Name: ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למד שיטה מהירה להצגת אנטיגנים על פני חיידקי BCG באמצעות קישור ביוטין-אבידין ללא שינוי גנטי. טכניקה זו משפרת את החיסוניות ומאפשרת מחקר מהיר בתחום פיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר סטוקס R לזן של פסטר BCG ו א טלאל לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים גם GenScript על העזרה עם ג'ין סינתזה.

כל בעלי החיים היו נשמרים על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת ועדות שימוש ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה. הניסויים היו אושרה על ידי חיה אכפת לי להשתמש ועדות, שבוצעה על פי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים. המספר רווחת בעלי חיים אבטחת הוא A11-0247.
1. דור של חלבונים פיוז'ן אבידין Monomeric לבטא פלסמידים
<ol><li>תת לשבט monomeric אבידין רצף12 לתוך פלסמיד pDEST17 בין האתרים "CTC", "גה" המתאים 133-134bp. (כלומר, בין 6-histag pDEST17 Attr1 רקומבינציה האתר) כדי להשיג p17-Avi. הערה: רצף הדנ א אבידין monomeric מוצגת להלן. שלוש מוטציות שהוצגה בפראי-סוג אבידין להשיג אבידין monomeric מוצגים תווים מודגשים. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>עיצוב תחל תמר מוקף עם AttB1 ו- AttB2 אתרים המתאימים ביצית מפוליפפטיד757-1035 (-Ab- ו H-2_Kb-מוגבל epitopes) רצף ה-DNA. פריימר רצפים הם: Attb1-ביצית GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ו- Attb2-ביצית GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ו- b2 Attרצפים הם מודגשים).<ol>
<li>להגביר את-PCR ביצית מפוליפפטיד757-1035 רצף ה-DNA עם תחל לעיל באמצעות פלסמיד pUC57-ביצית כתבנית.</li>
		<li>לשכפל את המוצרים PCR לתוך pDONR-221 דרך בייעודי לאתר במבחנה רקומבינציה לתגובה (למשל, BP Clonase) כדי לקבל pDONR-ביצית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הגן עניין p17-Avi באמצעות התגובה LR Clonase כדי להשיג p17-אבי-ביצית. הערה: לקבלת פרטים של BP וחברת LR רקומבינציה שיבוט, עיין במדריך של היצרן.</li>
</ol>2. monomeric אבידין פיוז'ן חלבון ביטוי, טיהור, Refolding
<ol><li>להפוך פלסמיד p17-אבי-ביצית BL21 e. coli , זירוז 250 מ של e. coli BL21 תרבות עם IPTG (0.1 M) עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>
פירוק של חיידקים, הכללה גופות Solubilization
	<ol>
<li>גלולה 250 מ של תרבות BL21 המושרה על ידי 30 דקות של צנטריפוגה ב 4000 x g ו ב 4 ° C.</li>
		<li>לאסוף כדורי 10 מ"ל של פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCL, 150 מ מ NaCl, 6 מ' Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5) דגירה למשך 15 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס. דגירה ללילה בטמפרטורת החדר על מסובב.</li>
		<li>צנטריפוגה 30 דקות ב- 15,000-g ו 4 ° C ותגובת שיקוע לאסוף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לטהר אבי-ביצית של תגובת שיקוע (שבר Solubilized גופות הכללה) תוך שימוש בעמודות Ni-נ. ת.
	<ol>
<li>לדלל הכללה גופות 1:2 עם פירוק מאגר.</li>
		<li>השתמש 4 מ"ל של ני-נ שרף לכל 250 מ של תרבות-derived גופים הכללה.</li>
		<li>רחץ 3 x 10 מ של פירוק מאגר (pH 7.0).</li>
		<li>Elute עם 10 מ"ל • תנאי מאגר (פירוק מאגר pH 7.0 עם 250 מ מ imidazole).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקפל את החלבון eluted על ידי דילול הדרגתי (1:10), vortexing מהירה במאגר טריס (pH 7.5) המכיל 1 מ מ DTT, 200 מ"מ NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 מ מ Tween 80, ארגינין 500 מ מ ו-200 מ מ NaCl למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מבטל את מלח, מאגר exchange refolded חלבון מהמאגר טריס לתוך PBS עם ריכוז חלבון על פי הפרוטוקולים של היצרן.</li>
	<li>הסר אגרגטים על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב- 3,500 x g וב -4 ° C, ולאחסן את aliquots של חלבון מסיס ב-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylation משטח BCG תא
<ol><li>לגדול BCG של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד עד OD = 0.5-1. הערה: BCG הוא. חיידק רמה 2 אבטחה, כל ניסויים הנוגעים BCG צריך להיעשות על אבטחה של ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	<li>רחץ 109 BCG 3 פעמים עם 500 µL של PBS חינם אנדוטוקסין כקרח בתוספת 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). להשעות BCG גלולה ב- PBS חינם אנדוטוקסין סטרילי.</li>
	<li>
מיד לפני השימוש, להכין 1 מ"ל של 10 מ מ Sulfo-NHS SS ביוטין במים מסוננים סטרילי.
	<ol>
<li>דגירה חיידקים עם 1 מ"ל של 0.5 מ מ של האס. אס Sulfo-NHS ביוטין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
רחץ חיידקים שכותרתו 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר כדי להסיר ריאגנט biotinylation לא הגיב.
	<ol>
