מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ההשפעה של כימיקלים, כגון מעכב הטופואיזומראז אטופוסיד, על הצמיחה והרבייה של חיית המודל Caenorhabditis elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטוקסיקולוגיה, כגון הערכה טוקסיקולוגית לפיתוח תרופות והערכת סיכונים של רעלים סביבתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבדוק את רעילותם של כימיקלים שונים במערכות שאינן יונקים, ולכן טכניקה זו נוחה וחסכונית.

מי שתדגים את ההליך תהיה סו יאנג לי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו שני בקבוקי זכוכית נקיים של 200 מיליליטר על ידי הוספת 0.6 גרם נתרן כלורי, 0.5 גרם פפטון, 3.4 גרם אגר, 195 מיליליטר מים מזוקקים ומערבל מגנטי לבקבוק אחד. לאחר מכן הוסיפו מערבל מגנטי לבקבוק הריק השני.

חיטוי הבקבוקים למשך 15 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קררו את הבקבוקים באמבט מים למשך 30 דקות בחום של 55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לבקבוק המלא, הוסיפו 0.2 מיליליטר של סידן כלורי מולארי אחד, 0.2 מיליליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר כולסטרול, 0.2 מיליליטר של מגנזיום סולפט מולארי אחד וחמישה מיליליטר של אשלגן פוספט מולארי אחד. לאחר מכן מערבבים את התמיסה על ידי ערבוב מגנטי על פלטה חמה בחום של 55 מעלות צלזיוס.

יוצקים מחצית ממדיום ה-NGM המעורב לבקבוק הריק של 200 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של DMSO לבקבוק אחד, והשתמשו בערבוב מגנטי כדי לערבב אותו שוב. אחסן את הבקבוק השני באמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן קחו שלושה מיליליטר של צלחות פטרי בינוניות עד 35 על 10 מילימטר המכילות DMSO. הוציאו את הבקבוק השני מאמבט המים, והשתמשו בערבוב מגנטי כדי לערבב אותו. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של אטופוסיד 75 מילי-מולארי.

ולאחר ערבוב שוב, חזור על הליך הציטוט. קררו את צלחות ה-NGM המכילות כימיקלים על ידי השארתן בטמפרטורת החדר למשך כשלוש שעות, ואחסנו אותן בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצורך הבדיקה הכימית, מורחים 100 מיקרוליטר של E.coli OP50 מומת חום על כל צלחת NGM.

הניחו לצלחות להתייבש למשך הלילה בחממת C.elegans בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. העבירו את ביצי C.elegans המסונכרנות עם הגיל לצלחת NGM בתוספת 1% DMSO או 750 מיקרו-מולרי אטופוסיד. מניחים את ה-C.elegans באינקובטור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים.

התבונן וצלם תמונות מיקרוסקופיות של C.elegans תחת מיקרוסקופ סטריאו מדי יום. כמו כן, צלם תמונה מיקרוסקופית של מיקרומטר שלב המיקרוסקופ לכיול גודל התולעת. כדי למדוד את אורך הגוף של C.elegans שטופלו ב-DMSO או etoposide בכל נקודת זמן, ב-ImageJ, פתח את תמונת המיקרומטר של שלב המיקרוסקופ.

לאחר מכן, בעזרת הכלי קו ישר, גרור קו של 1,000 מיקרומטר על התמונה. לחץ על נתח ולאחר מכן הגדר קנה מידה, והזן 1, 000 ומיקרומטר בתיבה מרחק ידוע ובתיבה יחידת אורך, בהתאמה. לאחר מכן סמן גלובלי ולחץ על אישור. פתח את תמונות התולעת באמצעות קובץ ולאחר מכן פתח.

לאחר מכן, בעזרת הכלי Freehand Line, צייר קו לאורך התכונה של כל תולעת. השג את נתוני אורך הגוף על-ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן על מדידה. חזור על שלבים אלה עבור 50 תולעים.

דגרו את הביצים המסונכרנות לפי גיל על צלחת NGM המכילה DMSO או אטופוסיד בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 64 שעות עד לשלב הבוגר הצעיר. העבירו חמש תולעים בוגרות לצלחות NGM חדשות ללא כימיקלים או לוחות NGM חדשים המכילות את אותו טיפול כימי מקדים, ודגרו עליהן למשך 24 שעות. העבירו את הבוגרים לצלחות NGM חדשות, כפי שהודגם זה עתה, וספרו את מספר הביצים בכל יום.

בנוסף, ספרו את התולעים שזחלו, מתו או בקעו פנימית. בצע חישובים על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, הטיפול באטופוזיד לאחר 24 עד 96 שעות עיכב משמעותית את הצמיחה של C.elegans.

לאחר 96 שעות של דגירה, תולעים שטופלו באטופוזיד גדלו לאורך גוף של 0.86 מילימטרים, בעוד שהתולעים שטופלו ברכב גדלו ל-1.04 מילימטרים. עיכוב גדילה נצפה גם תחת תצפית מיקרוסקופ סטריאו, כפי שניתן לראות בתמונות אלה של תולעים שטופלו באטופוזיד, בהשוואה לתולעים שטופלו בביקורת. לאחר 72 שעות של דגירה, נצפו ביצים מהתולעים שטופלו ברכב.

לעומת זאת, ביציות נצפו לאחר 96 שעות של טיפול באטופוזיד, מה שמעלה את האפשרות שטיפול באטופוזיד עיכב את זמן הלידה הראשון של C.Elegans. כפי שמתואר בגרפים אלה, ירידה במספר הביצים הכולל על ידי טיפול באטופוזיד נצפתה כאשר התולעים הבוגרות הצעירות תורבתו, בנוכחות או בהיעדר טיפול מתמשך באטופוזיד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך רעילות כימית ב- C.elegans, נמטודה מודל.