מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה
November 9th, 2017
פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת מטרות ציטוקינים מרובות בו זמנית בסופרנטנטים של תרביות רקמה שנאספו מטחול עכבר מגורה באמצעות בדיקה אימונולוגית מבוססת חרוזים מרובים וציטומטר זרימה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון, מהם פרופילי הציטוקינים הייחודיים המתזמרים את התגובה החיסונית בהקשר של מצבי מחלה ספציפיים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע כימות בו זמנית של מספר טבעות באמצעות הרבה פחות נפחי דגימה מאשר פורמטים מסורתיים של ELISA ובמקביל הפחתת כריכה לא ספציפית.
מי שידגים את ההליך יהיה ניקולס ג'ונסן, עמית מחקר מצוות פיתוח המוצר שלנו. התחל הליך זה בהכנת דגימה ביולוגית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את החרוזים המשותקים של הנוגדנים המעורבבים מראש, סוניקציה של בקבוק החרוזים המעורבבים מראש למשך דקה אחת באמבט סוניקטור בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן מערבולת למשך 30 שניות לפני השימוש. אם אין אמבט סוניקטור זמין, הגדל את זמן המערבולת לדקה אחת. להכנה סטנדרטית, הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר בדיקה כדי להרכיב מחדש את קוקטייל Mouse Th Cytokine Standard הליופילי.
מערבבים על ידי מערבולת קצרה, ומניחים לבקבוקון לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. העבירו את הקוקטייל הסטנדרטי לצינור מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן שכותרתו C7. זה ישמש כסטנדרט העליון. סמן שישה צינורות מיקרו-צנטריפוגות מפוליפרופילן כ-C1 עד C6. הוסף 75 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל אחד מהצינורות הללו.
לאחר מכן, העבירו 25 מיקרוליטר מהסטנדרט העליון, C7, לצינור C6, וערבבו היטב על ידי מערבולת. זה יהיה תקן C6. המשך לבצע דילול סדרתי אחד עד ארבעה, על ידי שימוש בקצה פיפטה חדש לכל צינור כדי להוסיף 25 מיקרוליטר מהתקן הקודם ל-75 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה בצינור הסטנדרטי הנמוך הבא.
עקוב אחר כל הוספה על ידי מערבולת. השתמש במאגר הבדיקה כתקן אפס פיקוגרמים למיליליטר. כדי לבצע את הבדיקה, אפשר לכל הריאגנטים להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
לוחות סינון פוליפרופילן משמשים בהדגמה זו. חיוני לחלוטין שהצלחת תישמר זקופה במהלך כל הליך הבדיקה, כולל שלבי הכביסה, כדי למנוע אובדן החרוזים. הרטיבו מראש את נייר הסינון על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X לכל באר, ותנו לצלחות לשבת דקה אחת בטמפרטורת החדר.
הסר את נפח המאגר באמצעות סעפת הוואקום. כתם את מאגר הכביסה העודף מתחתית הצלחת על ידי לחיצה על הצלחת על ערימת מגבות נייר נקיות. לאחר מכן, הנח את הצלחת על גבי מכסה הצלחת ההפוך.
עבור דגימות סופרנטנט של תרבית תאים, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל הבארות. הוסף 25 מיקרוליטר מכל תקן לבארות הסטנדרטיות. לבסוף, הוסף 25 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות הדגימה.
מערבולת את החרוזים המעורבים למשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר מהחרוזים המעורבים לכל באר, ונערו את בקבוק החרוזים לסירוגין כדי למנוע שקיעת חרוזים. אוטמים את הצלחת בעזרת אוטם צלחות.
לאחר האיטום, עטפו את כל הצלחת, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, בנייר אלומיניום. מניחים את הצלחת על שייקר צלחת, מהדקים אותה ומנערים בחום של כ-500 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מבלי להפוך, הנח את הצלחת על סעפת הוואקום והחל את הוואקום כמו קודם.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X לכל באר. הסר את תכולת בארות לוחית הבדיקה על ידי סינון ואקום. כתם את מאגר הכביסה העודף מתחתית הצלחת בעזרת כרית סופגת או מגבות נייר לפני שתחזור על שלב זה פעם נוספת.
לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של נוגדנים לזיהוי לכל באר. לאחר איטום הצלחת עם אוטם צלחות טרי, עטפו את כל הצלחת, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, בנייר אלומיניום. מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים בחום של כ-500 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר.
מבלי לשאוב אבק, הוסף 25 מיקרוליטר של מגיב סטרפטווידין פיקואריתרין ישירות לכל באר. אוטמים ועוטפים את הצלחת כמו קודם. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על שייקר צלחת ונערו בחום של כ-500 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר חזרה על שלב סינון הוואקום פעמיים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X לכל באר. השעו מחדש את החרוזים על שייקר צלחת למשך דקה אחת. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו את הדגימות מלוח המסנן לצינורות FACS על מנת לקרוא את הדגימות על ציטומטר זרימה.
הפעל את ציטומטר הזרימה ותוכנת הרכישה בהתאם להוראות היצרן המצורפות למכשיר. צור תרשים נקודות עם פיזור קדימה על ציר ה-X ופיזור צדדי עבור ציר ה-Y. הגדר את הפיזור קדימה ופיזור הצד למצב ליניארי.
מערבולת את בקבוקון החרוזים הגולמיים הכלולים בערכה למשך 30 שניות כדי לתלות מחדש את החרוזים. העבירו 400 מיקרוליטר מהחרוזים הגולמיים לצינור FACS חדש. הגדר את קצב הזרימה של ציטומטר הזרימה לנמוך.
הפעל את החרוזים הגולמיים, התאם בזהירות את הרווח והמתח לפיזור קדימה ופיזור צדדי כך ששתי אוכלוסיות הגודל של חרוזים אלה מופרדות באופן גלוי וקל לשער. התאם את סף הפיזור קדימה כדי לא לכלול אירועים לא רצויים. בתרשים פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי, צייר שער הכולל את כל אוכלוסיות החרוזים.
הצג את אוכלוסיות החרוזים המגודרות מתרשים הפיזור קדימה לעומת פיזור הצד בתרשים הנקודה השנייה עם PE על ציר ה-X ו-APC עבור ציר ה-Y. כוונן את מתח ה-PMT עבור ערוץ הקרינה של APC כך שלאות ה-APC עבור כל אוכלוסיות החרוזים תהיה עוצמת פלואורסצנטיות חציונית, או MFI, שנמצאת בין 10 ל-5,000. לאחר מכן, מערבול את הבקבוקון של חרוזי הגדרת PE למשך 30 שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים.
העבירו 400 מיקרוליטר של חרוזי ה-PE התלויים מחדש לצינור FACS חדש. החלף את צינור החרוזים הגולמיים בציטומטר הזרימה בצינור חרוזי PE. כוונן את צינור מכפיל הפוטוtage עבור הגדרת ערוץ הקרינה PE כך שה-MFI של חרוזי PE ייפול בין הטווח הספציפי למגרש שנמצא בבקבוקון חרוזי PE.
כדי לבצע איסוף נתונים, הגדר את מספר אירועי החרוזים שיירכשו לכ-300 לכל אנוליט. מערבולת כל דגימה במשך חמש שניות לפני הניתוח. לאחר מכן, קרא את הדגימות.
בעת קריאת הדגימות, הגדר תחילה את ציטומטר הזרימה למצב הגדרה, והמתן עד שאוכלוסיית החרוזים תתייצב לפני המעבר למצב רכישה. ייצא רק את האירועים המגודרים ולא את סך האירועים לפני ביצוע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עקומות סטנדרטיות מייצגות עבור אנוליטים מטרה נוצרו באמצעות לוח הציטוקינים T Helper של העכבר.
בדיקות המנוהלות כהלכה ידגימו עקומות עם טווחים דינמיים רחבים כפי שמוצג כאן. יש להפעיל עקומות סטנדרטיות בכל פעם שהבדיקה מתבצעת. טחול עכבר תורבת בתנאים שונים במשך 48 שעות.
סופרנטנטים תרבית נאספו, ולאחר מכן ריכוזים של 13 מטרות כומתו באמצעות פאנל ציטוקינים T מסייע לעכבר. פרופילי ביטוי ציטוקינים דיפרנציאליים, בתגובה לתנאי גירוי, נראים בבירור. לאחר השליטה, ניתן להשלים את עבודת המעבדה של טכניקה זו תוך פחות מחמש וחצי שעות אם מבוצעת כראוי.