<li>מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי להעריך את יעילות biotinylation, כתם8 10 biotinylated BCG עם Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
	<ol>
<li>דגירה חיידקים ויטראז'ים ב מ 1 ל 2% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בדוק רמות של biotinylation על ידי ניתוח cytometry זרימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ותפקיד של Biotinylated Mycobacteria: צמיחה והישרדות
<ol><li>
לגדול BCG זנים של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד.
	<ol>
<li>להקליט את צפיפות אופטית (OD600) של התרבות חיידקי במשך תקופה 8 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השתמש BCG-לוק (שתואר לעיל9) כדי לזהות הישרדות של חיידקים מקרופאגים.
	<ol>
<li>להדביק תאים RAW264.7 עם biotinylated BCG-לוק (MOI 10:1) או מטופל BCG-לוק (בקרה), מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס מעל 48 שעות תקופת זמן.</li>
		<li>לשטוף תא monolayers ואת lyse ואז עם 0.025% מרחביות לשחרר חיידקים בלע.</li>
		<li>מדד הייצור ביולומינסנציה עם לוציפראז assay מערכת luminometer. הערה: הפריה חוץ גופית אות היא מעידה על יכולת הקיום חיידקי. נא עיין במדריך של היצרן לקבלת פרטים של לוציפראז וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. איגוד של חלבון Monomeric אבידין-Fusion למשטח BCG Biotinylated
<ol><li>מערבבים 5 x 108 biotinylated BCG עם אבי-חלבון (סוף μg/מ"ל ב- PBS-T) לשעה בטמפרטורת החדר בפלטפורמה בשייקר.</li>
	<li>שטיפת חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר, הכתם עם הארנב אנטי-אבידין נוגדנים (אלב) (דילול מטריים, שתואר לעיל10) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם FITC מצומדת עז ארנב אנטי איג Ab באותם התנאים.</li>
	<li>לשטוף חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST ולנתח על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את היקף השטח קישוט.</li>
</ol>6. lyophilization של Mycobacteria
<ol><li>Biotinylate חיידקים על פי 3.1-3.4 שלב biotinylated מעיל חיידקים עם אבי-ביצית לפי שלב 5.1.</li>
	<li>Aliquot biotinylated וחיידקים מצופה (108), לשטוף עם PBS ו להשעות מחדש בתקשורת lyophilization 0.5 mL (25% Sauton בינוני, 75% H2O ו- 1.5% Na-גלוטמט).</li>
	<li>להעביר חיידקים צלוחיות זכוכית ומקפיאים במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>Lyophilize זכוכית מלא וקפוא vials 24 שעות ביממה באמצעות הקפאת מייבש.</li>
	<li>לאחסן דגימות מיובשים בטמפרטורת החדר, לשקם ב- PBS בעת הצורך.</li>
	<li>חזור על שלב 3.5 להעריך biotinylation, משטח ציפוי יציבות.</li>
</ol>7. phagocytosis Assay
<ol><li>לגדול 264.7 גלם תאי מקרופאג במנות תרבות בקוטר 10 ס מ ב- DMEM 5% בינוני FCS המכיל, 1% כל-גלוטמין, HEPES, חומצות אמינו שאינן הכרחיות, ו פניצילין, סטרפטומיצין עד 70-80% confluency.</li>
	<li>זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים בצלחת 6-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>צור DsRed BCG (שתואר לעיל9) מעוצבים עם אבי-ביצית (DsRed BCG-אבי-פשוט) על-פי השלבים 3.1-3.4 ו- 5.1.</li>
	<li>להדביק תאים גולמי עם DsRed BCG-אבי-ביצית או BCG טיפול DsRed-MOI 20:1 במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רוחצים תאים שלוש פעמים את trypsinize באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להסיר את החיידקים מנותקת חלקית.</li>
	<li>לתקן ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>3 x עם PBS וקונטה לנתח ידי cytometry זרימה.</li>
</ol>8. וגדילת של ביצית מעוצבים Biotinylated BCG ב מקרופאגים
<ol><li>
מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>זרע 3 x 105 264.7 גלם תאי מקרופאג על coverslips לתוך צלחת 24-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>להדביק תאי מקרופאג עם mycobacteria (MOI 10:1) בתקשורת תחזוקה ללא אנטיביוטיקה-37 ° C ו- 5% CO2 עבור 4 עד 24 שעות.</li>
		<li>רוחצים את התאים את trypsinize להסיר את משטח חיידקים מחובר, שאינם בלע כמו שלב 7.5.</li>
		<li>תיקון נגוע התאים ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו 3 מנקי עם PBS.</li>
		<li>Permeabilize תאים במאגר חוסם/permeabilization (0.1% טריטון X-100, 3% BSA ב- PBS) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>שימוש נוגדן ספציפי של עניין (למשלארנב אנטי-אבידין Ab) ב 10 μg/מ"ל ב permeabilization מאגר עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו נוגדנים משניים (למשל, FITC-התיש ארנב אנטי איג) במשך 20 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>שטיפת תאים x 3 עם PBS, פעם אחת עם מים, ו הר בשקופיות ב 10 μL של מדיום הרכבה מימית כדי למזער זריחה photobleaching.</li>
