קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית
2 בינואר 2018
אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר שיעורי דעיכת התעתיק בפיברובלסטים מתרבים ושקטים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון האם שינויים בביטוי הגנים נובעים משינויים בקצב דעיכת התעתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע על קצב דעיכת התעתיק, לא רק שפע תעתיקים.
כדי להתחיל את הפרוטוקול, הקמת תרביות מתפשטות ושקטות של פיברובלסטים. יש לנסוע באופן קבוע בפיברובלסטים מתרבים. ניתן להקים תרביות שקטות על ידי מתן אפשרות לצלחות להגיע למפגש עם שינויי מדיום רגילים.
הוסף ActD 150 מיקרוליטר ל-10 מיליליטר בינוני שחומם מראש עבור כל לוחות תרבית התאים הביולוגיים. הוסף ActD בריכוז של 15 מיקרוגרם למיליליטר מדיום. מערבבים היטב את התמיסה.
שאפו את המדיום הישן, והוסיפו מדיום המכיל ActD לתאים. כדי לאסוף את דגימת נקודת הזמן האפסית, שאפו בעדינות את מדיום ה-ActD ופיפטה בין חמישה ל-10 מיליליטר PBS מחומם מראש על צלחת של 100 מילימטר, חמישה מיליליטר תמיסה לצלחת של 100 מילימטר, שני מיליליטר לבאר של צלחת של שש בארות, ומיליליטר אחד לבאר של צלחת של 12 בארות. שאפו בעדינות את ה-PBS.
לאחר מכן הוסף תמיסת פנול-גואנידין איזותיוציאנט ישירות לצלחת תרבית הרקמה. פיפטה את תערובת תמיסת הפנול-גואנידין איזותיוציאנט למעלה ולמטה מספר פעמים ליצירת תערובת הומוגנית. אסוף כל נקודת זמן לאחר שחלף פרק הזמן המתאים, בשיטה שתוארה קודם לכן.
דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי להבטיח פירוק מוחלט של מתחמי חלבון RNA. לאחר מכן, הציגו תעתיקים מבוקרים של ספייק אין שניתן לזהות במתודולוגיה בה נעשה שימוש. הכנס בקרות אלה לכל דגימה בכמות ובריכוז ידועים.
בעזרת פיפטה, העבירו את תערובת תמיסת הפנילגואנידין איזותיוציאנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2.0 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 0.2 מיליליטר כלורופורם לתערובת התמיסה פנילגואנידין איזותיוציאנט עבור כל מיליליטר אחד של תמיסת פנילגואנידין איזותיוציאנט המשמשת. יש לנער את צינור המיקרו-צנטריפוגה בחוזקה למשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על הכלורופורם פנילגואנידין איזותיוציאנט.
לאחר הדגירה, סובב את הדגימות ב -12, 000 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. המדגם צריך להיפרד לשלוש שכבות. העבירו את השכבה המימית לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 2.0 מיליליטר באמצעות מיקרופיפטה והקפידו לא להפריע לשלב הביניים במהלך תהליך זה.
השלך את האינטרפאזה והשברים האורגניים. לאחר מכן הוסף נפח שווה של 2-פרופנול לשבר המימי והפוך את הצינור 10 פעמים. הוסף עד מיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר גליקוגן מימי לכל 20 מיקרוליטר דגימה, במיוחד אם התשואה צפויה להיות נמוכה.
דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, סובב את הדגימות. ודא שבסוף הסיבוב, ה-RNA שקע ליצור כדור זמן מה בתחתית הצינור.
בעזרת פיפטה, הסר והשליך את הסופרנטנט, תוך הקפדה מיוחדת לא להפריע לכדור ה- RNA הלבן. הוסף מיליליטר אחד של 75% אתנול למיליליטר אחד של מגיב תמיסת פנילגואנידין איזותיוציאנט כדי לשטוף את הגלולה. סובב את הדגימות ב 12, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות.
לאחר הסרת רוב הסופרנטנט, השתמש בפיפטה כדי להסיר כמה שיותר אתנול אך אל תפריע לגלולה. מסובב את הדגימות כדי לגלול את כל עודפי האתנול. כדור ה-RNA פחות קומפקטי בשלב זה ונוטה לנוע.
לאחר הסיבוב, הסר את כל עודפי האתנול מהצינור מבלי להפריע לגלולה. הניחו לכדור ה-RNA להתייבש באוויר למשך חמש דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לגלולת ה-RNA והשהה מחדש את הגלולה במים נטולי נוקלאז.
טפל בדגימות של מיקרוליטר אחד של Deanase כדי להסיר DNA ולאחר מכן להשבית את ה-Deanase והקטיונים. אחסן את דגימות ה-RNA בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2.0 מיליליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס. כמת את ה-RNA ובדוק את טוהר ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
לאחר בדיקת הטוהר, נתח את ה-RNA עם ג'ל אגרוז 1% כדי לדמיין את משך הפירוק. שתי רצועות ברורות המייצגות 18S ו-28S rRNA צריכות להיות גלויות בבירור. אם רצועות אלה אינן נראות לעין, ה-RNA עלול להתקלקל.
