאים עם פיפטה פסטר, ואספו 100 מיקרוליטר תאים.הוסף 1 מיליליטר של מאגר טירוד לתאים וגלול אותם על ידי צנטריפוגה. אספו את הסופרנטנט לצנטריפוגה כדי לגלול את החלקיקים בגודל טסיות הדם, והשעו מחדש את החלקיקים ב-100 מיקרוליטר של מאגר טירוד טרי, ואז סמנו את החלקיקים בנוגדנים נגד PAK1, הפעילו אותם עם אדנוזין דיפוספט למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ונתחו את אחוז האירועים החיוביים של PAK1 על ידי זרימה ציטומטרית. האחוז הטיפוסי של תאים חיוביים ל-CD34 בדם טבורי הוא כ-1.3% והטוהר של תאים חיוביים ל-CD34 חיוביים ל-CD45 לאחר בידוד נע בין 90 ל-99% מגקריוציטים חיוביים ל-CD41 נצפים בשלב מוקדם בתרביות תאים חיוביות ל-CD34 ללא סרום, כאשר אחוז המגקריוציטים הבוגרים החיוביים ל-CD41 חיוביים ל-CD42a מגיע ל-30 עד 40% ביום השביעי, והרמות הגבוהות ביותר של תאים חיוביים כפולים שנצפו בין הימים ה-10 וה-12 של ההתמיינות.מגקריוציטים מתורבתים מופיעים כתאים גדולים, בדרך כלל מרובי גרעינים המבטאים CD42b פקטור פון וילברנד, ו-P-סלקטין בציטופלזמה שלהם. לפחות שלושה סוגים של פלואידיה נצפים גם בתרביות תאים אלה. אחוז המגקריוציטים הנושאים פרוטסטלטים, סיבים ארוכי חרוזים המשתרעים מגוף המגקריוציטים, הוא בדרך כלל בסביבות 1.3% רוב הטסיות בתרבית התאים נופלות בתוך השער האנליטי של טסיות הדם ההיקפי, חיוביות לסמן טסיות הדם CD41, יכולות להיות מופעלות על ידי אגוניסטים של טסיות דם כמו אדנוזין דיפוספט, כפי שמודגם על ידי קשירה מוגברת של הנוגדן החד-שבטי הספציפי להפעלה PAK1.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לבודד תאים חיוביים ל-CD34 מדם טבורי. תוכל גם להקים תרביות התמיינות מגקריוציטים, לספור פרוטסטלטים ולנתח טסיות דם ומגקריוציטים המיוצרים במבחנה. אל תשכח שעבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה בארון בטיחות ביולוגי מסוג II בעת ביצוע הליך זה.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה להבדלה של מגה-קריוציטים והיווצרות טסיות דם. תאי גזע המטופויטיים - שבודדו מדם טבורי אנושי - מתמיינים למגה-קריוציטים בוגרים בנוכחות טרומבופויטין. המגה-קריוציטים הבוגרים מייצרים שלוחות ציטופלזמיות הנקראות טסיות דם, אשר מעוררות טסיות בודדות.

שיטת מבחנה להבדלה של Megakaryocytes והיווצרות טסיות

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את כל השלבים הכרוכים בהשגת CD34+ hematopoietic שמקורם ב- leukofilter ואת בידול המבחנה וההתבגרות שלהם למגקריוציטים נושאי פרופלטלט המסוגלים לשחרר טסיות דם במדיום התרבותי. הליך זה שימושי לניתוח מעמיק של מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים megakaryopoiesis.

תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

כאן, אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג לאפיון של בידול מגה-קריוציטים, ומראים כיצד אסטרטגיה זו מאפשרת מיון של מגה-קריוציטים בשלבים שונים באמצעות סדרן תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על רקמות ראשוניות אנושיות, אלא גם על מגה-קריוציטים הנוצרים בתרבות במבחנה.

אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

מידול אריתרופואיזיס מספק הזדמנות יקרת ערך להבין את המשמעות הביולוגית של שחקנים בתהליך זה ולהעריך גישות טיפוליות חדשות שעשויות להקל על פגמי התמיינות. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה להבדיל ביעילות תאי גזע ואב המטופויאטיים CD34+ ex vivo.

צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T...

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

למדו לבודד תאי CD34+ מדם חבל טבורי אנושי לחקר הבדלת מגקריוציטים וייצור טסיות דם. השיטה מאפשרת ניתוח השפעת טיפולים שונים על תהליכי מגקריופואזה ותפקוד טסיות.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים⁺

גלה סרטונים נוספים