		<li>לבחון את השקופיות על-ידי דיגיטלי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד 63 x / 1.4 תוכנית-עדשה אפוכרומטית אובייקטיבי. תמונות הרשומה באמצעות מצלמה דיגיטלית יחד על התוכנה מיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold מכתים ואלקטרון
	<ol>
<li>זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים 6-ובכן צלחות.</li>
		<li>לתקן מקרופאגים BCG נגוע עם 4% PFA במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>רחץ דגימות פעמיים עם PBS.</li>
		<li>להטביע דגימות 4% נקודת התכה נמוכה agarose, מייבשים 70% אתנול.</li>
		<li>העברת דגימות שרף אקרילי, פולימריזציה ב 50 º C.</li>
		<li>לגזור 60 ננומטר מקטעים עם מיקרוטום ולאסוף סעיפים על רשתות ניקל.</li>
		<li>תווית דגימות עם 10 נוגדן אבידין μg/mL עבור h 1 בטמפרטורת החדר או 4 ° C בלילה בפתרון דגירה (PBS ו- 0.1% BSA) ולאחר מכן לשטוף עם הדגירה פתרון מצומדת זהב F(ab')2 של קטן במיוחד עז-נגד-ארנב אג (1/20) עבור h 1 בחדר טמפרטורה בפתרון הדגירה.</li>
		<li>לשטוף ובסעיף מים מזוקקים, כתם ב 2% גלוטראלדהיד, לשטוף שוב, אוויר יבש, בודקים עם מיקרוסקופ אלקטרוני.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. התחסנות חיות ועיבוד איברים
הערה: כל השלבים צריך להיעשות על אבטחה של ארון.
<ol><li>מעבר biotinylated וחלבון מצופה חיידקים באמצעות מחט1/2G 27 10 פעמים כדי להפוך לתא בודד ההשעיה.</li>
	<li>
קח 1 x 106 חיידקים μL 100 ל- PBS חינם אנדוטוקסין, לחסן את העכברים-C57BL/6 הנשי (-Ab, H - 2 Kb, שבוע 5-6) subcutaneously ב עורפה של הצוואר.
	<ol>
<li>מזריקים בקרת עכברים μL 100 ל- PBS לבד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
המתת חסד עכברים לחסן 20 ימים לאחר חיסון על ידי שאיפת2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
	<ol>
<li>לבודד את הטחול, להעבירו RPMI מדיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מועכים את הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם פומפה מזרק 5 מ.
	<ol>
<li>לשטוף עם 5 מ של RPMI. צנטריפוגה (x 800 גרם, 3 דקות) כדי לבודד השעיה תא בודד.</li>
		<li>לרוקן RBC עם העכבר ביוטין חיובי בחירת ערכת עם תאים ביוטין-Ter119/Erythroid Ab.</li>
		<li>צנטריפוגה והשהה מחדש תאים ב- 10 מ"ל של שלמה RPMI (FCS 10%, 1%-גלוטמין, 1% פניצילין, סטרפטומיצין 1% ו- 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. אני-Ab tetramer מכתים כדי לקבוע את התדרים של אנטיגן ספציפי CD4+ תאי T ואת ציטוקין תאיים מכתים כדי לקבוע תדרים של אנטיגן ספציפי T תאים שחרור ציטוקינים לחסן חיות
<ol><li>
Tetramer מכתים
	<ol>
<li>כתם splenocytes של שליטה ועכברים לחסן (~ 20 x 106 תאים) עם מצומדת-PE-Ab-tetramers323-339 ביצית (1/12.5 דילול) עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס במאגר מחייב (PBS עם FCS 2% ו- 0.1% נאן3).</li>
		<li>להוסיף AF647 CD4 Ab (1:25) ו- 7-מ (כדי לאתר תאים מתים) splenocytes למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לנתח דגימות ידי cytometry זרימה.</li>
		<li>השג 500,000 אירועים באזור חיובי CD4 כדי לקבוע את התדירות של אירועים חיוביים tetramer. הערה: splenocytes סה כ מוגדרים על-ידי נקודה האס/FSC האבן החשופה, תאים חיים מאת הדרה של אירועים חיוביים 7-מ ו CD4 קבוצות משנה על-ידי gating אירועים חיוביים AF647.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התדירות של ציטוקין תאיים ספציפיים אנטיגן, שחרור תאי T
	<ol>
<li>העברת כ 1 × 107 splenocytes לתוך 4 מיליליטר RPMI מלאה, במדיום. ובכן שש צלחות עם או בלי ביצית רקומביננטי (10 µg/mL), תקופת דגירה של 16 h.</li>
		<li>פנקו תאים עם Brefeldin (1:1, 000) עבור h 5 נוספים.</li>
		<li>לשטוף עם PBS ובכפוף ציטוקין תאיים מכתים כדלקמן:<ol>
<li>כתם דגימות תאים עם PE-CD8 או PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 במאגר מחייב) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
			<li>לתקן ב 4% PFA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
			<li>Permeabilize באמצעות פתרון permeabilization, על פי הוראות היצרן.</li>
			<li>לשטוף את התאים ואת תווית עם AF647 מצומדת IFN-γ Ab (1:50) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>רוחצים התאים את נושא ניתוח cytometry זרימה כמתואר לעיל.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אנחנו דיווחו במחקר זה בגישה הלא גנטי לתצוגה מהירה ויעילה של חלבונים אקסוגני במשטח BCG להוסיף אנטיגנים ספציפיים או מאפיין פונקציונלי מסוים צפוי לשיפור ביעילות immunogenicity של החיידק. להדגים כי השטח תא BCG יכול להיות בקלות biotinylated לקישוט משטח מיידי עם אבידין פיוז'ן חלבונים. ניתן לבצע את ההליך הכולל בתוך 2 h, בזמן שינוי גנטי, מבחר של שיבוטים חיובית דורשת 2-3 חודשים של זמן השהיה. שינוי פני השטח אינה משפיעה על התפתחות חיידקים והישרדות. חיידקים מעוטרים עם אנטיגן הפונדקאית ביצית הצליחו לספק אנטיגן לתוך השביל מצגת אנטיגן,...

אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להחליף את החיסון הנוכחי שחפת BCG, כולל חלבון אדג'וונט מערכות, טכנולוגיות הווקטורי ויראלי, זנים M.tb בשידור חי הקלוש של זנים מהונדסים BCG, גם להחדיר גנים יתר ביטוי אנטיגנים BCG באים לא מספיק לידי ביטוי במהלך זיהום1 או שחרור מהיר למוט אוכף-אנטיגנים ספציפיים מציג BCG2. עם זאת, הנדסה גנטית, פונה מחסומים רבים כולל רמת לא בטוח בטיחות התהליך זמן רב, יעילות נמוכה של הביטוי וקטורים4,5. לגבי שיפור BCG, גישה חלופית יש צורך לשפר את immunogenicity ללא צורך מסעה גנטי לא בטוח.
במחקר זה, נסקור אסטרטגיה הרומן לתצוגה של חומרים מעניינים על פני תא ה-BCG מבוססת על האינטראקציה ידועים אבידין גבוהה-זיקה עם ביוטין. גישה זו מאפשרת מצורף מהיר ולא לשחזור של recombinant אבידין פיוז'ן חלבונים על פני השטח של biotinylated BCG, אשר מקלה על מניפולציות רחבה של BCG כדי להשיג שיפור מקסימלי של יעילותה תוך שמירה על בטיחות מעולה שלה שיא, שנצפה במשך עשרות שנים של שימוש.
אבידין אהדה ביוטין הוא גבוה מאוד (Kd = 10−15 מ'), לאחר שהוקמה, המתחם ביוטין-אבידין יציב מאוד, רק יכול להיות משובשות תחת denaturing תנאים6. עם זאת, עבור סוג זה של אינטראקציה לשמש חלופה שיטה של העברת גנים, התצוגה לטווח ארוך אבל הפיכה של חומרים נדרש. לפיכך, הצגנו כאן אבידין monomeric של זיקה נמוכה (Kd = 10−7 ז) כי הפניות שחרור הפיך של חלבון מהמשטח מעוצבים BCG בלע פעם אחת בתוך אנטיגן הצגת תאים. כדי לספק הוכחה של המושג, בדקנו בשיטה זו באמצעות חלבון chimeric monomeric אבידין המתאים אנטיגן הפונדקאית נגזר אובלבומין (פשוט)7,8. התוצאות הראו כי השטח תא BCG ניתן בקלות, במהירות מעוטר אבידין monomeric פיוז'ן חלבונים, כי איגוד זה השטח BCG הינה יציב לשחזור וללא שינוי לזיהוי התפתחות חיידקים והישרדות. בנוסף, מצאנו BCG מעוטר monomeric אבידין התמזגו עם ביצית (AviOVA) יכול לגרום תגובה חיסונית הדומה לזה הנגרם על ידי BCG גנטית לבטא אותו אנטיגן גם במבחנה וגם בתוך vivo. טכנולוגיה זו תצוגה הפיך של חלבונים עניין על פני חיידקי ולכן הוא תחליף יעיל של גישות העברת גנים מסורתיים, מספקים פלטפורמה מניפולציות רחבה של BCG ויישומים נוספים בחיסון פיתוח.

