רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

המטרה הכוללת של שיטת צינור רולר שונה זו לתרבית פרוסות מוח היא לספק מערכת תרבית סגורה להישרדות פרוסות לטווח ארוך. עם יכולת הדמיית פרחים חוזרת ונשנית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות עצבית והפרעות ניווניות הדורשות תצפיות על אותם נוירונים לאורך זמן, כגון מיקום חלבוני מפתח המעורבים בהיווצרות או אובדן סינפסות.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם מערכת התרבית הסגורה במלואה המאפשרת שימוש בטוח בנגיפים לביטוי חלבונים ושימוש בכיסויים חרוטים בתמונות כדי לאתר את אותם תאים להדמיה. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשגידלנו פרוסות על כיסויים בתוך צינורות גליל, אולם היינו זקוקים לדרך טובה יותר לדמיין שינויים שמתרחשים בפרוסות חיות לאורך זמן. השימוש הנרחב בווקטורים נגיפיים לביטוי טרנסגנים ואוכלוסיות תאים ספציפיות להדמיית מיקרוסקופ הניע אותנו לפתח מערכת סגורה להגנה על המשתמשים ולמניעת זיהום של מטרות המיקרוסקופ.

היכולת לעקוב אחר אוכלוסיית התאים הזהה בתוך פרוסות המוח לאורך זמן מאפשרת מחקרים על התפתחות שינויים פתולוגיים ושינוי סינפסות במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירולוגיות אנושיות. כדי להתחיל, הכינו את מתלה צינור הגלילה והכינו ג'יג כדי לסייע בקידוח חור בצינורות הגלילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. בעזרת הג'יג, החזק במקומו צינור תרבית פלסטי בעל צד שטוח, סנטימטר אחד, כך שהצד השטוח פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן קדחו חור בקוטר שישה מילימטר כשהמרכז סנטימטר אחד מלמטה וממורכז בין דפנות הצינור. בעזרת כלי הסרת הבור המסתובב החלק את שולי החור וצור ארבעה חריצים בקצה הפנימי של החור כדי להקל על ניקוז החור במהלך הסיבוב. לאחר מכן, שטפו את הצינורות עם אתנול 70% ולאחר מכן יבשו אותם באוויר בארון בטיחות ביולוגי.

עקר את הצינורות בדיסקים מגומי סיליקון דביקים בגודל 12 מילימטר למשך 40 דקות מתחת למנורת ה-UV. לאחר 20 דקות מקם מחדש את הצינורות והדיסקים כך שכל המשטחים החשופים מעוקרים. לאחר מכן קלף את הגב הלבן מדיסק הדבק, יישר את החורים והצמד את גומי הסיליקון לחלק החיצוני של הצינור.

לאחר קבלת הפרוסות, הניחו שני מיקרוליטרים של פלזמת עוף במרכז הצד החרוט של כיסוי מוכן. מורחים מעט את הפלזמה כדי להשיג נקודה בקוטר של שלושה עד ארבעה מיליליטר. לאחר מכן השתמש במרית סטרילית בעלת קצה צר כדי להרים פרוסת מוח מוכנה.

השתמש במלקחיים סגורים כדי לשמור את הפרוסה על קצה המרית תוך הרמת הפרוסה. גע במרית לנקודת הפלזמה על הכיסוי ובעזרת מלקחיים סגורים דחף את הפרוסה אל הכיסוי. הוסף שכבה דקה של פלזמת אפרוח על הכיסוי לפני הנחת הפרוסה וכמות מינימלית של פלזמה שטופלה בטרומבין כדי לכסות את הפרוסה.

אם הפרוסה צפה היא לא תישאר דבוקה כאשר הענן יוסר. לאחר מכן מערבבים 2.5 מיקרוליטר פלזמה ו -2.5 מיקרוליטר תרומבין בצינור נפרד. מניחים במהירות 2.5 מיקרוליטר מהתערובת הזו מעל ומסביב לפרוסה ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב אותה.

הסר את כיסוי הפלסטיק השקוף מהצד החשוף של דבק גומי הסיליקון שהודבק בעבר לצינור הגליל. לאחר מכן הנח את הכיסוי עם פרוסת המוח על הדבק ומיישר את הפרוסה בתוך החור. כדי להבטיח הידבקות הפעל לחץ אחיד ורך על הכיסוי עם האגודל, על ידי לחיצה אחידה על הכיסוי כלפי מטה באופן שווה, והחזקתו למשך כדקה תוך העברתו לארון הבטיחות הביולוגי.

הלחץ על הכיסוי כדי להדביק אותו לצינור מבלי לדלוף חייב להיות נכון ומתוחזק מספיק זמן כדי לחסל תעלות אוויר בבולט. לחץ רב מדי יסדק את הכיסוי. בארון בטיחות ביולוגי, הוסף 0.8 מיליליטר של מדיום תרבית נוירו-בסיסי שלם לכל צינור.