לאחר מכן, עקוב אחר שפע התעתיק באיסוף ציטוטי ה-RNA בהשוואה לתקן הפנימי המוגבר באמצעות qPCR בזמן אמת. ניתן להשתמש גם במיקרו-מערכים, ריצוף RNA או כתמים צפוניים. עוצמות הקרינה לאורך זמן תואמות את ביטוי הגנים.
בעוד שפיברובלסטים הופכים למעוכבי מגע, קולגן 3A1 המקודד לתעתיק, גן חשוב מאוד ליצירת המטריצה החוץ-תאית המופקדת במהלך ריפוי הפצעים, הופך ליציב יותר ואינו דועך באותה מהירות. אל תשכח שעבודה עם פנול יכולה להיות מסוכנת ביותר וחשוב לא לתת לו לגעת בעור שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר את שיעורי דעיכת התעתיק בפיברובלסטים מתרבים ושקטים.
שינויים בקצב דעיכת התעתיק יכולים להיות מנגנון חשוב של טריאנגולציה של גנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת פיברובלסטים דרמיים אנושיים ראשוניים המתרבים והבלתי פעילים כאחד. הוא מתמקד במעקב אחר שיעורי ריקבון תמלול וזיהוי גנים בדעיכה דיפרנציאלית, ומספק תובנות לגבי דינמיקת ביטוי הגנים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- ביולוגיה תאית
- ביטוי גנים
רקע
- הבנת שיעורי ריקבון תמלול חיונית להבהרת רגולציית ביטוי הגנים.
- פיברובלסטים משמשים כמודל לחקר תהליכים תאיים ברקמות אנושיות.
- מצבי התרבות והבלתי פעילות של פיברובלסטים יכולים להשפיע על תוצאות ביטוי הגנים.
- פרוטוקול זה נועד להבדיל בין השפעות ריקבון התמלול לבין שפע התמלול בלבד.
מטרת המחקר
- לעקוב אחר שיעורי ריקבון תמלול במצבים שונים של תרביות פיברובלסטים.
- לחקור כיצד שינויים בביטוי הגנים קשורים לשיעורי ריקבון התמלול.
- לספק שיטה אמינה לחקר דינמיקת ביטוי הגנים בפיברובלסטים.
שיטות ששימשו
- הקמת תרביות פיברובלסטים מתרבים ובלתי פעילים.
- טריפסינציה קבועה של פיברובלסטים מתרבים.
- הקמת תרביות בלתי פעילות על בסיס קונפלונציה עם החלפות מדיום.
- מעקב אחר שיעורי ריקבון תמלול באמצעות פרוטוקולים ניסויים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גנים בדעיכה דיפרנציאלית בין מצבים מתרבים ובלתי פעילים.
- תובנות לגבי הקשר בין ריקבון תמלול לשינויים בביטוי הגנים.
- הוכחת היתרונות של מדידת שיעורי ריקבון תמלול.
- מתן פרוטוקול מפורט למחקרים עתידיים בביולוגיה מולקולרית.
מסקנות
- הפרוטוקול מבדיל ביעילות בין שפע התמלול לבין שיעורי הריקבון.
- הממצאים תורמים להבנה מעמיקה יותר של רגולציית ביטוי הגנים.
- שיטה זו ניתנת ליישום במחקרים שונים בביולוגיה מולקולרית ותאית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression regulation by separating transcriptional and post-transcriptional effects.
- Supports functional target validation by identifying genes with altered mRNA stability in disease-relevant states.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the contribution of transcript decay to phenotype.
- Improves predictive confidence for advancing targets with robust regulatory profiles.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream transcriptomic and functional assays.
- Provides quantitative decay rate measurements for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of compounds or genetic perturbations affecting mRNA stability.
- Supports platform reuse for comparative studies across cell states or conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript decay signatures with disease-relevant cellular states for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by tracking regulatory mechanisms.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic relevance of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating transcript decay as a regulatory variable.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative decay rate outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of decay rates between proliferating and quiescent states.
- Translational Research: Connects decay rate changes to disease-relevant cellular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse cell models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible, and scalable transcript decay measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated regulatory profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA extraction, and quantitative transcript analysis.
- Needs access to instrumentation for qPCR, microarray, or RNA sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and time-point collection.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by Actinomycin D toxicity, restricting the time course for decay measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
ActD Time Course
2:13
Isolation of Total RNA from Phenol-guanidine Isothiocyanate Solution Lysate
5:16
Analysis of Transcript Abundance
6:02
Results: Clear Contrast in Transcript Decay Between Proliferating and Quiescent Fibroblasts
6:28
Conclusion