<table><tbody><tr><td>נטול אנדוטוקסין, RPMI 1640</td><td>StemCell Technologies&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS ביוטין</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין מצומד FITC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>פיקואריתרין (PE) מצומד I-Ab-OVA323-339 tetramer&nbsp;</td><td>MBL בינלאומי&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>שרף טיהור פוליהיסטידין-תג TALON&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 מצומד חולדה נגד עכבר CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 עכברים נגד עכברים IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 עכברים נגד עכברים I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 חולדה נגד עכבר CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE חולדה נגד עכבר CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 חולדה נגד עכבר H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC מצומד עז אנטי ארנב נוגדן</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 חולדה נגד עכבר CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>קטן במיוחד מצומד זהב עז אנטי ארנב IgG</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 מרק</td><td>BD מערכות אבחון</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 קווי תאי מקרופאגים עכברים</td><td>סוג אמריקאי אוסף</td><td></td><td></td>תרבות</tr><tr><td>pDEST17 פלסמיד&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA פלסמיד&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP קלונאז&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 פלסמיד</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>עמודות Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>רכזי חלבון פירס&nbsp;</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי Axioplan II</td><td>קרל זייס בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית CCD&nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV מיקרוסקופ אלקטרונים&nbsp;</td><td>חברת FEI</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; מסננת תאי פלקון&nbsp;</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בחירה חיובית ביוטין של עכבר EasyStep&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-Ter119/תאי ארטירואיד נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ציטופיקס/ציטופרם&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוציפראז Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminometer&nbsp;</td><td>פרומגה</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 מיקרוטום</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 מייבש הקפאה</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית Wheaton boroscilicate</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-bcg mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