לאחר מכן הזרימו תערובת של 5% פחמן דו חמצני 95% אוויר דרך פיפטת פסטר סטרילית סתומה מכותנה המוחזקת היטב על ידי מהדק. השתמש בזה כדי לשטוף את צינור הגליל בתערובת הגז ולכסות במהירות את הצינור כשהוא נסוג מסביב לפיפטה. לאחר מכן, סמן את הצינורות עם מספר הפרוסה ומספר המתלה.

הכנס את הצינורות למתלה גלילה; להבטיח שהם מאוזנים מבחינה גיאומטרית. אם יש מספר אי זוגי של צינורות, הוסף צינורות ריקים לאיזון. הנח את המדפים בחממת רולר של 35 מעלות צלזיוס, כאשר גלילים מסובבים את מתלה הגלילה במהירות של 10 עד 13 סיבובים לשעה.

הטה את החממה לאחור כ-5 מעלות על ידי הרמת החלק הקדמי שלה על לוח. העבירו צינור עם תרבית פרוסות למחזיק צינור בהתאמה אישית כמו זה שמוצג כאן. לאחר מכן הנח את מחזיק הצינור לתוך מתאם ה-stage כדי לשמור על הכיסוי בניצב למטרה במהלך ההדמיה.

לאחר מכן, דחוף את המחוון על ה-tagמתאם בחוזקה כנגד הצינור כדי להחזיק את הצינור במקומו. באמצעות מטרה פי ארבעה תחת תאורת טרנס-שדה בהיר, התמקד בתקופת הרשת החרוטה מתחת לפרוסה. עבור סשן ההדמיה הראשוני, סרוק במהירות סביב הפרוסה כדי לאתר ולתעד את המספר עבור האזורים השונים שבהם רצויה הדמיה בהגדלה גבוהה יותר.

לאחר זיהוי אזורי העניין, העבר את השלב לריבוע הרשת הראשון המכיל אזור עניין. לאחר מכן עבור ליעד שגיאת 20 חוזק ואתר סימן נאמן. לאחר מכן עבור למטרה בעלת הספק גבוה יותר, מקם את אותו סימן נאמנות ורשום את מיקום x ו-y של השלב.

הזז את הבמה כדי למצוא את תחומי העניין האחרים בקרבת מקום ורשום את הקיזוזים x ו-y שלהם מסימן הנאמנות. מיקומי ההיסט מאפשרים זיהוי עקבי של אותו מיקום החלקה של הכיסוי בעת הדמיית הפרוסה, למרות שההגדרה המקורית x, y של הסימן הנאמנות משתנה כאשר הצינור או ה-tagמתאם מוסרים ומוחלפים. צלם מקל Z תמונה בתוך כל שדה שנבחר באמצעות בקרת המטרה של המיקרוסקופ או בקרת שלב Piezo אם זמין.

באמצעות צבע חיוני עצבי, ערימת התמונות הקונפוקלית המוצגת כאן, מדגישה את הארכיטקטורה התלת-ממדית של הנויריטים ושל גוף התא, אך הכתם אינו נכלל בגרעין. כדי לבחון שינויים תלויי זמן במורפולוגיה של פרוסות גדילה וכדאיות בתוך פרוסות במהלך תרבית ארוכת טווח, אותה פרוסה סומנה בצבע חיוני עצבי פלואורסצנטי פעם בשבוע, 24 שעות לפני ההדמיה. כדי להדגים את יכולת השחזור של הדמיית תאים זהים לאורך זמן, אותו שדה של פרוסה המסומנת בצבע חיוני עצבי ביום ה-13, צולם בימים 14, 15, 16 ו-17.

מיקומם של שלושה תאים בכל יום מוצג על ידי סמל מעל הגרעין. בנוסף לצבע החיוני העצבי, ניתן להשתמש בחלבונים פלואורסצנטיים בתיווך ויראלי עם מערכת זו כדי לתייג תאים. כאן ניתן לזהות בבירור גם מדווח רגיש לסידן וגם מוטות המכילים קופילין 10 ימים לאחר ההדבקה.

יישום מוצלח של הליך זה דורש הכנה מראש של כל הצינורות, הכיסויים והפתרונות. היכולת להשיג פרוסות במרווח קצר לאחר המוות היא גם חיונית להצלחה ודורשת תרגול רב. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך כ-90 דקות כדי להשיג 12-18 פרוסות היפוקמפוס מגור עכבר, כולל זמנים לדיסקציה וציפוי.

בעקבות הליך זה, פרוסות מוח יכולות להיות נגועות בזמנים שונים בנגיפים להשגת ביטוי ספציפי לסוג התא של חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים או שקט לביטוי גנים עם RNA מפריע קטן או RNA סיכת ראש קצרה כדי לחקור את תפקוד הגנים. אל תשכח שעבודה עם וירוסים רקומביננטיים עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מגן עיניים בעת עבודה עם ריאגנטים אלה.