זמני רכישת הנתונים והניתוח במורד הזרם ישתנו בהתאם למספר הדגימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בפרוטוקול זה, לכמת את ריכוזי האנוליטים בדגימות ביולוגיות באמצעות בדיקה חיסונית ציטומטרית מבוססת חרוזים. זה כולל הכנת ריאגנטים, שלבי דגירה והגדרת ציטומטר זרימה לרכישת נתונים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות מטרות ציטוקינים מרובות בו זמנית בתרכובות תרבות רקמות מספרוניטי טחול עכברים מגורים באמצעות בדיקת אימונואסיי רב-מוקדית מבוססת חרוזים וציטומטריה של זרימה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של פרופילי ציטוקינים ייחודיים שהם חיוניים להבנת תגובות חיסוניות בהקשרים מחלתיים שונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- פרופילי ציטוקינים
- ציטומטריה של זרימה
רקע
- לציטוקינים יש תפקיד חיוני בתגובה החיסונית.
- שיטות ELISA מסורתיות דורשות נפחי דגימה גדולים יותר ועשויות להוביל לקישור לא ספציפי.
- בדיקות רב-מוקדיות מאפשרות מדידה בו זמנית של מטרות מרובות.
- שיטה זו משפרת את היעילות ומפחיתה פסולת דגימה.
מטרת המחקר
- כימות מספר ציטוקינים בבדיקה יחידה.
- זיהוי פרופילי ציטוקינים הקשורים לתגובות חיסוניות ספציפיות.
- שיפור הדיוק והיעילות של מדידת ציטוקינים.
שיטות ששימשו
- הכנת חרוזים ממוינים בנוגדן ותקנים.
- שימוש בצלחות פילטר פוליפרופילן לביצוע הבדיקה.
- ציטומטריה של זרימה לאיסוף ניתוח נתונים.
- דילולים סדרתיים להכנת תקנים להבטחת דיוק.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של מספר ציטוקינים מספרוניטי טחול עכברים.
- הוכחה של דרישות נפח דגימה נמוכות יותר בהשוואה ל-ELISA.
- מתן פרופילי ציטוקינים ברורים לתגובות חיסוניות מגורות.
- אימות יעילות השיטה באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה.
מסקנות
- הבדיקת אימונואסיי הרב-מוקדית מבוססת חרוזים היא שיטה אמינה לכימות ציטוקינים.
- גישה זו יכולה להקל על מחקר בתחום האימונולוגיה ותחומים קשורים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול לימוד פרופילי ציטוקינים במצבי מחלה שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Multiplex bead-based immunoassays enable simultaneous quantification of multiple cytokines from minimal sample volumes, supporting high-content immune profiling in early discovery. This platform enhances predictive confidence in immune pathway interrogation and accelerates target validation for immunology-focused portfolios. The approach reduces sample consumption and increases throughput, directly impacting decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cytokine profiling to clarify immune pathway activation under diverse stimulatory conditions.
- Supports functional target validation by quantifying multiple immune mediators in parallel.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing differential cytokine signatures linked to disease-relevant immune responses.
- Improves predictive confidence for advancing immunomodulatory targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed assay systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible cytokine measurements essential for assay standardization.
- Enables high-throughput screening readiness with reduced sample input requirements.
- Supports platform reuse across multiple immune targets and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cytokine profiling outputs with disease-relevant immune biomarkers for translational continuity.
- Provides data continuity from in vitro discovery through preclinical immune response validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cytokine signatures to functional immune outcomes.
- Enhances predictive de-risking for immunology-focused therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex immunoassay platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical immune response validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven triage.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification via simultaneous cytokine quantification.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for reliable compound evaluation and assay scalability.
- Analytics: Generates multiplexed readouts and standard curves for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse immune profiling applications across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable multiplexed assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing sample and reagent use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, gating, and data analysis.
- Needs access to flow cytometers and compatible analytical software for multiplex bead detection.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay setup and data interpretation.
- Adaptable to various immune cell models and stimulation conditions with appropriate validation.
- Dependent on consistent standard curve generation and careful sample handling to ensure data quality.