השחפת (TB) היא מחלה זיהומית קשה, חיסון זמין רק מ חיידקי סטרפטקוקוס בוביס bacillus Calmette-Guérin (BCG) הינו בטוח ויעיל להגנה נגד חמור טרה-בתים דלקת קרום המוח ילדים, כמה צורות של המופץ טרה-בתים, אך אינו מצליח להגן נגד שחפת, וזו הצורה השכיחה ביותר של המחלה. מבטיח אסטרטגיות לשיפור BCG כעת להסתמך גם על השינוי שלה עם הגנים קידוד immunodominant מ. שחפת (Mtb)-אנטיגנים ספציפיים ו/או קומפלמנטציה עם הגנים קידוד שיתוף גורמים המעודדים אנטיגן הצגת תאים. מגבלות הגדולות גישות אלה כוללים יעילות נמוכה, יציבות נמוכה לרמת הבטיחות של וקטורים ביטוי לא בטוח. במחקר זה, אנו מציגים גישה אלטרנטיבית לשיפור החיסון, אשר מורכב קומפלמנטציה BCG עם חלבונים אקסוגני של עניין על פני השטח של חיידקים, במקום טרנספורמציה עם פלסמידים קידוד הגנים המתאימים. ראשית, חלבונים עניין באים לידי ביטוי פיוז'ן עם אבידין monomeric ב רגיל e. coli מערכות ביטוי אז נהגו לקשט את פני השטח של biotinylated ה-BCG. ניסויים בבעלי חיים באמצעות משטח BCG מעוטרים עם הפונדקאית אובלבומין אנטיגן מדגימים כי החיידק ששונה הוא מלא immunogenic, מסוגל גרימת תגובות תא T ספציפי. בסך הכל, הנתונים המוצגים כאן בחום תמיכה של הרומן שיטה יעילה לשינוי הצורה של החיסון BCG הנוכחי מחליף את הגישה המקובלת מפרך של קומפלמנטציה עם חומצות גרעין אקסוגני.

עם כללי בהליכים המתוארים לעיל, נבחנה הכדאיות של biotinylation משטח BCG וקישוט עם אנטיגן הפונדקאית ביצית. Immunogenicity של BCG שהשתנה היה אז נבדק בתוך vivo. השטח חיידקי סומן בקלות עם ביוטין לתצוגה מהירה של אנטיגנים chimeric אבידין ללא כל שינוי לזיהוי פנוטיפים חיידקי. BCG ששונה וכתוצאה מכך ביעילות בליעתו על ידי אנטיגן הצגת תאים, יכול לגרום תגובה חיסונית ספציפית ביצית בעכברים.
דור של פלסמידים פיוז'ן אבידין monomer...

טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז'ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא חלבוני שטח על מיקובקטריום באמצעות קישוט פני השטח עם חלבונים רקומביננטיים כחלופה לגישות מסורתיות מבוססות גנטיקה. שיטות אלה יכולות לסייע לענות על שאלות מחקר חשובות בתחום המיקובקטריולוגיה, במיוחד בתחום האינטראקציות בין בתי חולים ופיתוחי החיסונים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן גורמי הפרעה פוטנציאליים או מועמדים לאנטיגן.זה יכול להיות ולהשוות במהירות לגישות מסורתיות מבוססות גנטיקה קפדניות וגוזלות זמן. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אמינה טלאל, עוזרת מחקר במעבדה שלי. חלק זה של הפרוטוקול מתחיל בהפיכת פלסמיד P17 Aviden OVA ל-E.Coli BL21.לשם כך, יש להשרות 250 מיליליטר של תרבית E.Coli BL21 עם IPTG למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שעות, יש להמיס את החיידקים כדי להמיס את גופי ההכללה על ידי הטלת תרבית BL21 המושרה והשלכת הסופרנטנט. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר ליזה ואפשרו לליזה של התאים למשך 15 דקות.לאחר מכן המשיכו את הדגירה בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב לתסיסה, והניחו לה למשך הלילה. בבוקר צנטריפוגה את התערובת למשך חצי שעה. לאחר מכן אסוף את הסופרנטנט המכיל את גופי ההכללה המסיסים.לאחר מכן, טהר את חלבוני ה-OVA של Aviden באמצעות עמודת ניקל NTA. ראשית, יש לדלל את הסופרנטנט אחד עד שניים במאגר ליזה ולהעריך את הנפח. לאחר מכן הכינו עמודה המכילה ארבעה מיליליטר שרף ניקל NTA לכל 250 מיליליטר סופרנטנט מדולל והעמיסו את הדילול על העמודה.לאחר מכן, שטפו את העמוד שלוש פעמים באמצעות 10 מיליליטר של מאגר ליזה ב-pH שבע לכל שטיפה. כדי לאסוף את החלבון הרקומביננטי, יש לשטוף את העמודה עם מאגר ליזה המכיל אימידזול ולאסוף את האלואט. אם החלבון הרקומביננטי שלך נקי מגופי הכללה, להלן ההליך שיהיה טוב לחלבונים רבים במעבדה שלנו.ראשית, התאם את ה-pH של תמיסת הקיפול מחדש כך שתהיה יחידה אחת מעל או מתחת לנקודה האיזואלקטרית של החלבון. לאחר מכן, מערבל בהדרגה ודלל את החלבון לדילול של 1 עד 10 בתמיסה מתקפלת מחדש. לאחר מכן דגרו את החלבון על מערבל מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להשלים את תהליך הקיפול מחדש.לאחר מכן, הסרת המלח והחיץ מחליפים את החלבונים המקופלים מחדש ל-PBS באמצעות רכז חלבון. לאחר מכן צנטריפוגה של העמודה ואחסנו אלוקאט של חלבון מסיס בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. עבוד בארון בטיחות ביולוגית באמצעות ציוד מגן אישי מכיוון ש-BCG הוא פתוגן ברמה 2.כדי לביוטיניליזציה של פני השטח של תאי BCG, תחילה גדלו את התאים על פלטפורמת שייקר לצפיפות המתאימה. אספו כמיליארד תאים ושטפו אותם שלוש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח ונטול אנדוטוקסין. לאחר מכן, סובב את התאים והשהה אותם ב-PBS סטרילי ונטול אנדוטוקסין.לאחר מכן, הכינו ביוטין טרי של 10 מילי-מולארי סולפו-NHSSS במים מסוננים סטריליים. לאחר מכן דגרו חיידקים במיליליטר אחד של מרק המכיל 0.5 מילימולר של סולפו-NHSSS ביוטין. בצע את הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן שטפו את החיידקים המסומנים כעת שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח, כמו קודם כדי להסיר את החומר החוזר שלא הגיב. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBST. כדי להעריך את יעילות הביוטינילציה, יש לצבוע אלוקאט של 100 מיליון BCG ביוטיניל ב-25 מיקרוליטר של סטרפראווידין-FITC.לאחר מכן, דגרו לזמן קצר את החיידקים המוכתמים בפרה-פורמלדהיד, ולאחר מכן מדדו את רמת הביוטינילציה באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר הערכת הצמיחה וההישרדות של המיקובקטריות הביוטיניליות, המשך בקשירת חלבון ההיתוך של אבידן אליהם. ראשית, ערבבו 500 מיליון BCGs ביוטיניים עם חלבון היתוך Aviden לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם חלבון למיליליטר.תן לתגובה זו להימשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר. לאחר מכן, שטפו את החיידקים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח. לאחר מכן מכתים את החיידקים בנוגדנים נגד Aviden של ארנב למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 20 דקות, בצע שלב כביסה אחד עם 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח. לאחר מכן, צבעו את החיידקים בנוגדני IGG נגד ארנב מצומד FITC. לאחר מכן, שטפו את החיידקים באמצעות 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח, ונתחו את החיידקים על ידי זרימה ציטומטרית כדי להעריך את קישוט פני השטח.לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר, הציטולוגיה מראה שהיו רמות מינימליות של קשירת OVA לחיידקים שאינם ביוטיניליים ורמות משמעותיות של קשירת OVA לחיידקים ביוטיניליים. חשוב לציין, רמות ה-OVA של Aviden על פני השטח של החיידקים נותרו יציבות וניתנות לזיהוי חודש לאחר הליופיליזציה והאחסון בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נעשה שימוש בתאי RAW ובחיידקי dsRed לביצוע בדיקת פגוציטוזיס.למרבה השמחה, לא הייתה הרתעה בפנוטיפ המקרופאגים. כדי לבחון את גורל ה-BCG המעוטר ב-Aviden OVA בתוך מקרופאגים, תאי RAW דבקים נדבקו ונבדקו במיקרוסקופ פלורסצנטי. Aviden OVA לא היה רק נוכח על פני השטח של החיידקים, אלא גם מנותק וממוקם לציטופלזמה הרחק מהחיידקים.ניסוי צביעת זהב חיסוני הראה כי אנטיגנים של Aviden OVA יכולים להתנתק מפני השטח של BCG, לחצות את הממברנה הפגוזומלית ולנוע לעבר הציטוזול. מקרופאגים הנגועים ב-Aviden OVA BCG הראו לוקליזציה משותפת של Avi OVA עם מולקולות IA. זה מצביע על כך שחלבוני היתוך של Aviden מתנתקים ועוברים לתאי הצגת אנטיגן כדי להיטען על מולקולות MHC2.פפטידים של Aviden OVA גם התמקמו יחד עם מולקולות מסוג I בתוך פגוזומי BCG, כפי שמוצג על ידי צביעת H2K. לפיכך, קיימת הצגה פוטנציאלית של אנטיגן Avi OVA לתאי T חיוביים ל-CD8 על ידי המקרופאג. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבטא חלבונים במיקובקטריה, וקשה לתמרן את האורגניזם הזה בשיטות הגנטיות הנוכחיות.לאחר הטכניקה, אנו משתמשים בה בהצלחה כדי להעמיס את החיסון עם האנטיגן המיקובקטריאלי הוא בשש. לאחר מכן הראינו שהחיסונים המותאמים היו הזדמנות להשתמש כתגובה חיסונית ספציפית במודל העכבר. אנו משתפים פעולה כעת כדי לחקור גישה זו בטרטין הצענו להשתמש ב-BCG משודרג עם אנטיגן או אימונובולטורים נבחרים.

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של...

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

סרטון זה מדגים השראת דלקת מערכתית בעכבר מורדם. הזרקה של מחסני אנטיגן-אדג'ובנט מיקובקטריאליים מעוררת שחרור ציטוקינים ודלקת מקומית. כלי הלימפה נפתחים ומאפשרים כניסת תאי מערכת החיסון לבלוטות הלימפה והפעלת תאי T, המשחררים ציטוקינים מעודדי דלקת, מה שמוביל לדלקת נרחבת.

הזרקה תת עורית של אנטיגן חיידקי לגרימת דלקת מערכתית במודל מורין

סרטון זה מדגים את ההכנה והכימות של Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inoculum באמצעות בדיקת ביולומינסנציה וספירה של יחידות יוצרות מושבה. החיסון המוכן יכול לשמש למחקרי זיהום.

הכנה וכימות של Mycobacterium bovis BCG lux Inoculum לזיהום

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת חיסונים רב-ערכיים נגד שלפוחית הממברנה החיצונית (OMV). תאי יונקים עוברים טרנספורמציה כדי לבטא ולהפריש אנטיגנים נגיפיים המאוחים ל-SpyTag ולתג פוליהיסטידין. אנטיגנים אלה מטוהרים לאחר מכן באמצעות עמודת זיקה של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA). האנטיגן המטוהר מעורבב עם בועיות קרום חיצוניות המבטאות חלבון SpyCatcher (SC) הקשור למשטח. אנטיגנים מרובים נצמדים באופן קוולנטי ל- SpyCatchers באמצעות SpyTags שלהם (ST), ויוצרים OMVs המציגים את האנטיגן, ומשמשים כחיסון רב-ערכי.

יצירת חיסון רב-ערכי נגד שלפוחית הממברנה החיצונית

הסרטון מדגים טכניקה לטעינת אנטיגנים על Mycobacterium bovis BCG כדי לשפר את התכונות האימונוגניות שלו. השיטה משתמשת במערכת אבידין-ביוטין כדי לצפות את פני השטח של החיידקים באנטיגנים אקסוגניים.

טכניקת צימוד אבידין-ביוטין להצגת אנטיגנים ממוקדים על Mycobacterium bovis BCG

assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T הזיכרון מרכזיים.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

אנו מפרטים כאן את המתודולוגיה שננקטה כדי להשוות את יעילות ההגנה והתגובה החיסונית של הריאות הנגרמת על ידי חיסון תוך-אף ותת עורי עם BCG במודל עכבר. התוצאות שלנו מראות את היתרונות של חיסון ריאתי ומצביעות על תפקיד לתגובה בתיווך IL17 בהגנה הנגרמת על ידי חיסון.

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium  paratuberculosis שהומת בחום.

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

למד שיטה מהירה להצגת אנטיגנים על פני חיידקי BCG באמצעות קישור ביוטין-אבידין ללא שינוי גנטי. טכניקה זו משפרת את החיסוניות ומאפשרת מחקר מהיר בתחום פיתוח חיסונים.

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

גלה סרטונים נוספים